Aqui apresentamos um modelo padronizado de rato SAH, induzido pela perfuração de filamento endovascular, combinado com ressonância magnética (RM) 24 h após a operação para garantir o local correto do sangramento e excluir outras patologias intracranianas relevantes.
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Artigo de método
Modelo de perfuração endovascular para hemorragia subaracnóide combinada com ressonância magnética (RM)
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O modelo de perfuração de filamento endovascular para imitar hemorragia subaracnóide (SAH) é um modelo comumente utilizado - no entanto, a técnica pode causar uma alta taxa de mortalidade, bem como um volume incontrolável de HAS e outras complicações intracranianas, como derrame ou hemorragia intracraniana. Neste protocolo, é apresentado um modelo padronizado de mouse SAH, induzido por perfuração de filamento endovascular, combinado com ressonância magnética (RM) 24 horas após a operação para garantir o local correto do sangramento e excluir outras patologias intracranianas relevantes. Resumidamente, os camundongos C57BL/6J são anestesiados com uma injeção de cetamina/xilazina intraperitoneal (70 mg/16 mg/kg de peso corporal) e colocados em uma posição supina. Após a incisão do pescoço médio, a artéria carótida comum (CCA) e a bifurcação carótida são expostas, e uma sutura de polipropileno monofilament não absorvível 5-0 é inserida de forma retrógrada na artéria carótida externa (ECA) e avançada na artéria carótida comum. Em seguida, o filamento é invagiado na artéria carótida interna (ICA) e empurrado para a frente para perfurar a artéria cerebral anterior (ACA). Após a recuperação da cirurgia, os camundongos passam por uma ressonância magnética 7.0 T 24 h depois. O volume de sangramento pode ser quantificado e classificado via ressonância magnética pós-operatória, permitindo um robusto grupo experimental sah com a opção de realizar novas análises de subgrupo com base na quantidade de sangue.
Introdução
A hemorragia subaracnóide (SAH) é causada pela ruptura de um aneurisma intracraniano e representa uma emergência com risco de vida, associada à morbidade e mortalidade substanciais, representando aproximadamente 5% dos derrames 1,2. Pacientes de HAS apresentam dores de cabeça severas, disfunção neurológica e perturbação progressiva da consciência3. Cerca de 30% dos pacientes da HAS morrem nos primeiros 30 dias após o evento inicialde sangramento 4. Clinicamente, 50% dos pacientes experimentam lesão cerebral retardada (DBI) após lesão cerebral precoce. O DBI é caracterizado por isquemia cerebral retardada e déficits neurológicos atrasados. Estudos atuais têm demonstrado que os efeitos sinérgicos de vários fatores diferentes levam à perda da função neurológica, incluindo a destruição da barreira hemencefálica, a contração de pequenas artérias, disfunção microcirculatória e trombose 5,6.
Um aspecto único da SAH é que a patogênese se origina de uma localização extraparenquiamal, mas leva a cascatas prejudiciais dentro do parenchyma: a patologia começa com o acúmulo de sangue no espaço subaracnóide, desencadeando uma infinidade de efeitos intraparenquiais, como neuroinflamação, apoptose celular neuronal e endotelial, despolarização cortical espalhando e formação de edema cerebral7, 8.
A pesquisa clínica é limitada por vários fatores, tornando o modelo animal um elemento crítico em imitar de forma consistente e precisa as mudanças pathomecanísticas da doença. Diferentes protocolos de modelo SAH foram propostos, por exemplo, injeção de sangue autóloga na cisterna magna (ACM). Além disso, um método modificado com dupla injeção de sangue autólogo na cisterna magna e cisterna quiasm óptica (APC) respectivamente 9,10. Embora a injeção de sangue autóloga seja uma maneira simples de simular o processo patológico do vasospasmo e reações inflamatórias após hemorragia subaracnóide, o aumento seguinte da pressão intracraniana (ICP) é relativamente lento, e nenhuma alteração notável na permeabilidade da barreira hematoencefálica é induzida11,12. Outro método, a colocação de sangue periarterial, geralmente usada em grandes modelos SAH (por exemplo, macacos e cães), envolve a colocação de sangue autólogo anticoagulante ou produtos sanguíneos comparáveis ao redor do vaso. As alterações de diâmetro da artéria podem ser observadas com um microscópio, servindo como indicador para o vasospasmo cerebral após a SAH13.
Barry et al. descreveram pela primeira vez um modelo de perfuração endovascular em 1979, no qual a artéria basilar é exposta após a remoção do crânio; a artéria é então perfurada com microeletrodos de tungstênio, usando uma técnica estereotática microscópica14. Em 1995, Bederson e Veelken modificaram o modelo Zea-Longa de isquemia cerebral e estabeleceram a perfuração endovascular, que tem sido continuamente melhorada desde15,16. Este método baseia-se no fato de que camundongos e humanos compartilham uma rede vascular intracraniana semelhante, conhecida como o círculo de Willis.
Para a avaliação pós-operatória e a classificação da SAH no modelo do mouse, foram propostas diferentes abordagens. Sugawara et al. desenvolveram uma escala de classificação que tem sido amplamente utilizada desde 200817. Este método avalia a gravidade da HAS com base em alterações morfológicas. No entanto, para este método, a morfologia do tecido cerebral do camundongo deve ser examinada sob visão direta e, portanto, o camundongo deve ser sacrificado para avaliação. Além disso, vários métodos para determinar a gravidade da HAS in vivo foram estabelecidos. As abordagens vão desde pontuação neurológica simples até monitoramento da pressão intracraniana (ICP) a várias técnicas de imagem radiológica. Além disso, a classificação da ressonância magnética tem sido mostrada como uma nova ferramenta não invasiva para classificar a gravidade da HAS, correlacionando-se com a pontuação neurológica18,19.
Aqui, é apresentado um protocolo para um modelo SAH causado pela perfuração endovascular, combinado com a ressonância magnética pós-operatória. Na tentativa de estabelecer um sistema para objetificar a quantidade de sangramento em um ambiente in vivo , também desenvolvemos um sistema para classificação e quantificação do volume sanguíneo total com base em ressonância magnética de alta resolução T2 de alta resolução de 7,0 T. Esta abordagem garante a indução correta da HAS e a exclusão de outras patologias como acidente vascular cerebral, hidrocefalia ou hemorragia intracerebral (ICH) e complicações.
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Protocolo
Os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos por Landesamt fuer Gesundheit und Soziales (LaGeSo), Berlim, Alemanha (G0063/18). Neste estudo, foram utilizados camundongos C57Bl/6J masculino (8-12 semanas) com peso de 25 ± 0,286 g (média ± s.e.m.)
1. Preparação animal
- Induzir anestesia injetando cetamina (70 mg/kg) e xilazina (16 mg/kg) intraperitoneally. Manter a temperatura normal do corpo, contribuindo para a rápida indução de anestesia profunda. Teste para sedação adequada com um estímulo de dor, como uma pitada de dedo do pé, e verifique a ausência de uma reação.
- Raspe cuidadosamente o cabelo do pescoço do rato com uma navalha, limpe-o com 70% de etanol seguido de betadina/clorexidina, e aplique 1% de lidocaína na superfície da pele para controle da dor local.
- Coloque o mouse em uma posição supina. Use fita adesiva para fixar os membros e a cauda, esticando suavemente a pele do pescoço para o lado oposto da cirurgia. Simultaneamente, eleve ligeiramente o pescoço.
- Use pomada oftalmica (por exemplo, 5% dexpanthenol) para evitar a desidratação dos olhos durante a operação.
2. Indução sah
Figura 1: São identificadas imagens passo a passo da técnica cirúrgica. (A) Representação da anatomia da artéria carótida direita exposta: a CCA e sua bifurcação em ICA e ECA, bem como os pequenos ramos do ECA (OA e STA). (B) O TCE é mobilizado a partir do tecido circundante e ligado com duas suturas antes de cortá-lo. Uma terceira ligadura precisa ser colocada vagamente perto da bifurcação sem ocluí-la. (C) O ICA e o CCA são ocluídos temporariamente (com ligadura ou clipes) para evitar sangramento excessivo quando o ECA é cuidadosamente incisado. (D) O filamento é inserido no TCE e avançado na CCA. A ligadura pré-arranjada deve ser apertada cuidadosamente para que não ocorra efusão sanguínea, mas o avanço do filamento permanece possível. (E) O ICA e o CCA são reabertos, e o toco do ECA precisa ser ajustado para uma direção craniana. Empurrando o filamento ~9 mm para a frente no ICA, a bifurcação ACA-MCA será alcançada, e o vaso é então perfurado empurrando o filamento ~3mm mais adiante. (F) O filamento é retirado após garantir uma religação temporal da CCA. A ligadura pré-organizada do TCE é rapidamente ocluída, e a CCA é reaberta para permitir a reperfusão. Abreviaturas: ACA = artéria cerebral anterior, CCA = artéria carótida comum, ECA = artéria carótida externa, MCA = artéria cerebral média, ICA = artéria carótida interna, OA = artéria occipital, PPA = artéria pterygopalatina, STA = artéria tireoide superior. Barra de escala = 2 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Abra a pele do pescoço com um bisturi estéril, do queixo até a borda superior do osso mamário (1,5 cm), e separe sem rodeios as glândulas salivares do tecido conjuntivo circundante.
- Separe o grupo muscular ao longo de um lado [neste caso, o lado direito] da traqueia, expondo a artéria carótida comum (CCA) coberta com vasos sanguíneos nutritivos e venules. A CCA e o nervo vagal estão localizados próximos um do outro.
- Dissociar a CCA e deixar um 8-0 grátis sutura de seda em torno da CCA sem ligante-lo com antecedência. Preste atenção à proteção do nervo vagal, pois é facilmente danificado (Figura 1A).
- Uma bifurcação tripla da CCA, do ICA e do TCE é visível ao longo do terço inferior posterior da diástase. Dissecar a extremidade distal do ECA e ligar o navio duas vezes mais longe possível.
- Desconecte o ECA no ponto médio do segmento duas vezes ligado, criando um toco de navio.
- Pré-abrasse uma ligadura para o filamento em torno do toco ECA, não feche-o até a inserção bem sucedida do filamento.
- Use uma sutura ou micro clipe para ocluir temporariamente o ICA e o CCA (Figura 1B).
- Faça uma pequena incisão (aproximadamente metade do diâmetro do ECA) no ECA utilizando tesoura microvascular. Insira um filamento de 5-0 (alternativamente 4-0) prolene no TCE e avance-o para o CCA.
- Feche ligeiramente a ligadura no ECA enquanto afrouxa o micro clipe no ICA e CCA (Figura 1C).
- Puxe suavemente para trás no filamento e ajuste o toco ECA na direção craniana, invaginando o filamento através da bifurcação no ICA (Figura 1D).
- Aponte a ponta de filamento medialmente em um ângulo de ~30° para a linha média traqueal e ~30° para o plano horizontal. Empurre o filamento para dentro do ICA. Após atingir a bifurcação ACA-MCA, encontra-se resistência (~9 mm).
- Avance o filamento 3 mm mais adiante, perfurando a ACA direita. Retire prontamente o filamento para o toco do ECA, permitindo o fluxo sanguíneo para o espaço subaracnóide.
- Mantenha o filamento nesta posição por cerca de 10 s (Figura 1E). A presença de tremores musculares, miose ipsilateral, ofegante para respirar, ritmo cardíaco alterado e incontinência urinária pode estar apoiando evidências de cirurgia bem sucedida.
- Feche temporariamente a CCA para evitar o excesso de perda de sangue. Retire o filamento instantaneamente e liga o ECA com a sutura pré-arranjada. Reabra a CCA e permita a reperfusão e a derrame de sangue no espaço subaracnóide (Figura 1F).
- Depois de verificar se há vazamento de sangramento, desinfete a pele ao redor da ferida para evitar infecções de pele pós-operatórias, e suturar a ferida com uma sutura de fibra de poliéster 4-0 não absorvível.
- Coloque o mouse em uma caixa térmica até que a consciência seja recuperada. Espere até que o animal esteja totalmente acordado e certifique-se de que ele recuperou a consciência suficiente para manter a recumbência severa. Não devolva animais à companhia de outros ratos até que esteja totalmente recuperado.
- Administre 200-300 mg/kg de paracetamol de peso corporal para alívio da dor pós-operatório.
- Verifique os ratos diariamente após a cirurgia.
3. Medição de ressonância magnética
- 24 h após a cirurgia, realize a ressonância magnética utilizando um scanner de roedores (Tabela de Materiais) e um ressonador dedicado da cabeça do rato- aqui, foi utilizado um ressonador de volume de transmissão/quatrotodatura de 20 mm.
- Coloque o mouse em uma manta de água corrente aquecida para garantir uma temperatura corporal constante de ~37 °C. Induzir anestesia com isoflurane de 2,5 % em uma mistura O2/N2O (30%/70%) e manter com 1,5-2 % de isoflurane via máscara facial sob monitoramento contínuo de ventilação.
- Primeiro realize uma varredura de referência rápida adquirindo 3 pacotes de fatias ortogonais (Tri-Pilot-Multi, FLASH com tempo de repetição TR/echo time TE = 200 ms/3 ms, 1 média, flip angle FA = 30°, campo de visão FOV = 28 mm x 28 mm, matriz MTX = 256 x 256, espessura de fatia 1 mm, tempo total de aquisição TA =30 s).
- Em seguida, use uma sequência de spin-echo turbo 2D de alta resolução para imagem (parâmetros de imagem TR/TE = 5505 ms/36 ms, Fator RARO 8, 6 médias, 46 fatias axiais contíguas com uma espessura de fatia de 0,35 mm para cobrir todo o cérebro, FOV = 25,6 mm x 25,6 mm, MTX = 256 x 256, TA = 13 min).
- Se o resultado não estiver claro, use uma sequência de eco gradiente ponderada T2*com a mesma isodistância que a varredura T2w (FLASH 2D, TR/TE = 600 ms/6,3 ms, FA = 30°, 1 média, 20 fatias axiais com espessura de 0,35 mm, FOV e MTX idênticos a T2w, TA = 5-10 min dependendo da taxa de respiração).
- Transfira os dados para o formato de imagem DICOM e use o software ImageJ para classificação SAH e volumetria de coágulos sanguíneos. Os detalhes sobre a quantificação são listados como um guia passo-a-passo no material suplementar (Figura Suplementar 1).
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Resultados
Mortalidade
Para este estudo, foram submetidos à operação SAH um total de 92 camundongos C57Bl/6J masculinos com idade entre 8 e 12 semanas; nestes, observou-se uma taxa global de mortalidade de 11,9% (n = 12). A mortalidade ocorreu exclusivamente entre as primeiras 6-24 horas após a cirurgia, sugerindo a mortalidade perioperatória, bem como o sangramento da HAS como os fatores contribuintes mais prováveis.
Grau de sangramento SAH
Um total de 50 camundon...
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Discussão
Em resumo, um modelo padronizado de mouse SAH induzido pela operação de perfuração de filamento endovascular é apresentado com pequena invasão, curto tempo operacional e taxas aceitáveis de mortalidade. A ressonância magnética é realizada 24h no pós-operatório para garantir o local correto do sangramento e a exclusão de outras patologias intracranianas relevantes. Além disso, classificamos diferentes graus de sangramento sah e medimos volumes sanguíneos, permitindo novas análises de subgrupos com base no grau de sangrame...
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Divulgações
Sem conflitos de interesse
Agradecimentos
A SL foi apoiada pelo Conselho chinês de Bolsas. A KT foi apoiada pela bolsa BIH-MD do Instituto de Saúde de Berlim e do Sonnenfeld-Stiftung. A RX é apoiada pelo Programa de Cientista Clínico BIH-Charité, financiado pela Charité -Universitätsmedizin Berlin e pelo Instituto de Saúde de Berlim. Reconhecemos o apoio da Fundação Alemã de Pesquisa (DFG) e do Fundo de Publicação de Acesso Aberto de Charité - Universitätsmedizin Berlin.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Creme para os olhos | Bayer | 815529836 | Bepanthen |
| Software de análise de imagens | ImageJ | Empacotado com Java 1.8.0_172 | |
| Sutura de ligadura (5-0) | SMI | Preto de seda USP | |
| Fonte de luz para microscópio | Zeiss | CL 6000 LED | |
| Cetamina | CP-pharma | 797-037 | 100 mg/mL |
| MRI | Bruker | Pharmascan 70/16 | 7 imagens de ressonância magnética Tesla |
| adquiridas software | Bruker | Bruker Paravision 5.1 | |
| Paracetamol (40 mg/mL) | bene Arzneimittel | 4993736 | |
| Filamento de prolene (5-0) | Erhicon | EH7255 | |
| Razor | Wella | HS61 | |
| Instrumento cirúrgico (tesoura fina) | FST | 14060-09 | |
| Instrumento cirúrgico (fórceps # 1) | AESCULAP | FM001R | |
| Instrumento cirúrgico (fórceps#2) | AESCULAP | FD2855R | |
| Instrumento cirúrgico (fórceps#3) | Hammacher | HCS 082-12 | |
| Instrumento cirúrgico (porta-agulha) | FST | 91201-13 | |
| Instrumento cirúrgico (tesoura de mola Vannas) | FST | 15000-08 | |
| Microscópio | cirúrgicoZeiss | Stemi 2000 C | |
| Monitoramento de ventilação | Stony Brook | Small Animal Monitoring & Sistema de gating | |
| Sutura de ferimento (4-0) | Erhicon | CB84D | |
| Xylavet | CP-pharma | 797-062 | 20 mg / mL |
Referências
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Reimpressões e permissões
