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Artigo de método

Isolamento escalável e purificação de vesículas extracelulares de Escherichia coli e outras bactérias

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DOI:

10.3791/63155

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13 de outubro de 2021

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1Department of Cardiovascular & Metabolic Sciences, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, 2University Hospitals Cleveland Medical Center, 3Case Western Reserve University, 4Center for Microbiome & Human Health, Cleveland Clinic, 5Electron Microscopy Core, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic

Neste artigo

Resumo

As bactérias secretam vesículas extracelulares (EVs) de tamanho nanométrico que transportam moléculas biológicas bioativas. A pesquisa EV se concentra na compreensão de sua biogênese, papel nas interações micróbio-micróbio e hospedeiro-micróbio e doença, bem como suas potenciais aplicações terapêuticas. Um fluxo de trabalho para isolamento escalável de EVs de várias bactérias é apresentado para facilitar a padronização da pesquisa de EV.

Resumo

Diversas espécies bacterianas secretam ~20-300 nm de vesículas extracelulares (EVs), compostas de lipídios, proteínas, ácidos nucleicos, glicanos e outras moléculas derivadas das células parentais. Os EVs funcionam como vetores de comunicação intra e interespécies, ao mesmo tempo em que contribuem para a interação entre bactérias e organismos hospedeiros no contexto de infecção e colonização. Dada a multiplicidade de funções atribuídas aos EVs na saúde e na doença, há um interesse crescente em isolar EVs para estudos in vitro e in vivo. Hipotetizou-se que a separação dos EVs com base em propriedades físicas, ou seja, tamanho, facilitaria o isolamento de vesículas de diversas culturas bacterianas.

O fluxo de trabalho de isolamento consiste em centrifugação, filtração, ultrafiltração e cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) para o isolamento de EVs de culturas bacterianas. Uma etapa de filtragem de fluxo tangencial (TFF) acionada por bomba foi incorporada para melhorar a escalabilidade, permitindo o isolamento do material de litros de cultura de células iniciais. Escherichia coli foi utilizada como um sistema modelo que expressa nanoluciferase associada a EV e mCherry não associada a EV como proteínas repórteres. A nanoluciferase foi direcionada aos EVs pela fusão de seu N-terminal com a citolisina A. Frações de cromatografia inicial contendo EVs de 20-100 nm com citolisina A associada - nanoLuc foram distintas das frações posteriores contendo as proteínas livres. A presença de nanoluciferase associada à EV foi confirmada por marcação imunodourada e microscopia eletrônica de transmissão. Este fluxo de trabalho de isolamento EV é aplicável a outras espécies bacterianas gram-negativas e gram-positivas associadas ao intestino humano. Em conclusão, a combinação de centrifugação, filtração, ultrafiltração/TFF e SEC permite o isolamento escalável de EVs de diversas espécies bacterianas. Empregar um fluxo de trabalho de isolamento padronizado facilitará estudos comparativos de EVs microbianos entre espécies.

Introdução

As vesículas extracelulares (EVs) são estruturas do tamanho nanométrico, semelhantes a lipossomas, compostas por lipídios, proteínas, glicanos e ácidos nucleicos, secretadas por células procarióticas e eucarióticas1. Desde os primeiros estudos que visualizaram a liberação de EVs de bactérias gram-negativas2, o número de funções biológicas atribuídas a EVs bacterianas (20-300 nm de diâmetro) tem crescido constantemente nas últimas décadas. Suas funções incluem transferência de resistência a antibióticos3, formação de biofilme4, detecção de quórum5 e entrega de toxinas6. Há também um interesse crescente no uso de EVs bacterianos como terapêutica, especialmente em vacinologia7 e terapia do câncer8.

Apesar do crescente interesse na pesquisa de VE, ainda existem desafios técnicos em relação aos métodos de isolamento. Especificamente, há uma necessidade de métodos de isolamento que sejam reprodutíveis, escaláveis e compatíveis com diversos organismos produtores de EV. Para criar um conjunto unificado de princípios para o planejamento e relato de isolamento de EV e métodos de pesquisa, a Sociedade Internacional de Vesículas Extracelulares publica e atualiza o documento de posição MISEV9. Além disso, o consórcio EV-TRACK fornece uma plataforma aberta para relatar metodologias detalhadas para o isolamento de EV usadas em manuscritos publicados para aumentar a transparência10.

Neste protocolo, metodologias anteriores utilizadas para o isolamento de EVs da cultura de células de mamíferos foram adaptadas11,12 para permitir o isolamento de EVs da cultura de células bacterianas. Procuramos empregar métodos que permitam o isolamento de EV de uma variedade de micróbios, que podem ser escaláveis, e equilibrar a pureza e o rendimento do EV (conforme discutido no documentode posição MISEV 9). Após a remoção de células bacterianas e detritos por centrifugação e filtração, o meio de cultura é concentrado por ultrafiltração por dispositivo centrífugo (para um volume de até ~100 mL) ou TFF acionado por bomba (para volumes maiores). Os EVs são então isolados pela SEC usando colunas otimizadas para a purificação de pequenos EVs.

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Figura 1: Visão geral esquemática do fluxo de trabalho de isolamento de EV bacteriano. Abreviaturas: EV = vesícula extracelular; TFF = filtração de fluxo tangencial; SEC = cromatografia de exclusão de tamanho; MWCO = ponto de corte do peso molecular. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Uma cepa comensal de camundongo de Escherichia coli (isto é, E. coli MP113) foi utilizada como organismo modelo e modificada para expressar nanoluciferase associada a EV por fusão com citolisina A, conforme relatado anteriormente14. Os métodos utilizados aqui podem processar pelo menos até vários litros de culturas bacterianas e efetivamente separar as proteínas associadas ao EV das proteínas não associadas ao EV. Finalmente, este método também pode ser usado para outras espécies bacterianas gram-positivas e gram-negativas. Todos os dados relevantes dos experimentos relatados foram submetidos à base de conhecimento EV-TRACK (EV-TRACK ID: EV210211)10.

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Protocolo

NOTA: Garantir que todo o trabalho que envolva bactérias e ADN recombinante siga as melhores práticas de contenção de biossegurança adequadas ao nível de risco de biossegurança de cada estirpe. O trabalho deve ser feito de acordo com os regulamentos de biossegurança locais, nacionais e internacionais.

1. Estirpes bacterianas e condições de cultura

NOTA: As cepas bacterianas utilizadas neste estudo foram Escherichia coli MP113, Akkermansia mucinophila, Bacteroides thetaiotaomicron, Bifidobacterium breve e Bifidobacterium dentium.

  1. Para E. coli, usar uma alça estéril para inocular colônias individuais em 250 a 1.000 mL de caldo de Luria-Bertani (LB) e incubar aerobicamente em uma incubadora de agitação a 300 rpm e 37 °C por 48 h antes de processar a cultura. Para a cepa recombinante de E. coli MP1 que abriga p114-mCherry-Clyluc (Método Suplementar e Figura Suplementar S1), adicionar cloranfenicol ao ágar LB e caldo a uma concentração final de 17 μg/mL.
  2. Para A. mucinophila, B. thetaiotaomicron, B. breve e B. dentium, listrar em placas de ágar de infusão cardíaca cerebral (BHI) e incubar anaerobicamente dentro de uma câmara anaeróbia de vinil. Inocular colônias individuais em 100 mL de caldo de BHI pré-reduzido e incubar por 48 h anaerobicamente.

2. Isolamento do EV

  1. Meio de cultura bacteriana clarificante por centrifugação e filtração
    1. Transfira as culturas de células bacterianas inoculadas na etapa 1 para limpar frascos de centrífuga de polipropileno de 250 mL ou 500 mL derramando. Centrifugar as garrafas em um rotor de grande capacidade e ângulo fixo a 4 °C e 5.000 × g por 15 min. Transfira o sobrenadante para limpar frascos de centrífuga por meio de um derramamento cuidadoso e centrifugar novamente a 10.000 × g por 15 min.
      NOTA: Reutilize os frascos após limpeza e descontaminação adequadas à biossegurança.
      1. Se grandes pellets de células bacterianas estiverem presentes após a segunda centrifugação, repita a centrifugação em um frasco limpo para remover ainda mais as células.
    2. Transfira o sobrenadante para um dispositivo de filtro acionado a vácuo de polietersulfona de 0,22 μm de tamanho apropriado derramando. Filtre conectando o dispositivo de filtragem a uma fonte de parede de vácuo. Se a taxa de filtragem cair significativamente, basta mover qualquer material não filtrado para um novo dispositivo. Armazene o meio filtrado a 4 °C durante a noite e continue o protocolo no dia seguinte, se desejar.
      NOTA: As centrifugações acima normalmente permitem o processamento de ~2x o volume indicado de cultura celular através de cada dispositivo. Por exemplo, um único dispositivo de filtro de 500 mL poderia filtrar ~1.000 mL de cultura pré-centrifugada. Esses dispositivos normalmente não são reutilizados. O uso de filtros de seringa nesta etapa não é recomendado sem otimização, pois perdas significativas foram observadas com os modelos testados. Este é um potencial ponto de parada.
    3. Verificar a remoção completa das células viáveis neste ponto, espalhando uma alíquota do sobrenadante filtrado em placas de ágar adequadas e garantir a ausência de quaisquer colónias após a incubação em condições óptimas para a estirpe bacteriana. Se forem detectadas bactérias, otimize ainda mais o procedimento acima, realizando centrifugações e/ou filtrações adicionais.
  2. Concentração do meio filtrado
    1. Se trabalhar com volumes significativamente >100 ml, avance para o passo 2.2.2. Se trabalhar com volumes de ~100 mL, carregue 90 mL de meio de cultura filtrado no reservatório de um respectivo dispositivo de ultrafiltração centrífuga de corte de peso molecular (MWCO) de capacidade 100 kDa usando pipetas sorológicas. Sempre equilibre com um dispositivo de ultrafiltração correspondente e centrifugar no rotor da caçamba oscilante a 4 °C e 2.000 × g por intervalos de 15 a 30 minutos, até que o volume do meio no reservatório superior tenha sido concentrado em <0,5 mL.
      1. Encha o reservatório com qualquer meio de cultura filtrado restante. Se "recarregar", remova o fluxo na parte inferior do dispositivo e reequilibre todos os dispositivos.
        NOTA: Observou-se que o volume máximo de meio de cultura filtrado que pode ser concentrado utilizando esses dispositivos é <2 vezes o volume recomendado.
      2. Se a viscosidade do meio concentrado no reservatório estiver visivelmente aumentada (material escuro e viscoso), diluir com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e reconcentrar por centrifugação para diluir quaisquer proteínas não-EV menores que o MWCO de 100 kDa.
        Observação : este é um ponto de parada potencial.
      3. Transfira o meio concentrado para um tubo de baixa ligação a proteínas, armazene a 4 °C durante a noite e continue o protocolo no dia seguinte, se desejar.
    2. Se estiver trabalhando com volumes significativamente >100 mL, selecione um dispositivo TFF de tamanho apropriado (100 kDa MWCO) para acomodar o volume a ser processado.
      NOTA: Dispositivos de filtração para processamento de 100 mL a >1.000 mL estão disponíveis comercialmente. A disponibilidade, o custo e a compatibilidade locais com a bomba e a tubulação/conexões determinarão quais modelos específicos serão mais úteis. Até 2 L de meio de cultura foram processados com o dispositivo indicado na Tabela de Materiais antes de se precisar limpar o filtro (ver passo 2.3 abaixo para o protocolo de limpeza).
      1. Monte um circuito de filtração com tubulação #16 de baixa ligação/baixa lixiviação, 1/8 de polegada de mangueira-barba para adaptadores Luer, o dispositivo TFF e uma bomba peristáltica, conforme indicado na Figura Suplementar S2.
        NOTA: Realize TFF dentro de um gabinete de biossegurança para minimizar o risco de contaminação da preparação do EV com bactérias ambientais.
      2. À temperatura ambiente, comece a circular o meio filtrado e condicionado a aproximadamente 200 mL/min (mínimo de 100 mL/min). Determinar o RPM apropriado correspondente à vazão desejada bombeando 200 mL de PBS para um recipiente graduado. Ao circular um meio filtrado e condicionado, recolher as moléculas <100 kDa que atravessam a membrana de ultrafiltração como resíduos num recipiente separado.
        NOTA: O exemplo abaixo assumirá um volume inicial de 2 L de cultura.
      3. Continue a circular o meio condicionado até que seu volume tenha sido reduzido para ~ 100-200 mL. Mude-se para embarcações menores, conforme necessário. Dilua 2 vezes com PBS e continue a circular com a bomba, concentrando-se até 75-100 mL. Diluir 2 vezes com PBS e continuar a circular até um volume final de 25 ml. Diluir 2 vezes com PBS e continuar a circular até <10 ml.
      4. Levante a tubulação de alimentação para fora do reservatório de amostra e continue a bombear para purgar o filtro e recuperar a quantidade máxima de amostra.
        Observação : este é um ponto de parada potencial.
      5. Transferir a amostra concentrada para um tubo cónico e conservar durante a noite a 4 °C, se assim o desejar. Como alternativa, continue com o protocolo.
      6. Mover a amostra concentrada para um dispositivo de ultrafiltração centrífuga MWCO de 15 mL com capacidade de 100 kDa. Centrífuga em um rotor de caçamba oscilante a 4 °C e 2.000 × g por intervalos de 15-30 min até que o volume do meio no reservatório superior tenha sido concentrado em <2 mL.
        Observação : este é um ponto de parada potencial.
      7. Transfira o meio concentrado para um tubo de baixa ligação a proteínas e armazene a 4 °C durante a noite, continuando o protocolo no dia seguinte, se desejado.
  3. Limpeza do dispositivo TFF (opcional)
    NOTA: A taxa de filtração diminui à medida que o dispositivo TFF começa a "entupir" durante o processo (incrustação). Se necessário, o dispositivo de filtro pode ser limpo para facilitar a filtração de amostras adicionais na mesma operação de purificação. Embora teoricamente possível, um filtro TFF limpo não foi usado para uma execução de purificação diferente para evitar a contaminação cruzada.
    1. Para limpar, remova todos os tubos e tampas do dispositivo TFF e drene qualquer líquido residual.
    2. Use a bomba peristáltica e a tubulação para inundar os compartimentos interno e externo do dispositivo TFF (ou seja, através das portas paralelas e perpendiculares no modelo listado na Tabela de Materiais) com ~100 mL de água destilada. Remova todas as tubulações/tampas e drene o dispositivo TFF.
    3. Tampar as portas externas (perpendicular, filtrado) e circular 250 mL de etanol a 20% em água destilada a >200 mL/min por 10 min através do compartimento interno. Drene, inunde com água destilada e escorra novamente como acima.
    4. Circular 250 ml de solução fresca de NaOH 0,5 N durante 30 minutos através do compartimento interior e escorrar novamente.
    5. Reconecte todas as tubulações e tampas às portas de entrada, saída e filtrado, como na Figura Suplementar S2, e circule novamente a solução de NaOH 0,5 N até que um volume de NaOH > área de superfície do filtro de 1 mL/cm2 permeie através da membrana do filtro e seja coletado como filtrado/resíduo.
    6. Lave o dispositivo TFF com água destilada como acima. Use o dispositivo TFF imediatamente ou inunde o dispositivo com ~100 mL de etanol a 20% e armazene durante a noite a 4 °C.
      NOTA: Se armazenado em etanol, certifique-se de drenar, enxaguar com água, drenar e circular 250 mL de PBS através do dispositivo até que um volume de >1 mL/cm2 de área de superfície do filtro permeie através da membrana do filtro e seja coletado como filtrado/resíduo para remover o etanol residual antes do processamento da amostra.
  4. Cromatografia de exclusão de tamanho (SEC)
    NOTA: SEC é usado para aumentar a pureza dos EVs e remover proteínas não vesiculares.
    1. Use uma pequena coluna SEC (volume de leito de 10 mL) para o isolamento de EVs de <100 mL de matéria-prima e uma coluna maior (volume de leito de 47 mL) para o isolamento de EVs de >100 mL de material de partida.
      Observação : O exemplo abaixo listará volumes para a coluna maior, com volumes para a coluna menor entre parênteses.
    2. Traga a coluna SEC e PBS à temperatura ambiente durante várias horas. Estabilize a coluna SEC em uma posição vertical usando um suporte e suporte de laboratório padrão. Alternativamente, use suportes de coluna de cromatografia comercial.
    3. Antes de se conectar à coluna SEC, hidrate o reservatório da amostra permitindo que 5 mL de PBS fluam através da frita e para um recipiente de resíduos. Desparafuse a tampa de entrada da coluna SEC, adicione 2 mL de PBS ao reservatório da amostra e conecte cuidadosamente o reservatório à coluna à medida que o PBS estiver escorrendo pela frita (não aplicável a pequenas colunas SEC).
      NOTA: Esta etapa anterior evita que quaisquer bolhas de ar fiquem presas na parte superior da coluna SEC. Se o ar estiver preso, remova o reservatório, toque na coluna para retirar a bolha de ar e repita o procedimento de conexão. Para a coluna menor, basta destampar a parte superior da coluna SEC e anexar o funil de amostra.
    4. Adicione 47 mL (10 mL) de PBS ao reservatório da amostra e destampe o fundo da coluna SEC. Permita que todo o buffer de amostra carregado flua através da coluna para equilíbrio. Descarte o fluxo.
    5. Carregue um máximo de 2 mL (0,5 mL) de amostra no reservatório da amostra, descarte o fluxo e permita que a amostra entre completamente na coluna.
    6. Adicionar imediatamente PBS ao reservatório ou funil da amostra a um volume de 14,25 ml menos o volume da amostra (3 ml menos o volume da amostra, para a coluna pequena). Deixe a solução fluir através da coluna e descarte essa quantidade igual ao volume vazio da coluna.
      NOTA: Para uma amostra típica de 2 mL, a quantidade de PBS a ser adicionada ao reservatório ou funil da amostra será de 12,25 mL.
    7. Posicione um microtubo de baixa ligação de 2 mL diretamente abaixo da coluna SEC. Adicione imediatamente 2 mL (0,5 mL) de PBS ao reservatório da amostra e deixe-o entrar na coluna. Rotule estes primeiros 2 mL (0,5 mL) de fluxo como Fração 1. Continue a adicionar 2 mL (0,5 mL) de cada vez ao reservatório da amostra para coletar cada fração subsequente.
      NOTA: A maioria dos EVs bacterianos eluem nas primeiras 5 frações. Durante a otimização, as primeiras 12 frações foram coletadas.
    8. Armazenar as fracções a 4 °C para armazenagem a curto prazo (dias) ou -80 °C para armazenagem a longo prazo.
    9. Limpeza e armazenamento das colunas SEC reutilizáveis
      NOTA: As colunas SEC descritas neste protocolo podem ser reutilizadas até 5 vezes de acordo com o fabricante. Se a taxa de fluxo das colunas SEC diminuir após os usos de <5, o fabricante recomenda centrifugar as amostras concentradas a 10.000 x g por 10 minutos para limpar quaisquer agregados antes da SEC. Em seguida, carregue o sobrenadante dessa centrifugação na coluna SEC para isolamento de EV.
      1. Para limpar e armazenar a coluna SEC após cada uso, adicione 2 mL (0,5 mL) de NaOH 0,5 M e deixe que ela entre completamente na coluna. Passe 100 mL (20 mL) de etanol a 20% pela coluna e armazene-o a 4 °C até o próximo uso. Antes do próximo uso, equilibre o etanol à temperatura ambiente como acima e troque-o pelo tampão PBS passando mais 150 mL (30 mL) de PBS através da coluna.
      2. Para limpar e reutilizar imediatamente a coluna SEC após cada uso, adicione 2 mL (0,5 mL) de NaOH 0,5 M e permita que ela entre completamente na coluna. Execute aproximadamente 150 mL (30 mL) de tampão PBS para lavar o NaOH. Quando o pH do eluato é igual ao PBS (~7), uma nova amostra pode ser carregada.

3. Controle de qualidade da preparação do EV

  1. Teste de esterilidade
    NOTA: Como esses EVs vêm de culturas bacterianas, é fundamental garantir a esterilidade antes do uso a jusante.
    1. Obter 100 μL (20 μL) das frações a serem utilizadas nos ensaios e inocular 3 mL do meio utilizado para o cultivo das bactérias de origem. Cultivar sob as respectivas condições ótimas por pelo menos 3 dias e observar a turbidez. Alternativamente, aplique as amostras de fração em placas de ágar contendo o meio usado para cultivar as bactérias produtoras e procure a formação de colônias.
      NOTA: Se a contaminação bacteriana for detectada, não é recomendado o uso da preparação EV para experimentação. Em vez disso, repita o isolamento, tomando cuidado para minimizar o risco de contaminação bacteriana (a) realizando centrifugação/filtração suficiente do meio de cultura de células bacterianas condicionadas, (b) usando frascos limpos, tubos, filtros e colunas de cromatografia e (c) empregando técnicas assépticas apropriadas.
  2. Quantificação de proteínas
    NOTA: Foi utilizado um kit de quantificação de proteínas à base de fluorescência de alta sensibilidade (ver Tabela de Materiais). O kit funciona com um fluorímetro proprietário correspondente em comprimentos de onda de excitação/emissão de 485/590 nm.
    1. Leve todos os reagentes, padrões e amostras à temperatura ambiente.
    2. Preparar uma mistura mestra de reagente proteico e tampão adicionando 1 μL do reagente a 199 μL de tampão para cada amostra e padrão a ser ensaiado. Usando tubos de PCR de 0,5 mL de paredes finas, adicione 10 μL padrão + 190 μL de mistura mestra a cada tubo padrão.
      NOTA: Para estar dentro do intervalo do ensaio, a quantidade de cada fracção a adicionar a cada tubo de amostra depende do rendimento proteico esperado da purificação. Tipicamente, foram utilizados 5 μL de cada fração + 195 μL de master mix. O volume final de amostra + mistura principal deve ser de 200 μL.
    3. Vórtice os tubos de ensaio e incube por pelo menos 15 minutos à temperatura ambiente no escuro.
    4. Meça os padrões no fluorímetro proprietário apropriado (consulte a Tabela de Materiais) selecionando a opção Ensaio de proteína usando os botões de seta e pressionando o botão GO para confirmar. Siga as instruções na tela, inserindo cada tubo padrão e pressionando GO.
    5. Inserir o tubo de amostra experimental; pressione GO para ler; e observe o resultado exibido, que é a concentração real de proteína na mistura tampão de ensaio/amostra. Para obter a concentração de proteína na amostra, use as teclas de seta para selecionar a opção Calcular concentração da amostra, pressione GO e use as teclas de seta para selecionar o volume da amostra adicionado ao buffer de ensaio para a amostra fornecida. Pressione GO e registre a concentração de proteína da amostra. Repita esta etapa para cada amostra a ser analisada.
  3. Contagem de partículas e distribuição de tamanho
    NOTA: O sensor de pulso resistivo microfluídico (MRPS) foi utilizado para quantificar a concentração de EV e a distribuição de tamanho.
    1. Diluir as amostras em PBS suplementado com Tween-20 a 1% que tenha sido filtrado através de um filtro de seringa de 0,02 μm até uma concentração de proteína de aproximadamente 0,1 μg/mL.
      NOTA: O objetivo da diluição é atingir uma concentração de partículas esperada na faixa de 10a 10 partículas/mL em frações contendo EV. A diluição ideal pode precisar ser determinada empiricamente. Poucos EVs são esperados para frações posteriores (além da Fração 6). Assim, a concentração de partículas provavelmente será de <10a 10 partículas/mL, apesar de analisar em baixas diluições.
    2. Carregue 3 μL de cada amostra no cartucho microfluídico descartável com uma micropipeta, insira o cartucho no instrumento MRPS e pressione o botão de metal com um aro azul iluminado.
    3. Clique em Go! no software de aquisição e aguarde que a amostra seja analisada pelo instrumento. Adquira de 1.000 a 10.000 eventos de partículas para minimizar o erro estatístico técnico de análise. Neste ponto, clique em Parar e Terminar Execução para concluir a aquisição de exemplo.
      NOTA: Juntamente com os arquivos de dados brutos, o instrumento produz uma planilha de resumo listando a concentração de partículas na amostra. Correctar este valor de acordo com a diluição da amostra efectuada.
    4. Usando software de análise, carregue os dados brutos e gere gráficos personalizados de distribuição de tamanho.

4. Armazenamento EV

  1. Aliquotar fracções individuais ou agrupadas a 25-50% do tamanho da fracção individual (dependendo do tamanho da coluna utilizada) em tubos de baixa ligação às proteínas e conservar a -80 °C para evitar ciclos de congelamento-descongelamento.
    NOTA: Aplicações diferentes podem exigir alíquotas menores ou maiores, dependendo da quantidade esperada utilizada em cada experimento. Isso precisará ser determinado empiricamente. As frações não contendo EV podem ser descartadas se não forem aplicáveis aos objetivos da pesquisa.

5. Microscopia eletrônica de transmissão

  1. Coloração negativa
    1. Adicionar 5 μL da amostra EV à grelha de malha de cobre revestida de carbono 400 e incubar à temperatura ambiente durante 10 minutos. Lavar o lado do provete com 5 gotas de tampão Tris de 5 mM (pH 7,1) e, em seguida, com 5 gotas de água destilada.
    2. Lado da mancha do espécime com 5 gotas de acetato de uranila a 2%. Limpe qualquer quantidade extra de mancha com papel de filtro e permita que a grade seque completamente por várias horas ou durante a noite. Visualize os espécimes com um microscópio eletrônico operado a 80 kV.
  2. Rotulagem Immunogold
    1. Aplicar 10 μL da suspensão EV numa grelha de malha formvar/carbono 400 e incubar à temperatura ambiente durante 1 h. Lave a grade em PBS três vezes e, em seguida, aplique 4% de paraformaldeído por 10 min para fixar a amostra. Lave as grades cinco vezes com PBS.
    2. Bloquear a grade com três lavagens de PBS contendo albumina sérica bovina (BSA) a 0,1%. Em seguida, aplique 10 μL de um anticorpo primário por 40 min à temperatura ambiente (aqui, 1 μg/mL de anticorpo nluc). Lave novamente três vezes com PBS contendo 0,1% de BSA.
    3. Adicione 10 μL de anticorpo secundário marcado com ouro à grelha e incube durante 40 minutos à temperatura ambiente. Lave as grades três vezes com PBS.
      NOTA: Aqui, um anticorpo anti-rato de cabra conjugado com nanopartículas de ouro de 10 nm foi utilizado após diluição de 1:10 em tampão de bloqueio. Se a marcação de ouro obscurecer a visualização de EV, anticorpos secundários com nanopartículas de ouro menores (por exemplo, 5 nm) podem ser usados.
    4. Pós-fixe a grade com 10 μL de glutaraldeído a 2,5% por 10 min à temperatura ambiente. Lave três vezes em PBS. Realizar coloração negativa com acetato de uranila a 2% (10 μL) por 15 min. Incorporar as amostras em 10 μL de acetato de uranilo a 0,5% e solução de metilcelulose a 0,13% por 10 min.
    5. Permita que as grades da amostra sequem durante a noite à temperatura ambiente antes da imagem no microscópio eletrônico.
    6. No software de aquisição do microscópio, determine a exposição empiricamente para obter a qualidade ideal da imagem (por exemplo, 0,80851 s nesta configuração específica) e ajuste-a digitando esse valor na caixa de opção de tempo de exposição . Selecione a opção de 80 kV e clique em Iniciar aquisição para capturar a imagem.

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Resultados

Para avaliar quais frações de cromatografia SEC foram enriquecidas para EVs, a coluna SEC foi carregada com 2 mL de meio de cultura condicionado por E. coli MP1 que havia sido concentrado 1.000 vezes por TFF, e frações sequenciais foram coletadas. Utilizando MRPS, verificou-se que as frações 1-6 continham a maioria dos EVs (Figura 2A). As frações subsequentes continham muito poucos EVs, compreendendo em vez de proteínas livres de EV (Figura 2B). Os EVs ...

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Discussão

No protocolo acima, é descrito um método que é escalável e isola de forma confiável os EVs de várias bactérias gram-negativas/positivas e aeróbicas/anaeróbias. Tem vários pontos de parada potenciais ao longo do procedimento, embora seja melhor evitar levar mais de 48 h para isolar os EVs dos meios de cultura bacteriana condicionados.

Primeiro, consiste em cultivar bactérias para gerar meio de cultura bacteriana condicionado. Verificou-se que aumentar o tempo de cultura para pelo menos 48 h e u...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

A pesquisa descrita acima foi apoiada pela bolsa de treinamento NIH TL1 TR002549-03. Agradecemos aos Drs. John C. Tilton e Zachary Troyer (Case Western Reserve University) por facilitarem o acesso ao instrumento analisador de tamanho de partícula; Lew Brown (Spectradyne) para assistência técnica com análise dos dados de distribuição de tamanho de partícula; Dr. David Putnam na Universidade de Cornell por fornecer plasmídeo pClyA-GFP14; e o Dr. Mark Goulian da Universidade da Pensilvânia por nos fornecer a E. coli MP113.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,5 mL de tampa plana, tubos de PCR de paredes finasThermo Scientific3430é importante usar tubos de PCR de paredes finas para obter leituras precisas com solução
aquosa de paraformaldeído (formaldeído) Qubit 16%Ciências de microscopia eletrônica15700
250 mL Frascos de centrífuga de polipropileno FiberliteThermoFisher010-1495
Garrafas centrífugas de polipropileno Fiberlite de 500 mLThermoFisher010-1493
Adaptador de garrafa de polipropileno de 65 mm com fundo redondo/cônicoBeckman Coulter392077Permite que o Vivacell se encaixe no rotor
Akkermansia mucinophilaATCCBAA-835
Amicon-15 (100 kDa MWCO)MilliporeSigmaUFC910024
Avanti J-20 Centrífuga XPIBeckman CoulterNão é mais vendida pela Beckman. Avanti J-26XP é o modelo contemporâneo mais próximo.
Bacteroides thetaiotaomicron VPI 5482ATCC29148
Bifidobacterium breveNCIMBB8807
Bifidobacterium dentiumATCC27678
Caldo de infusão de coração cerebral (BHI) HimediaM2101Após a autoclavagem, tanto o caldo BHI quanto o ágar foram introduzidos na câmara anaeróbica, suplementados com Menadiona (1 µ g/L), hematin (1,2 µ g/L) e Cloridrato de L-cisteína (0,05%). Eles foram então incubados por pelo menos 24 h em condições anaeróbicas antes da inoculação com as cepas bacterianas anaeróbicas.
Cartucho de microfluídica C-300Spectradyne
CloranfenicolMP BiomedicalsICN19032105
Microscópio eletrônicoEmpresa FEITecnai G2 SpiritBT
em>Escherichia coli HST08 (células competentes de Steller)Takara636763
Escherichia coli MP1Dr. Mark Goulian (presente)bactérias comensais derivadas do intestino de camundongo
Fiberlite 500 mL para 250 mL adaptadorThermoFisher010-0151-05usado com rotor Fiberlite para permitir que garrafas de 250 mL sejam usadas para tamanho menor de cultura bacteriana inicial
Rotor de centrífuga de ângulo fixo FiberliteThermoFisherF12-6x500-LEXse encaixa em 6 garrafas de 500 mL
Formvar Carbon Film 400 Mesh, CopperElectron microscopy sciencesFCF-400-
Glutaraldeído (EM-grau, solução aqeous a 10%)Ciências de microscopia eletrônica16100
HematinChemCruz207729BA solução estoque foi feita em solução de L-histidina 0,2 M como  1,2 mg/mL
Infinite M Nano+ Leitor de microplacasTecanEste equipamento foi usado para medir a fluorescência mCherry
In-Fusion  HD Cloning PlusTakara638909Para clonagem dos fragmentos de PCR nos vetores com linha de PCR
JS-5.3 AllSpin Swinging-Bucket RotorBeckman Coulter368690
Lauria Bertani (LB) caldo, MillerDifco244620
Cloridrato de L-cisteínaJ.T. Baker2071-05Deve ser pesado e adicionado diretamente ao meio BHI autoclavado dentro do anaeróbico
Encaixe Masterflex de câmara, Polipropileno, Reto, Fêmea Luer para Adaptador de Farpa de Mangueira, 1/8" ID; 25/PKcole-parmer -HV-30800-08para circuito de tubulação de filtração
Encaixe Masterflex, Polipropileno, Reto, Macho Luer para Adaptador de Barb de Mangueira, 1/8" ID; 25/PKcole-parmer -HV-30800-24para circuito
de tubulação de filtraçãoAcionamento de Console de Velocidade Variável Analógica Masterflex L/S, 20 a 600 rpmMasterflexHV-07555-00
Cabeçote de Carga Fácil Masterflex L/S para Tubulação de Precisão, 4 Rolos, Carcaça PARA, Rotor SSMasterflexEW-07514-10
Tubulação de Bomba de Precisão Masterflex L/S, PharmaPure, L/S 16; 25 pésCole PalmerEW-06435-16tubulação de baixa ligação/baixa lixiviação
Menadiona (Vitamina K3)MP102259solução de estoque foi feita em etanol como 1 mg / mL
MIDIKROS 41,5 CM 100K MPES 0,5 MM FLL X FLL 1 / PKRepligenD04-E100-05-NTFF dispositivo que usamos para filtrar até 2 L de sobrenadante de cultura de E. coli
Sistema de ensaio de luciferase Nano-Glo PromegaN1110Este kit de ensaio foi usado para medir a luminescência do anticorpo de lucferase da proteína repórter nluc
NanoLuc (Nluc), clone 965808R& D SystemsMAB10026
nCS1 instrumento de detecção de pulso resistivo microfluídicoSpectradyne
nCS1 ViewerSoftwarepara distribuição de tamanho de partícula
OneTaq 2x Master Mix com tampão padrãoNEBM0482DNA polimerase master mix usado para realizar as reações de PCR de rotina para verificação de colônias
Protein LoBind, 2,0 mL, PCR tubos limposEppendorf30108450
Q5 High-Fidelity 2x Master MixNEBM0492DNA polimerase master mix usado para realizar as reações de PCR necessárias para clonagem
qEV original, volumede carga máxima Izon de 35 nm de 0,5 mL
volume máximo de carga de 2 mL
Fluorômetro QubitThermoFisherItem não está mais disponível. O produto mais próximo disponível é o Qubit 4.0 Fluorometer (cat. Não. Q33238)
Kit de ensaio de proteína qubitThermoFisherQ33211Armazene o kit em temperatura ambiente. Os padrões são armazenados a 4 °C.
Centrífuga Sorvall Lynx 4000ThermoFisher75006580
SpectraMax i3x Leitor de microplacasDispositivos molecularesEste equipamento foi usado para medir a bioluminescência da nanoluciferase
Sistema de filtração a vácuo estéril Stericup Quick-release-GP (150, 250 ou 500 mL)MilliporeSigmaS2GPU01RE
S2GPU02RE
S2GPU05RE		Um ou vários filtros podem ser usados para acomodar volumes de trabalho. Em nossa experiência, você pode filtrar o dobro do volume listado no tamanho do produto.
Acetato de uranilaCiências de microscopia eletrônica22400
Câmara anaeróbica de vinilCoy Lab
Vivacell 100, 100.000 MWCO PESSartoriusVC1042
Filtros de seringa Whatman Anotop 10 Plus (0,02 mícron)MilliporeSigmaWHA68093002para filtrar o diluente MRPS
< adaptadores de conexão especiais adaptadores de conexão especiais de análise de espectros qEV rack Izon para uso com as colunas SEC qEV-original qEV-2, 35 nm Izon

Referências

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