Quantificação de Parâmetros Vasculares em Retinas inteiras de Camundongos com Retinopatias Não Proliferativas e Proliferativas

Resumo

Este artigo descreve um ensaio bem estabelecido e reprodutível de manchas de lectina para toda a preparação da retina do montagem e os protocolos necessários para a medição quantitativa dos parâmetros vasculares frequentemente alterados em retinopatias proliferativas e não proliferativas.

Resumo

Retinopatias são um grupo heterogêneo de doenças que afetam o tecido neurossensorial do olho. Caracterizam-se pela neurodegeneração, gliose e uma mudança progressiva na função e estrutura vascular. Embora o início das retinopatias seja caracterizado por distúrbios sutis na percepção visual, as modificações no plexo vascular são os primeiros sinais detectados pelos médicos. A ausência ou presença de neovascularização determina se a retinopatia é classificada como não proliferativa (NPDR) ou proliferativa (PDR). Nesse sentido, vários modelos animais tentaram imitar características vasculares específicas de cada estágio para determinar os mecanismos subjacentes envolvidos em alterações de endotélio, morte neuronal e outros eventos que ocorrem na retina. Neste artigo, forneceremos uma descrição completa dos procedimentos necessários para a medição dos parâmetros vasculares da retina em adultos e camundongos de nascimento precoce no dia do pós-natal (P)17. Detalharemos os protocolos para a realização de coloração vascular de retina com Isolectina GSA-IB4 em montagens inteiras para visualização microscópica posterior. As principais etapas para o processamento de imagens com o software Image J Fiji também são fornecidas, portanto, os leitores poderão medir a densidade, diâmetro e tortuosidade do vaso, ramificações vasculares, bem como áreas avasculares e neovasculares. Essas ferramentas são altamente úteis para avaliar e quantificar alterações vasculares em retinopatias não proliferativas e proliferativas.

Introdução

Os olhos são nutridos por dois sistemas arterio-venosos: a vasculatura choroidal, uma rede vascular externa que irriga epitélio pigmentado da retina e fotorreceptores; e a vasculatura neuro-retina que irrigam a camada de células gânglios e a camada nuclear interna da ^retina1. A vasculatura da retina é uma rede organizada de vasos que fornecem nutrientes e oxigênio para as células da retina e colhem resíduos para garantir a transdução adequada da sinalização visual. Esta vasculatura tem algumas características distintas, incluindo: a falta de inervação autônoma, a regulação do tom vascular por mecanismos intrínsecos de retina e a posse de

Protocolo

Os camundongos C57BL/6J foram manuseados de acordo com as diretrizes da Declaração ARVO para o Uso de Animais em Pesquisa Oftalmômica e De Visão. Os procedimentos experimentais foram desenhados e aprovados pelo Comitê Institucional de Atenção e Uso de Animais (CICUAL) da Faculdade de Ciências Químicas da Universidade Nacional de Córdoba (Res. HCD 1216/18).

1. Preparação de soluções tampão e reagentes

1. Preparação de 1x salina tampão fosfato (PBS): Adicionar 8 g de cloreto de sódio (NaCl), 0,2 g de cloreto de potássio (KCl), 14,4 g de dissódio-hidrogênio-1 dihidrato fosfato (_{Na2HPO4 2H2O}

Resultados

Como descrito na seção de protocolo, a partir de um único ensaio de coloração fluorescente você pode obter a morfologia vascular e avaliar vários parâmetros de interesse quantitativamente. A busca de uma alteração específica dependerá do tipo de retinopatia estudada. Neste artigo, áreas avasculares e neovasculares, tortuosidade e dilatação foram avaliadas em um modelo de rato de retinopatia proliferativa, enquanto o ramificação vascular e a densidade foram analisados em um modelo de camundongos MetS, o que induz uma reti.......

Discussão

Modelos animais de retinopatias são ferramentas poderosas para estudar o desenvolvimento vascular, remodelação ou angiogênese patológica. O sucesso desses estudos no campo conta com o fácil acesso ao tecido que permite realizar uma ampla variedade de técnicas, fornecendo dados de camundongos in vivo e pós-morte26,27. Além disso, grande correlação tem sido encontrada entre estudos in vivo e análises clínicas, proporcionando sólida rastre.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Albumina de soro bovino
cálcio di-hidratado	Merck	C3306
Ácido clorídrico	Biopack	9632.08
Microscópio confocal FV1200	Olympus	FV1200	com placa motorizada
Cobre	Paul Marienfeld GmnH & Co.	111520
	NIKON	SMZ645
Dissódico-hidrogênio-fosfato di-hidratado	Merck	119753
200 µ L  tubo	Merck	Z316121
Papel de filtro	Merck	WHA5201090
agitador de incubadora GyroMini	LabNet International	S0500
Isolectina GS-IB4 De Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugado	Invitrogen	I21411
Poli (álcool vinílico) (Mowiol 4-88)	Merck	475904
Paraformaldeído	Merck	158127
pHmeter	SANXIN	PHS-3D-03
Cloreto de potássio	Merck	P9541
Fosfato de di-hidrogênio de potássio	Merck	1,04,873
Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Cloreto de sódio	Merck	S3014
Sódio hidróxido	Merck	S5881
Tris	Merck	GE17-1321-01
Triton X-100	Merck	X100-1GA
Análise de Vasos Fiji software	Mai Elfarnawany		https://imagej.net/Vessel_Analysis

de folha de alumínio Merck A4503 cloreto de Microscópio de Dissecação