Uma plataforma aprimorada para a cultura de embriões integrais permite o desenvolvimento contínuo e robusto do ex útero de embriões de camundongos pós-implantação por até seis dias, desde estágios de pré-estresculação até organogênese avançada. Neste protocolo, detalhamos o procedimento padrão para a cultura de embriões bem sucedida usando placas estáticas e sistemas de garrafas rotativas.
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Artigo de método
Ex Utero Cultura de Embriões de Camundongos de Pregastrulation a Organogênese Avançada
Neste artigo
Resumo
Resumo
Métodos de cultura de embriões de mamíferos pós-postistas têm sido geralmente ineficientes e limitados a breves períodos após a dissecção fora do útero. Plataformas foram recentemente desenvolvidas para uma cultura ex utero altamente robusta e prolongada de embriões de camundongos desde estágios de cilindro de ovo até organogênese avançada. Essas plataformas permitem o desenvolvimento adequado e fiel de embriões pré-struladores (E5.5) até o estágio de formação de membros traseiros (E11). Embriões gastrulating tardios (E7.5) são cultivados em garrafas rotativas nessas configurações, enquanto a cultura estendida dos estágios de pré-estresculação (E5.5 ou E6.5) requer uma combinação de culturas estáticas e rotativas de garrafas. Além disso, regulação sensível da concentração de O2 e CO2 , pressão do gás, níveis de glicose e o uso de um meio específico de cultura ex utero são fundamentais para o desenvolvimento adequado de embriões. Aqui, é fornecido um protocolo passo-a-passo detalhado para a cultura estendida do embrião de camundongos ex-útero . A capacidade de cultivar embriões normais de camundongos ex utero de gastrulação à organogênese representa uma ferramenta valiosa para caracterizar o efeito de diferentes perturbações experimentais durante o desenvolvimento embrionário.
Introdução
O desenvolvimento intrauterino do embrião mamífero limitou o estudo dos estágios iniciais do desenvolvimento pós-implantação1,2. A inacessibilidade do embrião em desenvolvimento dificulta a compreensão dos principais processos de desenvolvimento que ocorrem após os implantes de embriões no útero, como o estabelecimento do plano corporal animal, especificação das camadas germinativas ou a formação de tecidos e órgãos. Além disso, o tamanho muito pequeno do embrião postimplantado precoce dificulta a observação por imagem intravital no útero antes do E103. A incapacidade de observ....
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Protocolo
Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com as Diretrizes de Proteção Animal do Instituto Weizmann de Ciência e aprovados pelo relevante Instituto Weizmann IACUC (#01390120-1, 01330120-2, 33520117-2). Mulheres grávidas saudáveis foram solicitadas a dar seu consentimento informado para coletar sangue de seu cordão umbilical, conforme aprovado pelo Comitê de Helsinque do Centro Médico de Rambam (#RMB-0452-15). Foram solicitados aos adultos saudáveis seu consentimento informado para ter sangue coletado de acordo com as diretrizes do Comitê de Helsinque do Instituto Weizmann de Ciência (#1566-3).
1. Preparação da mídia....
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Resultados
As condições de cultura do rolo descritas para embriões E7.5 (estágio de gastrulação tardia) suportam o crescimento constante e normal do embrião com uma eficiência média próxima de 75% após 4 dias de cultura (Figura 2 e Tabela 1). A eficiência do desenvolvimento de embriões pode variar entre diversos antecedentes genéticos de camundongos, mas é consistentemente robusta (Figura 2C). A suplementação com HBS em vez de HCS produz uma eficiência de .......
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Discussão
O protocolo cultural aqui apresentado pode sustentar o desenvolvimento adequado e contínuo do embrião do camundongo ex utero por até seis dias, de E5.5 a E11. Anteriormente, os embriões nessas etapas de desenvolvimento podiam desenvolver-se normalmente na cultura apenas por curtos períodos (até 48 h)15. O acoplamento do módulo de regulação do gás à incubadora de cultura de rolo para controle preciso da concentração de oxigênio e pressão do gás hiperbárico é fundamental para a cultura adeq.......
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Divulgações
J.H.H é conselheiro da Biological Industries Ltd e apresentou um pedido de patente cobrindo as condições de cultura do rolo e estática descritas aqui (arquivado por J.H.H. e pelo Instituto Weizmann de Ciência). Outros autores não declaram interesses concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado por Pascal e Ilana Mantoux; Conselho Europeu de Pesquisa (ERC-CoG-2016 726497-Cellnaivety); Conselho de Pesquisa Médica da Comissária de Bordo (FAMRI); Israel Cancer Research Fund (ICRF), BSF, Helen e Martin Kimmel Institute for Stem Cell Research, Helen and Martin Kimmel Award for Innovative Investigation; Israel Science Foundation (ISF), Minerva, o Instituto Sherman de Química Medicinal, Nella e Leon Benoziyo Center for Neurological Diseases, David and Fela Shapell Family Center for Genetic Disorders Research, Kekst Family Institute for Medical Genetics, Dr. Beth Rom-Rymer Stem Cell Research Fund, Edmond de Rothschild Foundations, Zantke....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,22 µ Filtro de tamanho de poro m (250 mL) | JetBiofil | FCA-206-250 | |
| 0.22 µ seringa de tamanho de poro m Filtro PVDF | Millipore | SLGV033RS | |
| 8 placas de vidro com fundo de vidro de 8 poços/ibiTreat | iBidi | 80827/80826 | |
| Garrafa com tampa adaptadora para entrada de gás | Arad Technologies | ||
| Bungs (Hole) | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 06 | Usado para selar as garrafas ao tambor |
| Bungs (Sólido) | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 07 | Usado para selar o tambor rotativo |
| Garrafas de cultura | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 03/BTC 04 | Garrafas de vidro (pequenas) BTC 03 ou garrafas de vidro (grandes) BTC 04 |
| D(+)-glicose monohidratada | J.T. Baker | ||
| Faca de diamante | Fine Science Tools | 10100-30/45 | |
| Manômetro digital | Shanghai Benxu Electronics Technology co. Ltd | BX-DPG80 | |
| DMEM | GIBCO | 11880 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Salino | Biológico | indústrias 02-020-1A | |
| Soro bovino fetal | Indústrias biológicas | 04-013-1A | |
| Módulo de regulação de gás | Arad Technologies | HannaLab1 | |
| Glutamax | GIBCO | 35050061 | glutamina |
| Graefe fórceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| HEPES | GIBCO | 15630056 | |
| Pinça microcirúrgica (Dumont #5, #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Pipetas Pasteur (vidro) | Pipetas Hilgenberg | 3150102 | |
| Pasteur (plástico) | Alexred | SO P12201 | |
| Penicilina/Estreptomicina | Indústrias biológicas | 03-031-1B | |
| Placas de Petri (60 mm e 100 mm) | Falcon | 351007/351029 | |
| Sistema de incubadora de precisão | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC01 | Modelo BTC01 com kit de borbulhador de gás |
| Tubos de ensaio estéreis pró-coagulantes (5 mL) | Greiner Bio-One | #456005 | |
| Soro de cultura de embriões inteiros de rato | ENVIGO Bioproducts | B-4520 | |
| Microscópio estereoscópico equipado com placa de aquecimento | Nikon | SMZ18 | |
| Seringas estéreis (5, 10 ml) para filtração de soro | Pic Solution | ||
| Tesoura cirúrgica | Ferramentas de ciências finas | 14094-11 |
Referências
- New, D. A. Whole-embryo culture and the study of mammalian embryos during organogenesis. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 53 (1), 81-122 (1978).
- Tam, P. P., Behringer, R. R. Mouse gastrulation: the....
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Reimpressões e permissões
