Summary
Vi presenterar en metod för cellinjektion via nålfri vattenskärningsteknik i kombination med en följd av undersökningar efter leverans när det gäller cellulär livskraft, proliferation och elasticitetsmätningar.
Abstract
Urininkontinens (UI) är ett mycket utbrett tillstånd som kännetecknas av brist på urinrörets sfinktermuskel. Regenerativ medicin grenar, särskilt cellterapi, är nya metoder för att förbättra och återställa urinrörets sfinkterfunktion. Även om injektion av aktiva funktionella celler rutinmässigt utförs i kliniska miljöer med nål och spruta, har dessa metoder betydande nackdelar och begränsningar. I detta sammanhang är nålfri vattenstråleteknik (WJ) en genomförbar och innovativ metod som kan injicera livskraftiga celler genom visuell guidad cystoskopi i urinrörets sfinkter. I den aktuella studien använde vi WJ för att leverera svin fettvävnadshärledda stromaceller (pADSC) i kadaverisk urinrörsvävnad och undersökte därefter effekten av WJ-leverans på cellutbyte och livskraft. Vi bedömde också de biomekaniska egenskaperna (dvs. elasticitet) genom atomkraftmikroskopi (AFM) mätningar. Vi visade att WJ-levererade pADSC reducerades signifikant i sin cellulära elasticitet. Lönsamheten var signifikant lägre jämfört med kontroller men är fortfarande över 80%.
Introduction
Urininkontinens (UI) är en utbredd sjukdom med en prevalens på 1,8 - 30,5% i europeiska populationer1 och kännetecknas främst av funktionsfel i urinrörets sfinkter. Ur ett kliniskt perspektiv erbjuds kirurgisk behandling ofta till patienter när konservativa terapier eller fysioterapi misslyckas med att ta itu med och lindra de framväxande symtomen.
Cellterapi för potentiell regenerativ reparation av sfinkterkomplexets funktionsfel har uppstått som ett avantgarde-tillvägagångssätt för behandling av UI-patologi 2,3. Dess huvudmål är att ersätta, reparera och återställa den skadade vävnadens biologiska funktionalitet. I djurmodeller för UI har stamcellstransplantation visat lovande resultat i urodynamiska resultat 2,4,5. Stamceller uppstår som optimala cellulära kandidater eftersom de har förmågan att genomgå självförnyelse och multipotent differentiering, vilket hjälper den drabbade vävnadsregenereringen6. Trots den kommande regenerativa potentialen förblir den praktiska användningen av cellterapi hindrad eftersom minimalt invasiv leverans av celler fortfarande står inför flera utmaningar när det gäller injektionsprecision och täckning av målet. Även om det nuvarande tillvägagångssättet som används för cellleverans är injektion genom ett nålsprutasystem7, resulterar det vanligtvis i ett totalt underskott av livskraftiga celler, med rapporterade livskrafter så låga som 1% - 31% efter transplantation8. Dessutom har cellleverans via nålinjektion också visat sig påverka placeringen, retentionshastigheten samt fördelningen av transplanterade celler i den riktade vävnaden 9,10,11. Ett genomförbart, nytt tillvägagångssätt som övervinner ovannämnda begränsning är den nålfria cellleveransen via vattenstråleteknik.
Vattenstråleteknik (WJ) växer fram som ett nytt tillvägagångssätt som möjliggör hög genomströmningsleverans av celler genom cystoskop under visuell kontroll i urinrörets sfinkter 12,13. WJ möjliggör cellleverans vid olika tryck (E = effekter i bar) som sträcker sig från E5 till E8013. I den första fasen appliceras (vävnadspenetrationsfasen) isotonisk lösning med högt tryck (dvs. E60 eller E80) för att lossa den extracellulära matrisen som omger den vävnad som är riktad och öppna små sammankopplade mikro-lacunae. I den andra fasen (injektionsfasen) sänks trycket inom millisekunder (dvs upp till E10) för att försiktigt leverera cellerna till den riktade vävnaden. Efter denna tvåstegsapplikation utsätts cellerna inte för ytterligare tryck mot vävnaden när de matas ut utan flyter i en lågtrycksström till ett vätskefyllt kavernöst område13. I en ex vivo-modellinställning där stamceller injicerades via WJ i kadaverisk urinrörsvävnad kunde livskraftiga celler därefter aspireras och hämtas från vävnaden och expanderas ytterligare in vitro13. Även om en studie från 2020 av Weber et al. visade genomförbarheten och tillämpligheten av WJ för att leverera fotavtrycksfria kardiomyocyter i myokardiet14, måste man komma ihåg att WJ-tekniken fortfarande är i ett prototypstadium.
Följande protokoll beskriver hur man förbereder och märker svin fettvävnadshärledda stromaceller (pADSC) och hur man levererar dem till infångningsvätska och kadavervävnad via WJ-teknik och Williams cystoskopinålar (WN). Efter cellulär injektion bedöms den cellulära vitaliteten och elasticiteten via atomkraftsmikroskopi (AFM). Via steg-för-steg-instruktioner ger protokollet ett tydligt och kortfattat tillvägagångssätt för att skaffa tillförlitliga data. Diskussionsdelen presenterar och beskriver teknikens stora fördelar, begränsningar och framtidsperspektiv. WJ-leveransen av celler samt följderna efter översättningsanalyserna som rapporteras här ersätter standardnålinjektionen och ger en solid cellleveransram för regenerativ läkning av målvävnaden. I våra senaste studier gav vi bevis för att WJ levererade celler mer exakt och åtminstone vid jämförbar livskraft jämfört mednålinjektioner 15,16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fettvävnadsproverna från svin erhölls från Institutet för experimentell kirurgi vid universitetet i Tuebingen. Alla försök godkändes av lokala djurskyddsmyndigheter under djurförsöksnummer CU1/16.
1. Isolering av svin fettvävnadshärledda stromaceller
- Använd svin fettvävnad som levereras från Institute for Experimental Surgery i ett 50 ml centrifugrör till laboratoriet.
- Överför vävnaden till en steril petriskål under den sterila bänken och hacka den med två skalpeller (nr 10) till små fragment och mush.
OBS: Sax kan också användas för att få små fragment. Ju mindre fragmenten är, desto bättre för följande matsmältning.- Överför de små fragmenten/mushen till ett 50 ml centrifugrör och ruppa det med 5 ml homogenisatorlösning i 30 minuter vid 37 °C på en shaker. Homogenisatorlösningen är PBS med 1 % bovint serumalbumin (BSA) (stamlösning: 1 % (vikt/v) BSA i PBS) och 0,1 % kollagenas typ I.
OBS: Förbered alltid homogenisatorlösningen nyligen. Skakaren har en cirkulär skakningsrörelse med långsam hastighet 25-500 rpm.
- Överför de små fragmenten/mushen till ett 50 ml centrifugrör och ruppa det med 5 ml homogenisatorlösning i 30 minuter vid 37 °C på en shaker. Homogenisatorlösningen är PBS med 1 % bovint serumalbumin (BSA) (stamlösning: 1 % (vikt/v) BSA i PBS) och 0,1 % kollagenas typ I.
- För att stoppa inkubationen, tillsätt 10 ml tillväxtmedier [Dulbeccos Modified Eagle's Medium - låg glukos (DMEM-LG), 2,5% HEPES natriumsaltlösning (1 M), 10% fetalt bovint serum (FBS), 1% L-glutamin (200 mM), 1% Penicillin-Streptomycin (10000 U / ml Penicillin; 10 000 μg / ml Streptomycin) och 1% Amfotericin B (250 μg / ml)].
OBS: Tillväxtmedia kan förberedas i förväg. Antibiotika och svampdödande läkemedel är nödvändiga vid framställning av tillväxtmediet för cellodling för att skydda celler från föroreningar. - Inkubera centrifugrören i 10 minuter vid rumstemperatur.
- Aspirera fraktionen med adipocyter, som är lättare och därför simmar ovanpå vätskan, med en 10 ml pipett och kassera den.
- Filtrera den återstående stromafraktionen genom en 100 μm cellsikt med ett polyetentereftalatmembran (PET) fritt från tungmetaller för att hålla fettvävnadsfragment och för att endast hämta cellsuspensionen.
- Centrifugera den filtrerade cellsuspensionen i 7 min vid 630 x g vid rumstemperatur.
- Resuspend cellpelleten i 2 ml PBS för att tvätta cellerna en gång.
- Centrifugera cellsuspensionen igen i 7 min vid 630 x g vid rumstemperatur.
- Efter centrifugering och upprepad återupplivning av cellpelleten i 10 ml tillväxtmedier per kolv, fröceller i 75 cm2 cellodlingskolv.
OBS: Beroende på cellpellets storlek efter tvättsteget med PBS, fröceller i en till fyra kolvar.
2. Cellodling av svin fettvävnadshärledda stromaceller
- Skörda och passera celler när de når 70% sammanflöde.
- Tvätta celler med 10 ml PBS två gånger och aspirera PBS helt.
OBS: Detta steg är nödvändigt för att ta bort återstående tillväxtmedier, som kompletteras med 10% FBS. FBS har flera proteashämmare som kan hindra funktionen av följande trypsinisering. - Tillsätt 3 ml 0,05%-Trypsin-EDTA per kolv för att lossa cellerna.
- Inkubera kolvarna i 3 min vid 37 °C.
- Kontrollera under mikroskopet om cellerna är lossnade.
OBS: Ibland tar det lite mer tid att ta bort cellerna. Inkubera i detta fall kolvarna i högst 5 minuter vid 37 °C. - För att stoppa inkubations- och lossningsprocessen, tillsätt 3 ml tillväxtmedier.
OBS: Som nämnts ovan kompletteras tillväxtmedier med 10% FBS som innehåller proteashämmare. - Överför de fristående cellerna till ett centrifugeringsrör och centrifug i 7 minuter vid 630 x g vid rumstemperatur.
- Resuspend cellerna i 10 ml tillväxtmedier och räkna dem med en hemocytometer.
- Fröceller med en ympningsdensitet av 3 x 105 celler per 75 cm2 kolv.
3. Märkning av celler med kalcen-AM
OBS: Celler som injiceras i kadavervävnader färgas med en grön-fluorescerande membranpermeabel levande cellfläck och en rödfluorescerande membranogenomtränglig livskraftsindikator för att verifiera att extraherade celler är desamma som de injicerade cellerna och inte vävnadsfragment i urinröret.
- Tvätta celler två gånger med 10 ml PBS.
- Tillsätt 5 ml färglösning per 75 cm2 kolv. Färgämneslösningen består av tillväxtmedier med 2 μM av det grönfluorescerande membranpermeabla levande cellfärgämnet och 4 μM rödfluorescensmembranimpermeant livskraftsindikator.
- Inkubera i 30 min vid rumstemperatur i mörkret.
- Aspirera och kassera färglösningen.
- Tvätta cellerna igen två gånger med 10 ml PBS.
- Lägg till tillväxtmedier och dokumentera den gröna och röda fluorescenssignalen genom fluorescensmikroskopi.
- Placera 75 cm2-kolven på mikroskopbordet, använd 10x-målet, välj inget fluorescensfilter och se till att den överförda ljusvägen är aktiv.
OBS: Dessa steg utförs alla manuellt på mikroskopet. - Parallellt med steg 3.6.1 öppnar du programmet.
- Tryck på Live-knappen under fliken Locate för att få en levande bild av cellerna i kolven på bordet och fokusera på dem med de grova och finjusteringsenheterna.
OBS: Vid höger syn visas livebilden när Live-knappen är aktiverad. - På underfliken Mikroskopkomponenter väljer du rätt mål (10x).
- Använd en bock för Automatisk exponering på underfliken Kamera.
- Tryck på knappen Snap för att ta den första bilden med överfört ljus.
- Infoga skalningsfältet med hjälp av fliken Grafik i menyraden och välj Skalningsfält.
- Spara bilden med hjälp av fliken Filer i menyraden och välj Spara som czi.
- För fluorescensbilderna ändrar du filtret till det som är specifikt för grön eller röd fluorescens och väljer den reflekterade ljusvägen.
OBS: Dessa ändringar måste göras manuellt på mikroskopet. - Tryck igen på Live-knappen under fliken Hitta för att få en levande bild av cellerna.
- Tryck på knappen Snap för att ta den andra bilden med antingen grön eller röd fluorescens.
- Infoga skalningsfältet med hjälp av fliken Grafik i menyraden och välj Skalningsfält.
- Spara bilden med hjälp av fliken Filer i menyraden och välj Spara som czi.
- Upprepa steg 3.6.9 till 3.6.13 med den andra fluorescenskanalen.
- Placera 75 cm2-kolven på mikroskopbordet, använd 10x-målet, välj inget fluorescensfilter och se till att den överförda ljusvägen är aktiv.
4. Förbered urinrörsvävnadsprover för injektioner
- Dissekera urinröret och anslutningsblåsan ur grisen.
OBS: Urinrörsvävnadsprover från färska kadaverprover av vuxna kvinnliga lantrasgrisar användes för experimenten. - Transportera den till laboratoriet i påsar på våt is.
OBS: Proverna ska lämnas på is tills vidare bearbetning. Inga tillsatser tillsattes till proverna. - Placera urinröret med urinblåsan på en svamp, som efterliknar elasticiteten i nedre bäckenbotten.
- Använd urinblåsan för att bestämma urinrörets orientering (proximal, distal, dorsal och ventral). Detta är möjligt på grund av lokaliseringen av urinledarna och de tre ligamenten som fixerar blåsan i buk- och bäckenhålan. De tre ligamenten är de två vesicae lateralia ligamenten på blåsans sidor och vesicae medianum, som uppstår från blåsans ventrala yta (Figur 1).
- Skär upp urinröret i längdriktningen på ryggsidan med hjälp av en kateter.
- Injicera cellerna i det öppnade urinröret enligt beskrivningen i följande kapitel.
5. Injektioner av celler via en Williams-nål i vätskor och vävnadsprover
- Skörda celler enligt beskrivningen i steg 2.
- Till skillnad från steg 2.9, justera celldensiteten för injektioner till 2,4 x 106 celler per ml.
OBS: För injektioner i vävnadsprover märk cellerna med en grön fluorescerande membranpermeabel levande cell. - Aspirera cellsuspensionen med en spruta och applicera Williams cystoskopiska injektionsnål (WN) på den.
- Håll antingen nålen strax över 2 ml tillväxtmedier i ett 15 ml centrifugeringsrör eller sätt in nålen i den öppnade urinrörsvävnaden. I båda fallen injicera 250 μL celler manuellt.
OBS: Celler som injiceras i kadaveruretröret bildar en injektionskupol. - Samla celler som injiceras i media direkt genom centrifugering i 7 minuter vid 630 x g vid rumstemperatur.
- För celler som injiceras i kadaveruretröret, aspirera dem ur injektionskupolen med en 18G-nål applicerad på en spruta.
- Överför de injicerade och aspirerade cellerna till ett centrifugeringsrör och centrifug i 7 minuter vid 630 x g vid rumstemperatur jämförbart med cellerna som injiceras i media.
- Efter centrifugering, resuspendera cellerna i 4 ml tillväxtmedier i båda fallen.
- Bestäm cellutbyte och livskraft med hjälp av Trypan blå färgämne uteslutning med en hemocytometer.
- Blanda 20 μL cellsuspension noggrant med 20 μL trypanblått.
- Fyll 10 μL av denna blandning i varje kammare i hemocytometern.
OBS: Båda kamrarna fylls och räknas för att få statistisk optimering genom att fördubbla provtagningen. - Under ett mikroskop räknar du celler i alla fyra hörnrutorna.
OBS: Räkna celler som lyser i vitt (ofärgade) som livskraftiga celler medan celler som lyser blått (färgat) räknas som döda celler. - För att beräkna cellnumret per ml, beräkna medelvärdet av de två kamrarna, dela detta nummer med två och multiplicera det med 104.
6. Injektioner av celler via Vattenstråle i vätskor och vävnadsprover
- Skörda celler enligt beskrivningen i steg 2.
- Till skillnad från steg 2.9 och 5.2, justera celldensiteten för injektioner till 6 x 106 celler per ml.
OBS: För injektioner i vävnadsprover använd celler märkta med en grön fluorescerande membranpermeabel levande cell. - Fyll cellsuspensionen i WJ-enhetens doseringsenhet.
- Håll antingen injektionsmunstycket strax över 2 ml tillväxtmedier i ett 15 ml centrifugeringsrör eller strax ovanför den öppnade urinrörsvävnaden.
- I båda fallen injiceras 100 μL celler av anordningen med användning av ett högt tryck för vävnadspenetration följt av en lågtrycksfas för cellinjektioner. Använd tryckinställningarna E60-10.
OBS: Celler som injiceras i kadaveruretröret bildar en injektionskupol. - Samla celler som injiceras i media direkt genom centrifugering i 7 minuter vid 630 x g vid rumstemperatur.
- För celler som injiceras i kadaveruretröret, aspirera dem ur injektionskupolen med en 18G-nål applicerad på en spruta.
- Överför de injicerade och aspirerade cellerna till ett centrifugeringsrör och centrifug i 7 minuter vid 630 x g vid rumstemperatur jämförbart med cellerna som injiceras i media.
- Efter centrifugering, resuspend celler i 4 ml tillväxtmedier i båda fallen.
- Bestäm cellutbyte och livskraft med hjälp av trypanblå färgämnesuteslutning med en hemocytometer som beskrivs i detalj i 5.10.
7. Biomekanisk bedömning av cellulär elasticitet genom atomkraftsmikroskopi (AFM)
- Framställning av prover
OBS: De hämtade cellerna efter injektion är nu föremål för ytterligare analyser av AFM. Dessutom används celler som inte injicerades som kontroller.- Fröceller i vävnadsodlingsrätter med en densitet av 5 x 105 celler per maträtt.
OBS: Frö en vävnadsodlingsrätt per tillstånd. Villkoren är kontroller, ADSC injiceras av WJ eller WN i media och ADSC injiceras av WJ eller WN i kadavervävnad. - Inkubera celler i vävnadsodlingsfat i 3 timmar vid 37 °C.
OBS: För att undvika variationer på grund av celler i G1-fasen och under mitos utförde vi AFM-mätningar 3 timmar efter cellsädningssteget. - Strax före mätningen med AFM ersätts tillväxtmediet med 3 ml Leibovitz L-15-media utan L-glutamin.
- Placera vävnadsodlingsskålen i provhållaren på AFM-enheten och slå på petriskålsvärmaren inställd på 37 °C.
- Fröceller i vävnadsodlingsrätter med en densitet av 5 x 105 celler per maträtt.
- Förberedelse av AFM och utskjutande kalibrering
- Använd ett glasblock som är specificerat för mätningar i vätskor och justera det på AFM-hållaren.
OBS: Glasblockets övre yta måste vara rak och parallell med AFM-hållaren. - Placera försiktigt utskjutande på glasblockets yta. Spetsen A måste ligga över det polerade optiska planet.
OBS: Repa inte den polerade optiska ytan på glasblocket eftersom repor kan leda till störningar i mätningarna. Spetsen A måste sticka ut över det polerade optiska planet eftersom det annars inte är möjligt att reflektera AFM: s laser till fotodetektorn. - För att stabilisera utskjutande på glasblocket, lägg till en metallfjäder med hjälp av pincett.
- När utskjutande är fixerad på glasblocket placera blocket på AFM-huvudet och lås den integrerade låsmekanismen.
- Montera AFM-huvudet på AFM-enheten.
OBS: Fjädern måste vara vänd mot vänster sida för att placeras korrekt. Om så inte är fallet, korrigera glasblockets position och justera AFM-huvudet igen. - Initiera programvaruinställningen och öppna programvaran tillsammans med laserjusteringsfönstret och inställningarna för inflygningsparametern. Slå dessutom på stegmotorn, laserljuset och CCD-kameran.
- Identifiera utskjutande spets A med hjälp av CCD-kameran.
- Sänk utskjutande tills den är helt doppad i mediet. Använd stegmotorfunktionen för att nå detta mål.
- När utskjutande medel är helt täckt av medium riktas lasern in ovanpå utskjutande platta med hjälp av justeringsskruvarna. Den reflekterade strålen måste falla på mitten av fotodetektorn och summan av signalerna måste vara 1 V eller högre. De laterala och vertikala avböjningarna bör vara nära 0.
OBS: Om mitten nås kan övervakas i laserjusteringsfunktionen såväl som signalvärdena. Om signalvärdena inte är korrekta är ytterligare justeringar nödvändiga. - Kör nu skannerns metod med inflygningsparametrarna (tabell 1).
- Dra tillbaka utskjutande med 100 μm när den når botten genom att trycka på indragningsknappen .
OBS: Se till att ingen cell är fäst vid det fältet där tillvägagångssättet görs eftersom detta skulle förfalska kalibreringen. - Ställ in körningsparametrarna enligt följande specifikationer: Börvärde 1 V, Draglängd 90 μm, Hastighet: 5 μm/s, Samplingsfrekvens: 2000 Hz och som fördröjningsläge: Konstant kraft.
- Starta mätningen av kalibreringskraft-avståndskurvan genom att trycka på knappen Kör.
OBS: Genom att klicka på knappen Kör i programvaran erhålls en kraftavståndskurva. - Välj området för linjär passform för den indragna kurvan i programvaran på den erhållna kalibreringskraftavståndskurvan. Beräkna fjäderkonstantmätningen med programvaran.
- Kalibrera utskjutande enligt de exakta parametrarna och stegen som beskrivs av Danalache et al.17.
- Använd ett glasblock som är specificerat för mätningar i vätskor och justera det på AFM-hållaren.
- Mätning av elasticiteten hos enskilda celler
- Visuellt identifiera en cell och fokusera på den. Placera datormusen i mitten av cellen. För att förbättra mätprecisionen, placera AFM-spetsen direkt ovanför cellkärnan.
OBS: Datormusen används som visuell markör för att identifiera målplatsen för indrag. - Fokusera nu på utskjutande och flytta den på datormusen.
- Starta mätningen med Kör med de parametrar som anges i tabell 2.
OBS: Skarvpunktsparametern erhållen genom kalibrering av utskjutande används. Dessutom mäts en cell tre gånger. Mät minst 50 celler.
- Visuellt identifiera en cell och fokusera på den. Placera datormusen i mitten av cellen. För att förbättra mätprecisionen, placera AFM-spetsen direkt ovanför cellkärnan.
- Databehandling
- Bearbeta data enligt exakta steg och parametrar som tidigare beskrivits av Danalache17.
- Spara och exportera filen.
8. Statistisk analys
- Öppna statistikprogrammet.
- Välj valet av Ny datauppsättning.
OBS: Två filer öppnas. Den ena är "DataSet" och den andra är "Output" -filen. - Välj dataset-filen och öppna fliken Variabelvy .
- Sätt i de numeriska variablerna för injektion på plats (fånga upp vätska eller kadaverisk vävnad), kategori (kontroll, WJ-injektion, WN-injektion) och elasticitet.
- Infoga uppmätta elasticitetsdata med motsvarande injektionsställe och kategorinummer på fliken Datavy .
- Analysera data genom att välja menyradsfliken Analysera | Beskrivande statistik och välj Utforskande dataanalys.
- Som beroende variabel väljer du Elasticitet och faktorlista välj Kategori.
OBS: Resultaten visas i filen "Output" inklusive ett rutdiagram som används för resultatavsnittet. - Om du vill utföra ett statistiskt test väljer du Oberoende exempel i det icke-parametriska testet under menyradsfliken Analysera.
- I den nya öppnade filen behåller du inställningarna på fliken Mål och Inställningar.
- Öppna fliken Fält och välj Elasticitet som Testfält och Kategori som Grupper.
- Tryck på Kör.
OBS: Resultaten visas i filen "Output". För dessa analyser utförs ett Mann-U-Whitney-test. - Inkludera resultatet av det icke-parametriska testet i rutdiagrammet för den undersökande dataanalysen.
- Spara filerna genom att välja Arkiv i menyraden och välja Spara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter cellleverans via de två metoderna var livskraften hos celler som levererades genom WN (97,2 ± 2%, n = 10, p<0,002) högre jämfört med injektioner av WJ med E60-10-inställningarna (85,9 ± 0,16%, n = 12) (Figur 2). Biomekaniska bedömningsresultat visade att: WN-injektioner av celler i infångningsvätska inte visade någon signifikant skillnad med avseende på den elastiska modulen (EM; 0,992 kPa) jämfört med kontrollerna (1,176 kPa; Figur 3A), medan WJ-injektioner utlöste en signifikant minskning av cellulär EM (0,440 kPa, p<0,001, figur 3B). En minskning med 40 - 50% av EM efter WJ-injektioner noterades. Även om WN-injektioner i kadaverisk urinrörsvävnad inte gav någon signifikant skillnad i cellulär EM (figur 4A) noterades en signifikant minskning av EM efter WJ-injektioner i vävnadsprover (0,890 kPa till 0,429 kPa; p<0,00, figur 4B). Således reducerades absoluta EM-värden efter WJ-injektion därmed med 51%. Sammantaget visar resultaten att medan WJ-cellleverans uppfyller ett absolut krav på en klinisk implementering där mer än 80% livskraftiga celler efter leverans18 , efter WJ-leverans påverkas cellelastiska moduler. En lägre cellulär EM kan underlätta migreringen av cellernas egenskaper efter WJ-leverans. I en sådan bredare fördelning och utbud av regenerativ kapacitet i den önskade regionen19.
Figur 1. Anatomi av svinblåsan och urinröret och injektionsställen. A) Den ventrala sidan av svinblåsan och urinröret med de tre ligamenten som fixerar blåsan i buk- och bäckenhålan visas. Dessutom visas urinledarna som slutar på blåsans dorsala sida. B) Representativ bild av kadaveruretröret som används för WJ- och WN-injektion. Längsgående visas det dorsala öppnade urinröret med injektionskupoler cirklade i svart. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2. Cellulära viabilitetsbestämningsinjektioner via WN och WJ. pADSC injicerade via WN eller WJ samlades in efter injektion och räknades via Trypan-uteslutning för att bestämma livskraften. Den cellulära livskraften reducerades signifikant efter WJ-injektion jämfört med celler som levererades via WN. s<0.001. Data visas grafiskt som medelvärde med standardavvikelse. Förkortningar: WJ - vattenstråle, WN - Williams nål. Figur anpassad från Danalache etal. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3. Jämförelse av den kvantifierade Youngs moduli av WN respektive WJ levererade celler till fångstmedia och deras motsvarande kontroller. Ingen märkbar skillnad i EM observerades i boxplots för kontroll (obehandlade) cellmonolager och WN-levererade celler (A). Däremot kan en signifikant minskning av elasticiteten noteras mellan boxplotterna i kontrollcellerna och WJ-gruppen (B). ns - inte signifikant, p > 0,05, ***p<0,001. Förkortningar: WJ - vattenstråle, WN - Williams nål. Figur anpassad från Danalache etal. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4. Jämförelse av den kvantifierade Youngs moduli av WN respektive WJ levererade celler till kadaveruretra och deras motsvarande kontroller. Ingen märkbar skillnad observerades mellan celler som levererades via WN-celler och deras motsvarande kontroller (A). En signifikant minskning av elasticiteten noterades mellan de WJ-levererade cellerna och kontrollcellens monolager (B). ns - inte signifikant, p > 0,05, ***p<0,001. Förkortningar: WJ - vattenstråle, WN - Williams nål. Figur anpassad från Danalache etal. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Parameter för tillvägagångssätt | Värde |
| Närma sig IGain | 3,0 Hz |
| Närma sig PGain | 0.0002 |
| Närma sig målhöjd | 10,0 μm |
| Närma sig börvärde | 3,00 V |
| Baslinje för inflygning | 0,00 V |
Tabell 1. Tillvägagångssätt parametrar.
| Kör parameter | Värde |
| Fasta punkter | 10 nN |
| Z Movement/ Förläng hastigheten | Konstant hastighet/ |
| 5,0 μm/s | |
| Kontakttid | 0,0 s |
| Dra längd | 90 μm |
| Fördröjningsläge | Konstant kraft |
| Samplingsfrekvens | 2 000 Hz |
Tabell 2. Kör parametrar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I den aktuella studien demonstrerade och presenterade vi ett steg-för-steg-tillvägagångssätt för WJ-cellleveransförfarande och använde en följd av kvantitativa undersökningar för att bedöma effekten av WJ-leverans på cellulära egenskaper: cellulär livskraft och biomekaniska egenskaper (dvs. EM). Efter WJ-injektion var 85,9% av de skördade cellerna livskraftiga. När det gäller WN-injektion behöll 97,2% av cellerna sin livskraft efter injektion. Således uppfyller WJ-metoden ett absolut krav för en klinisk implementering: mer än 80% livskraftiga celler efter leverans18. Medan ett standardiserat och reproducerbart protokoll uppnås med WJ-metoden, är resultatet av nålinjektionsleverans mycket beroende av sprutans och nålens storlek och munstycke, tryck, flödeshastighet och läkaren som utför injektionen själva19.
Studier som använde WJ-cellleverans i levande djurmodeller visade att genom varierande utstötningstryck kan penetrationsdjupet anpassas till den riktade vävnaden och som sådan till önskad klinisk tillämpning13,16. Transuretrala cellinjektioner hos levande djur under visuell kontroll rapporterade felplacering eller förlust av celler hos cirka 50% av djuren som behandlades20, medan WJ-injektioner rapporterade exakta cellinjektionshastigheter över 90% (Linzenbold et al.16 och opublicerad observation). Den nuvarande gyllene standarden för cellleverans (nålinjektioner) kräver penetration av kanylen i en riktad vävnad. Därför orsakar nålcellöversättning skada och trauma i alla fall. I urinröret kan detta faktiskt orsaka inflammation ad toxifiering på grund av bakterier och toxiner som finns i även i frisk urin. Dessutom är användaroperationstiden vid WJ-injektion betydligt kortare jämfört med en nålinjektion: celler placeras inom millisekunder i det avsedda vävnadsskiktet genom att förinställa trycknivåerna. Däremot är penetrationsdjupet vid nålinjektion i avlägsna områden genom endoskopi beroende av kirurgens färdigheter och erfarenhet. Reproducerbarheten av WJ-injektion förväntas också vara överlägsen, men för närvarande finns endast prekliniska data 15,16,20 och mindre än 200 djur undersöktes. I vår senaste studie noterade vi att cellulär elasticitet reduceras av WJ-applikation jämfört med nålinjektioner21. Detta kan hänföras till skjuvspänningen hos celler i högre hastighet under WJ-leverans. Dessutom kan eventuell cellförlust kompenseras av en högre precision för cellplacering och utstötning inom det område som är av intresse som uppnås med WJ-styrd leverans genom visuell guidad cystoskopi22.
Det är välkänt att mekaniska krafter styr stamcellsbeteende, regenereringspotential samt deras efterföljande livskraft och funktionalitet efter transplantation 10,23. Tillkomsten av atomär AFM gav ett kraftfullt verktyg för att kvantifiera de mekaniska egenskaperna hos enskilda levande celler i nanoskala upplösning under vattenhaltiga förhållanden 24,25,26,27. AFM är en pålitlig och mycket känslig metod som kan detektera och registrera styvheter som sträcker sig från mindre än 100 Pa till 106 Pa, vilket täcker ett brett spektrum för majoriteten vävnader och celler28. Faktum är att cellmekanik framträder som etikettfri biomarkör för utvärdering av celltillstånd och i både fysiologiskt och patologiskt tillstånd29 och cellelasticitet är det synergiska och kumulativa svaret hos kärnan - cytoskelettöverhörning. Det är väl etablerat att när en cell utsätts för yttre krafter överförs dessa krafter från plasmamembranet via cytoskelettet till kärnan, vilket resulterar i intra-nukleära deformationer och omorganisation 30,31,32. Därför är kärnan, som länge setts som det genomiska materialet och transkriptionsapparaten, en nyckelaktör i den cellulära mekanotransduktionenockså 32. Faktum är att betydelsen av kärnmekanik och nukleo-cytoskelettanslutningar, i alla cellulära funktioner och mutationer, i laminer och länkare av nukleoskelettet till cytoskelettkomplexet (LINC) - är i början av grunden för flera patologier 33,34. Dessa krafter kan också indikera cellulära artefakter. Specifikt sprider externa genererade krafter faktiskt längs cytoskelettfilament och överförs vidare till kärnlamina över LINC-komplexet; som svar på dessa krafter blir kärnan i själva verket styvare35,36, vilket sammanfogar de två nära sammanflätade och anslutna processerna. Detta är också motiveringen till vårt tillvägagångssätt och våra kärntekniska mätningar. Dessutom säkerställer en exakt placering av utskjutande intet ovanpå kärnytan också en hög grad av reproducerbarhet och minskar variationer på grund av cellheterogenitet och fastsättning i underlaget.
Även om cellelasticitet framträder som etikettfri biomarkör för utvärdering av celltillståndet och i både fysiologiska och patologiska tillstånd29, markeras de uppmätta elastiska modulerna med stora variationer även i samma celltyp37. En metod för att motverka sådana variationer som föreslagits av Schillers et al. är implementeringen av standardiserade nanomekaniska AFM-förfaranden (SNAP) som säkerställer en hög reproducerbarhet och tillämplighet av elasticitetsmätningar som en tillförlitlig kvantitativ markör på celler i olika tillstånd38. Även om experimentella parametrar som används i AFM-analyserna, såsom indragningshastighet, indenterform och storlek samt exakt representation av spetsgeometri i modellanpassning 39, påverkar de absoluta uppmätta värdena 40,41, bör dessa parametrar inte påverka resultaten inom en studie eller en uppmätt tendens.
Tänk emellertid på att AFM-indragningar är begränsade till analys av cellernas yttre yta och är således oförmögna att skanna insidan av ett cellmembran eller särskilda intracellulära strukturer. Usukura et al. föreslog en "avroofing" -metod som bryter det cellulära membranet och tar bort de cytoplasmatiska lösliga komponenterna42, vilket möjliggör AFM- intracellulära undersökningar. I vår studie placerades dock fokus på bedömningen av genomsnittlig elastisk moduli snarare än att undersöka distinkta och selektiva intracellulära komponenter.
Sammantaget beror konsekvensen och tillförlitligheten hos de afm-data som avges starkt på respektive operatörs tekniska erfarenhet och kan vara partisk på följd av biologisk variation38. Med hänsyn till alla känsliga variabler som kan påverka de faktiska AFM-resultaten kan de absoluta elastiska värdena som rapporteras i denna studie inte generaliseras och är ganska specifika för vår experimentella inställning.
Sammantaget ger vår studie bevis21 samt ett steg-för-steg-protokoll för överlägsenheten av WJ-injektioner över nålinjektioner för regenerativ cellterapiregim.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna J.K., M.D., T.A., A.S., W.K. A. har inget att avslöja. Författarna W.L. och M.D.E. är anställda av ERBE Medizintechnik Lt. Tübingen, producenten av ERBEJet2 och WJ-prototypen som används i denna studie.
Acknowledgments
Vi tackar våra medförfattare från de ursprungliga publikationerna för deras hjälp och stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL centrifuge tube | Greiner BioOne | 227261 | |
| 1 mL BD Luer-LokTM Syringe | BD Plastik Inc | n.a. | |
| 100 µm cell sieve | Greiner BioOne | 542000 | |
| 15 mL centrifuge tube | Greiner BioOne | 188271 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Corning Incorporated | 353136 | |
| AFM head | (CellHesion 200) JPK | JPK00518 | |
| AFM processing software | Bruker | JPK00518 | |
| AFM software | Bruker | JPK00518 | |
| AFM system Cell Hesion 200 | Bruker | JPK00518 | |
| All-In-One-Al cantilever | Budget Sensors | AIO-10 | tip A, Conatct Mode, Shape: Beam Force Constant: 0.2 N/m (0.04 - 0.7 N/m) Resonance Frequency: 15 kHz (10 - 20 kHz) Length: 500 µm (490 - 510 µm) Width: 30 µm (35 - 45 µm) Thickness: 2.7 µm (1.7 - 3.7 µm) |
| Amphotericin B solution | Sigma | A2942 | 250 µg/ml |
| Atomic Force Microscope (AFM) | CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| BD Microlance 3 18G | BD | 304622 | |
| bovine serum albumin | Gibco | A10008-01 | |
| Cantilever | All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria | AIO-TL-10 | tip A, k ¼ 0.2 N/m |
| C-chip disposable hemocytometer | NanoEnTek | 631-1098 | |
| centrifuge: Rotina 420R | Hettich Zentrifugen | ||
| Collagenase, Type I, powder | Gibco | 17100-017 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - low glucose | Sigma | D5546 | |
| Feather disposable scalpel (No. 10) | Feather | 02.001.30.010 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | |
| HEPES sodium salt solution (1 M) | Sigma | H3662 | |
| Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| laboratory bags | Brand | 759705 | |
| Leibovitz's L-15 medium without l-glutamine | Merck | F1315 | |
| Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) | F1315 | |
| L-glutamine | Lonza | BE 17-605C1 | 200 mM |
| LIVE/DEADTM Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | L3224 | Calcein AM and EthD-1 are used from this kit. |
| Microscope software: Zen 2.6 | Zeiss | ||
| Microscope: AxioVertA.1 | Zeiss | ||
| Nelaton-Catheter female | Bicakcilar | 19512051 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 10000 U/ml Penicillin 10000 µg/ml Streptomycin |
| Petri dish heater associated with AFM | Bruker | T-05-0117 | |
| Petri dish heater associated with AFM | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-015 | |
| Statistical Software: SPSS Statistics 22 | IBM | ||
| Sterile Petri dish - CellStar | Greiner BioOne | 664160 | |
| Tissue culture dishes | TPP AG | TPP93040 | |
| Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| Trypan Blue 0.4% 0.85% NaCl |
Lonza | 17-942E | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | |
| Waterjet: ERBEJET2 device | Erbe Elektromedizin GmbH | ||
| Williams Cystoscopic Injection Needle | Cook Medical | G14220 | 23G, 5.0 Fr, 35 cm |
References
- Milsom, I., et al. Global prevalence and economic burden of urgency urinary incontinence: a systematic review. European Urology. 65 (1), 79-95 (2014).
- Lee, J. Y., et al. The effects of periurethral muscle-derived stem cell injection on leak point pressure in a rat model of stress urinary incontinence. International Urogynecology Journal and Pelvic Floor Dysfunction. 14 (1), 31-37 (2003).
- Tran, C., Damaser, M. S. The potential role of stem cells in the treatment of urinary incontinence. Therapeutic Advances in Urology. 7 (1), 22-40 (2015).
- Fu, Q., Song, X. F., Liao, G. L., Deng, C. L., Cui, L. Myoblasts differentiated from adipose-derived stem cells to treat stress urinary incontinence. Urology. 75 (3), 718-723 (2010).
- Corcos, J., et al. marrow mesenchymal stromal cell therapy for external urethral sphincter restoration in a rat model of stress urinary incontinence. Neurourology and Urodynamics. 30 (3), 447-455 (2011).
- Smaldone, M. C., Chen, M. L., Chancellor, M. B. Stem cell therapy for urethral sphincter regeneration. Minerva Urologica e Nefrologica. 61 (1), 27-40 (2009).
- Perin, E. C., López, J. Methods of stem cell delivery in cardiac diseases. Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine. 3, Suppl 1 110-113 (2006).
- Zhang, M., et al. Cardiomyocyte grafting for cardiac repair: graft cell death and anti-death strategies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (5), 907-921 (2001).
- Amer, M. H., White, L. J., Shakesheff, K. M. The effect of injection using narrow-bore needles on mammalian cells: administration and formulation considerations for cell therapies. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (5), 640-650 (2015).
- Amer, M. H., Rose, F. R. A. J., Shakesheff, K. M., Modo, M., White, L. J. Translational considerations in injectable cell-based therapeutics for neurological applications: concepts, progress and challenges. NPJ Regenerative Medicine. 2, 23-23 (2017).
- Linzenbold, W., Fech, A., Hofmann, M., Aicher, W. K., Enderle, M. D. Novel Techniques to Improve Precise Cell Injection. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6367 (2021).
- Adamo, A., Roushdy, O., Dokov, R., Sharei, A., Jensen, K. F. Microfluidic jet injection for delivering macromolecules into cells. Journal of Micromechanics and Microengineering: Structures, Devices, and Systems. 23, 035026 (2013).
- Jäger, L., et al. A novel waterjet technology for transurethral cystoscopic injection of viable cells in the urethral sphincter complex. Neurourology and Urodynamics. 39 (2), 594-602 (2020).
- Weber, M., et al. Hydrojet-based delivery of footprint-free iPSC-derived cardiomyocytes into porcine myocardium. Scientific Reports. 10 (1), 16787 (2020).
- Jäger, L., et al. A novel waterjet technology for transurethral cystoscopic injection of viable cells in the urethral sphincter complex. Neurourology and Urodynamics. 39 (2), 594-602 (2020).
- Linzenbold, W., et al. Rapid and precise delivery of cells in the urethral sphincter complex by a novel needle-free waterjet technology. BJU International. 127 (4), 463-472 (2021).
- Danalache, M., Tiwari, A., Sigwart, V., Hofmann, U. K. Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis. Journal of Visualized Experiments. (159), e61041 (2020).
- Gálvez-Martín, P., Hmadcha, A., Soria, B., Calpena-Campmany, A. C., Clares-Naveros, B. Study of the stability of packaging and storage conditions of human mesenchymal stem cell for intra-arterial clinical application in patient with critical limb ischemia. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 86 (3), 459-468 (2014).
- Danalache, M., et al. Injection of Porcine Adipose Tissue-Derived Stromal Cells by a Novel Waterjet Technology. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), (2021).
- Amend, B., et al. Precise injection of human mesenchymal stromal cells in the urethral sphincter complex of Göttingen minipigs without unspecific bulking effects. Neurourology and Urodynamics. 36 (7), 1723-1733 (2017).
- Danalache, M., et al. Injection of Porcine Adipose Tissue-Derived Stromal Cells by a Novel Waterjet Technology. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), 3958 (2021).
- Strasser, H., et al. 328: Transurethral Ultrasound Guided Stem Cell Therapy of Urinary Incontinence. Journal of Urology. 175 (4), 107 (2006).
- Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 18 (12), 728-742 (2017).
- Ding, Y., Xu, G. -K., Wang, G. -F. On the determination of elastic moduli of cells by AFM based indentation. Scientific Reports. 7 (1), 45575 (2017).
- Charras, G. T., Horton, M. A. Single cell mechanotransduction and its modulation analyzed by atomic force microscope indentation. Biophysical Journal. 82 (6), 2970-2981 (2002).
- Carl, P., Schillers, H. Elasticity measurement of living cells with an atomic force microscope: data acquisition and processing. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 457 (2), 551-559 (2008).
- Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. Journal of Biomechanics. 41 (2), 454-464 (2008).
- Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the mechanical properties of living cells using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (76), e50497 (2013).
- Li, M., Dang, D., Liu, L., Xi, N., Wang, Y. Atomic Force Microscopy in Characterizing Cell Mechanics for Biomedical Applications: A Review. IEEE Trans Nanobioscience. 16 (6), 523-540 (2017).
- Morimoto, A., et al. A conserved KASH domain protein associates with telomeres, SUN1, and dynactin during mammalian meiosis. The Journal of Cell Biology. 198 (2), 165 (2012).
- Lombardi, M. L., et al. The interaction between nesprins and sun proteins at the nuclear envelope is critical for force transmission between the nucleus and cytoskeleton. Journal of Biological Chemistry. 286 (30), 26743-26753 (2011).
- Isermann, P., Lammerding, J. Nuclear Mechanics and Mechanotransduction in Health and Disease. Current Biology. 23 (24), 1113-1121 (2013).
- Méjat, A. LINC complexes in health and disease. Nucleus. 1 (1), 40-52 (2010).
- Folker, E. S., Östlund, C., Luxton, G. G., Worman, H. J., Gundersen, G. G. Lamin A variants that cause striated muscle disease are defective in anchoring transmembrane actin-associated nuclear lines for nuclear movement. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (1), 131-136 (2011).
- Guilluy, C., et al. Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus. Nature cell biology. 16 (4), 376-381 (2014).
- Fischer, T., Hayn, A., Mierke, C. T. Effect of Nuclear Stiffness on Cell Mechanics and Migration of Human Breast Cancer Cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 393 (2020).
- Kuznetsova, T. G., Starodubtseva, M. N., Yegorenkov, N. I., Chizhik, S. A., Zhdanov, R. I. Atomic force microscopy probing of cell elasticity. Micron. 38 (8), 824-833 (2007).
- Schillers, H., et al. Standardized Nanomechanical Atomic Force Microscopy Procedure (SNAP) for Measuring Soft and Biological Samples. Scientific Reports. 7 (1), 5117 (2017).
- Costa, K. D., Yin, F. C. Analysis of indentation: implications for measuring mechanical properties with atomic force microscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 121 (5), 462-471 (1999).
- Stolz, M., et al. Dynamic elastic modulus of porcine articular cartilage determined at two different levels of tissue organization by indentation-type atomic force microscopy. Biophysical Journal. 86 (5), (2004).
- Park, S., Costa, K. D., Ateshian, G. A., Hong, K. S. Mechanical properties of bovine articular cartilage under microscale indentation loading from atomic force microscopy. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H. 223 (3), 339-347 (2009).
- Usukura, E., Narita, A., Yagi, A., Ito, S., Usukura, J. An Unroofing Method to Observe the Cytoskeleton Directly at Molecular Resolution Using Atomic Force Microscopy. Scientific Reports. 6 (1), 27472 (2016).
