Apresentamos um método para isolar células e núcleos endoteliais do lúmen de artérias carótidas de camundongos expostas a condições de fluxo estáveis ou perturbadas para a realização de experimentos ômicos unicelulares.
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Artigo de método
Isolamento de células endoteliais do lúmen de artérias carótidas de camundongos para experimentos multi-ômicos unicelulares
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Neste artigo
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Resumo
Resumo
A aterosclerose é uma doença inflamatória das regiões arteriais expostas ao fluxo sanguíneo perturbado (fluxo d). O fluxo D regula a expressão de genes no endotélio nos níveis transcriptômico e epigenômico, resultando em respostas proaterogênicas. Recentemente, estudos de sequenciamento de RNA de célula única (scRNAseq) e ensaio de célula única para sequenciamento de cromatina acessível à transposase (scATACseq) foram realizados para determinar as alterações de acessibilidade transcriptômica e cromatina em uma resolução de célula única usando o modelo de ligadura parcial de carótida (PCL) de camundongo. Como as células endoteliais (CE) representam uma fração menor das populações celulares totais na parede da artéria, um método de digestão luminal foi usado para obter preparações unicelulares enriquecidas com CE. Para este estudo, camundongos foram submetidos à cirurgia de LCP para induzir o fluxo d na artéria carótida esquerda (ACV) enquanto usavam a artéria carótida direita (ACR) como controle. As artérias carótidas foram dissecadas dois dias ou duas semanas após a cirurgia de LCP. O lúmen de cada carótida foi submetido à digestão da colagenase, e células únicas enriquecidas com endotelial ou núcleos únicos foram obtidos. Essas preparações de célula única e núcleos únicos foram subsequentemente codificadas usando uma configuração microfluídica de 10x Genomics. As células únicas e os núcleos únicos com código de barras foram então utilizados para preparação de RNA, geração de biblioteca e sequenciamento em um sequenciador de DNA de alto rendimento. Após o processamento bioinformático, os conjuntos de dados scRNAseq e scATACseq identificaram vários tipos de células da digestão luminal, consistindo principalmente de CEs. Células musculares lisas, fibroblastos e células imunes também estavam presentes. Este método de enriquecimento CE ajudou a entender o efeito do fluxo sanguíneo no endotélio, o que poderia ter sido difícil com o método de digestão total da artéria. O método de preparação de célula única enriquecido com CE pode ser usado para realizar estudos de ômica de célula única em camundongos knockouts e transgênicos em que o efeito do fluxo sanguíneo sobre esses genes não foi estudado. É importante ressaltar que essa técnica pode ser adaptada para isolar células únicas enriquecidas com CE de explantes de artérias humanas para realizar estudos mecanicistas semelhantes.
Introdução
Este laboratório demonstrou anteriormente que a indução do fluxo d leva ao desenvolvimento rápido e robusto de aterosclerose em camundongos hiperlipidêmicos 1,2. O novo modelo de aterosclerose induzida por fluxo d em camundongos foi possível usando a cirurgia de ligadura parcial da carótida (LCP) 3. A cirurgia de LCP induz a condição de fluxo sanguíneo baixo e oscilatório ou fluxo d na artéria carótida esquerda ligada (ACV). Em contraste, a artéria carótida direita (ACR) contralateral continua a enfrentar fluxo laminar estável (s-flow). Anteriormente,....
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Protocolo
Todos os procedimentos animais descritos abaixo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Emory. Camundongos C57BL/6 não hipercolesterolêmicos, pareados por idade e sexo foram usados para mitigar a variação dependente do sexo e compensar qualquer complicação de condições hipercolesterolêmicas.
1. Cirurgia de ligadura parcial da carótida (LCP)
NOTA: A ligadura parcial da artéria carótida da ACL foi realizada conforme descrito e demonstrado anteriormente3.
- Anestesiar o camundongo por inalação de isoflurano (5% de isofluorano em oxigên....
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Resultados
Cirurgias de ligadura parcial da carótida foram realizadas em 44 camundongos, e o início do fluxo d na ACV foi validado pela realização de ultrassonografia um dia após a cirurgia de ligadura parcial. A cirurgia de ligadura parcial bem-sucedida causa redução da velocidade do fluxo sanguíneo e reverte o fluxo sanguíneo (fluxo perturbado) na ACV3. As artérias carótidas foram dissecadas aos dois dias ou duas semanas após a ligadura. O lúmen de cada carótida foi submetido à digestão da colagen.......
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Discussão
Este artigo fornece um protocolo detalhado para isolar preparações unicelulares das artérias carótidas de camundongos. A influência do fluxo d nas células endoteliais pode ser estudada com precisão se a cirurgia de LCP for realizada corretamente. É crucial identificar corretamente os ramos da carótida comum, como a carótida externa, a carótida interna, a artéria occipital e a artéria tireoidiana superior. A validação dos padrões de fluxo por ultrassonografia valida ainda mais o início bem-sucedido das condiç.......
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Divulgações
HJ é o fundador da FloKines Pharma. Outros autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo financiamento dos subsídios dos Institutos Nacionais de Saúde HL119798, HL095070 e HL139757 para HJ. HJ também é apoiado pelo Wallace H. Coulter Distinguished Faculty Chair Professorship. Os serviços prestados pelo Emory Integrated Genomics Core (EIGC) foram subsidiados pela Escola de Medicina da Universidade de Emory e também foram parcialmente apoiados pela Georgia Clinical and Translational Science Alliance dos Institutos Nacionais de Saúde sob o número de prêmio. UL1TR002378. O conteúdo fornecido acima é de responsabilidade exclusiva dos autores e não reflete as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
| 1x PBS (Cell Culture Grade) | Corning | 21040CMX12 | |
| 1.5 mL Protein LoBind Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 022-43-108-1 | |
| 15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile | Fablab | FL4022 | |
| 50 mL SuperClear Centrifuge Tubes | Labcon | 3191-335-028 | |
| 6-0 Sutura de Seda Estéril | Covidien | s-1172 c2 | |
| 70 µ m Filtro de células, branco, estéril, embalado individualmente | Thermo Fisher Scientic | 08-771-2 | |
| Solução de accutase, | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | estéril ou |
| tampão ATAC equivalente (Componente I da mistura de transposição) | 10x Genômica | 2000122 | |
| Enzima ATAC (Componente II da mistura de transposição) | 10x Genômica | 2000123/ 2000138 | |
| Albumina de soro bovino | Sigma-Aldrich | A7906-500G | |
| Buprenorfina | Med-Vet International | RXBUPRENOR5-V | |
| Controlador de cromo & Próximo Kit de Acessórios GEM | 10X Genômica | 1000204 | |
| Cromo Próximo GEM Kits de Reagentes de Célula Única 3' v3.1 | 10X Genômica | 1000121 | |
| Cromo Próximo GEM Kits de Reagentes ATAC de Célula Única v1.1 | 10X Genômica | 1000175 | |
| Colagenase II | MP Biomedicals | 2100502.5 | |
| Digitonina | Sigma-Aldrich | D141-100MG | |
| Pinça de Dissecação | Roboz Surgical Instruments Co | RS-5005 | |
| Dnase1 | New England Biolabs Inc | M0303S | |
| Centrifuge (Benchtop-Model # 5425) | Eppendorf | 22620444230VR | |
| Fetal Bovine Serum - Premium Select | R& D systems | S11550 | |
| Rotor de ângulo fixo | Eppendorf | FA-45-24-11-Kit Rotor | |
| HEPES tamponado com solução salina | Millipore Sigma | 51558 | |
| Seringa de insulina (seringa de 3/10 mL 29 G) | BD | 305932 | |
| Isoflurano | Patterson vet | 789 313 89 | |
| MACs Smart Strainers (30 µ m) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| MACS SmartStrainers (100 µ m) | Miltenyi Biotec | 130-098-463 | |
| Solução salina normal (cloreto de sódio a 0,9%) | Baxter International Inc | 2B1323 | |
| Tampão de núcleos (20x) | 10x Genomics | PN 2000153/2000207 | |
| PBS (10x), pH 7,4 | Tesoura pequena Thermo Fisher Scientic | 70011-044 | |
| Roboz Surgical Instruments Co | RS-5675 | ||
| Micro grampo de aço inoxidável que aplica o fórceps com fechamento | Instrumentos cirúrgicos Co. de Roboz | RS-5480 | ou similar |
| Tissue Mend II | Webster Veteinanry | 07-856-7946 | |
| Tipo II Collagenase | MP biomedicals | 2100502.1 | |
| Deposited Data | |||
| scATACseq Arquivos | FastQ NCBI | www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Adesão # PRJNA646233 | |
| arquivos scRNAseq FastQ | NCBI | www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Access: # PRJNA646233 | |
| Software e Algoritmos | |||
| Cell Ranger 3.1.0 | 10X Genomics | https://support.10xgenomics.com/ exp | |
| Cicero | Pliner et al., 2018 | https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/ | |
| Ggplot2 v3.2.1 | Hadley Wickham | https://cran.r-project.org | |
| Harmony | Korsunsky et al., 2019 | https://github.com/immunogenomics/harmony | |
| ImageJ | Schneider et al., 2012 | https://imagej.nih.gov | |
| Monocle 2.8.0 | Qiu et al., 2017 | https://github.com/cole-trapnell-lab/ versão | |
| R versão 3.6.2 | R Foundation | ||
| Seurat 3.1.3 | Stuart et al., 2019 | https://github.com/satijalab/seurat | |
| Signac 0.2.5 | Stuart et al., 2019 | https://github.com/timoast/signac |
Referências
- Kumar, S., Kang, D. W., Rezvan, A., Jo, H. Accelerated atherosclerosis development in C57Bl6 mice by overexpressing AAV-mediated PCSK9 and partial carotid ligation. Laboratory Investigation. 97 (8), 935-945 (2017).
- Nam, D., et al.
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Reimpressões e permissões
Errata
Formal Correction: Erratum: Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-cell Multi-omics Experiments
Posted by JoVE Editors on 6/22/2022. Citeable Link.
An erratum was issued for: Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-cell Multi-omics Experiments. The Authors section was updated.
The Authors section was updated from:
Sandeep Kumar*1
Aitor Andueza*1
Juyoung Kim1
Dong-Won Kang1
Hanjoong Jo1,2
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2Division of Cardiology, Georgia Institute of Technology and Emory University
* These authors contributed equally
to:
Sandeep Kumar*1
Aitor Andueza*1
Nicolas Villa-Roel1
Juyoung Kim1
Dong-Won Kang1
Hanjoong Jo1,2
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2Division of Cardiology, Georgia Institute of Technology and Emory University
* These authors contributed equally
