Cromatografia ultra-alta-performance semi-direcionada acoplada à análise de espectrometria de massa de metabólitos fenólicos no plasma de idosos adultos

Sarcopenia é um transtorno esquelético progressivo relacionado à perda acelerada de músculos na população idosa. Essa condição aumenta o risco de quedas e leva a atividades limitadas da vida diária. A sarcopenia está presente em cerca de 5%-10% das pessoas com mais de 65 anos e cerca de 50% das pessoas com 80 anos ou mais ^{de idade1}. Nenhum medicamentos específicos foi aprovado para o tratamento da sarcopenia, por isso a prevenção com atividade física e uma dieta bem equilibrada é ^{importante1,2}. Intervenções nutricionais com alimentos especialmente formulados enriquecidos com proteína leiteira e aminoácidos essenciais têm mostrado resultados positivos na prevenção da sarcopenia2. Em outros estudos, os autores incluíram vitaminas e antioxidantes, como vitamina E e isoflavonas, na dieta, aumentando os benefícios para o ganho muscular na cintura e nos ^quadris3.

Brosimum alicastrum Sw. (Ramón) é uma árvore que cresce nas regiões tropicais mexicanas; tem sido consumida por culturas maias devido ao seu alto valor ^nutricional4. É uma boa fonte de proteínas, fibras, minerais e antioxidantes fenólicos, como o ácido ^{clorogênico5}. Como pode ser moído em pó e usado em produtos de panificação ou consumidos em bebidas, estudos recentes têm avaliado a incorporação da farinha de sementes de Ramón (RSF) em diferentes alimentos para melhorar seu valor nutricional. Uma bebida com sabor de cappuccino suplementada pela RSF foi formulada, que era rica em fibras alimentares e tinha mais de 6 g de proteína por porção, e era altamente aceita pelos consumidores; assim, considerou-se uma alternativa potencial para atender aos requisitos alimentares ^especiais6. Em um estudo de acompanhamento, a RSF também foi usada para formular um muffin e uma nova bebida rica em proteínas, fibras alimentares, micronutrientes e antioxidantes fenólicos. O muffin e a bebida foram utilizados em uma intervenção dietética para idosos, que consumiram ambos os produtos duas vezes por dia durante 30 dias. Após esse período, o estado nutricional e sarcopenico dos participantes melhorou, e o teor fenólico total do plasma ^aumentou7. No entanto, a determinação dos compostos fenólicos totais no plasma foi realizada por um método espectrofotométrico, de modo que a identificação dos compostos fenólicos reais que foram absorvidos não foi possível; além disso, este método não é completamente específico para compostos fenólicos, de modo que alguma superestimação pode ^ocorrer8.

A identificação e quantificação dos compostos fenólicos que são absorvidos após o consumo de alimentos ricos nesses antioxidantes é uma tarefa difícil, mas é necessária para demonstrar a atividade biológica desses fitoquímicos. A biodisponibilidade da maioria dos compostos fenólicos é baixa; menos de 5% deles podem ser encontrados sem transformação estrutural no plasma. Os compostos fenólicos passam por várias biotransformações, como metilação, sulfonação ou glucuronidação, que são realizadas por enterócitos e hepatócitos9. Compostos fenólicos também são biotransformados pela microbiota em catabólitos bacterianos que podem exercer seus efeitos benéficos no corpo após serem absorvidos pelo ^plasma10. Por exemplo, o ácido fenilacetic é um produto da transformação bacteriana de flavonoides e proanthociaanidinas oligomerícos, que podem inibir até 40% da adesão de bactérias (Escherichia coli) no trato urinário após o consumo de ^cranberry11.

A diversidade estrutural de compostos fenólicos de ocorrência natural, somada à diversidade de seus metabólitos e sua baixa biodisponibilidade, torna sua identificação no plasma ainda mais desafiadora. O perfil metabolômico, utilizando plataformas de análise espectroscópica, como ressonância magnética nuclear (RMN) e espectroscopia de massa tandem (MS/MS), é provavelmente a melhor abordagem para alcançar esse objetivo; infelizmente, o equipamento não é facilmente acessível, e o desenvolvimento de protocolos de análise ainda é ^limitado12. Vários estudos têm relatado a ESM/MS juntamente com um sistema de separação (como a cromatografia líquida) como estratégia para reduzir a complexidade dos espectros de massa em estudos metabolômicos. A recente introdução de métodos de separação de cromatografia líquida de alto desempenho (UPLC) reduziu o tempo de análise e aumentou a resolução e sensibilidade em comparação com os protocolos líquidos convencionais de alto desempenho, de modo que os sistemas UPLC-MS/MS têm sido rapidamente amplamente aceitos pela comunidade de metabolômicas analítica13. Dessa forma, alguns estudos investigaram metabólitos fenólicos e detectaram derivados colacuronidados de ácido cafeína, quercetina e ácido ferúlico, bem como derivados sulfoados de ácido seringa e vanlícita no plasma de indivíduos após a ingestão de ^cranberry14. Protocolos anteriores têm a intenção de encontrar compostos fenólicos e metabólitos fenólicos em biofluidos como plasma. Estes protocolos foram baseados na identificação e quantificação por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) acoplado a um detector ^UV-vis15. No entanto, tais protocolos exigem o uso de padrões autênticos para avaliar a identificação absoluta e quantificação precisa. Uma ampla gama de estudos identificou os metabólitos mais comuns em biofluidos (formas sulfotadas, glucuronidas e metiladas) por UPLC-MS e UPLC-MS/MS; no entanto, grande parte dos metabólitos bacterianos não foi relatada devido à falta de bancos de dados que contenham suas informações ^completas16. A identificação metabólica é complicada pelo custo e disponibilidade comercial das normas metabólitos. Portanto, a melhor estratégia pode ser a análise metabólica MS/MS sem alvo ou semi-direcionada, que se baseia no uso de informações de características moleculares (m/z, massa exata monoisotópica, distribuição isotópica e padrão de fragmentação) para determinar a identidade química e compara-a com bancos de dados on-line livremente disponíveis que contêm metabólitos polifenóis identificados em biofluóides após o consumo de polipólitos-richts12 . As bases de dados mais importantes utilizadas em estudos UPLC-MS/MS para identificação de compostos fenólicos e seus metabólitos são o Human Metabolome Database (HMDB), LipidBlast Library, METLIN Library e outros bancos de dados complementares, como PubChem, ChemSpider e Phenol ^Explorer17.

No presente estudo, foi desenvolvido um método uplc-MS/MS semi-direcionado para analisar as amostras de plasma do grupo de idosos envolvidos no estudo de consumo de muffin e bebidas contendo ^RSF7. Dados de diferentes bancos de dados online gratuitos de metabólitos de plasma foram coletados e integrados em um banco de dados especializado. Este banco de dados pode ser acessado automaticamente pelo software do equipamento para identificar os metabólitos polifenólicos nas cinco amostras de plasma antes e depois da intervenção nutricional de 30 dias. Isso é feito para identificar os principais compostos fenólicos, ou seus metabólitos, que são absorvidos dos alimentos funcionais especialmente formulados projetados para a prevenção da sarcopenia.

As amostras de plasma utilizadas neste protocolo foram coletadas em estudo prévio seguindo todas as diretrizes éticas e aprovadas pelo Comitê de Ética Institucional e Bioética (CIEB-2018-1-37) da Universidad Autónoma de Ciudad Juárez. O protocolo completo para a extração e identificação dos compostos fenólicos e metabólitos no plasma pela UPLC-MS/MS está representado na Figura 1.

Figura 1: Representação esquemática da extração e identificação de compostos fenólicos e metabólitos no plasma pelo método UPLC-MS/MS semi-direcionado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Preparação da amostra

1. Armazene as amostras de plasma a -80 °C até a análise.
2. Descongele as amostras de plasma à temperatura ambiente por 15 minutos.
   NOTA: As amostras podem ser colocadas em banho-maria a 37 °C para acelerar o processo (5 min).
3. Coloque 200 μL de amostra de plasma em um microtubo de 2 mL e misture com 1.000 μL de etanol puro. Vórtice a amostra de plasma para 30 s.
   NOTA: Use sempre luvas ao trabalhar com amostras de plasma.
4. Centrifugar a amostra a 6.580 x g por 5 min. Após a centrifugação, colete o supernatante com uma micropipette ou pipeta Pasteur e coloque-o em um novo microtubo. Armazene o supernatante a 4 °C.
5. Misture a pelota da etapa anterior com 1.000 μL de 100% etanol, vórtice para 30 s e, em seguida, centrífuga a 6.580 x g por 5 min.
   NOTA: A pelota é fortemente embalada e precisa ser bem resuspended bem para garantir o contato entre a amostra e o etanol puro. Recomenda-se o uso de uma micropipette para lavar a pelota com etanol.
6. Após a centrifugação, colete o supernante e misture com o sobrenatante previamente obtido a partir da Etapa 1.4. em um microtubo de 2 mL.
7. Remova o etanol da amostra usando nitrogênio puro (99,997%) a 135 psi. Mantenha a agulha a 1 cm de distância da parte superior do microtubo para evitar a perda da amostra e lave até que a amostra esteja seca. Não é necessário calor para evaporar o etanol.
   NOTA: O fluxo de nitrogênio deve ser baixo para evitar a perda de amostras. Uma vez que o etanol esteja seco, mantenha o fluxo de nitrogênio por pelo menos 5 minutos para garantir o ressecamento da amostra. O protocolo pode ser pausado neste momento; as amostras devem ser armazenadas a -20 °C. Evite armazenar as amostras por mais de 12 h.
8. Resuspenque as amostras secas em 100 μL de uma mistura de acetonitrilo: água em uma proporção de 50:50 (v:v).
9. Filtre a amostra através de uma membrana de seringa de nylon de 0,45 μm diretamente em uma micro inserção de frasco HPLC.
   NOTA: As amostras do frasco podem ser armazenadas a -20 °C antes da análise. Armazene as amostras por não mais do que 8h. Recomenda-se injetar as amostras no sistema UPLC logo após a filtragem.

2. Análise UPLC-MS/MS

1. Injete 3 μL de amostra em um UPLC equipado com uma coluna de fase reversa _C18 (50 mm x 2,1 mm; 1,8 μm). Coloque a temperatura do autosampler a 20 °C e o termostato da coluna a 25 °C. Injete cada amostra em triplicado.
2. Use 0,1% (v:v) ácido fórmico na água como solvente A, e 100% acetonitrilo como solvente B. Definir a taxa de fluxo em 0,4 mL/min e um programa gradiente da seguinte forma: 0-1 min 10% B, 1-4 min 30% B, 4-6 min 38% B, 6-8 min 60% B, 8-8,5 min 60% B, 8,5-9 min 10% B (Tabela 1).
3. Ajuste o espectrômetro de massa para ionização de modo negativo. Use nitrogênio como gás de secagem a 340 °C e uma vazão de 13 L/min. Coloque a pressão do nebulizador em 60 psi. Coloque a tensão capilar em 4.000 V, a tensão fragmentor a 175 V e a tensão skimmer a 65 V. Use energia de colisão a 20 V (Tabela 2).
4. Escaneie as massas entre 100-1100 massas para taxa de carga (m/z) e, para MS/MS, escaneie massas entre 50-1000 m/z (Tabela 2). Defina a aquisição de dados para o modo MS/MS automático. Utilize a seguinte massa de referência: 119.036 e 966.0007.

Tabela 1: Gradiente de fase móvel utilizado para a separação de compostos fenólicos por UPLC.

Tabela 2: Parâmetros de ionização para a análise de MS/MS.

3. Construção de banco de dados

1. Busca por compostos fenólicos, metabólitos fenólicos ou outros compostos de interesse na literatura científica.
2. Abra o software de gerenciamento de banco de dados incluído no sistema UPLC. Selecione | de arquivos Nova biblioteca composta de banco de dados pessoal (PCDL) | Criar novo PCDL. Selecione o tipo de PCDL: Metabolômica LC/MS. Defina um nome para o PCDL. Em seguida, selecione Criar.
3. Na barra de ferramentas, selecione PCDL e, em seguida, a opção Permitir a edição . Em seguida, clique no botão Encontrar compostos .
   NOTA: Por se trata de um novo PCDL, os resultados da tabela estarão vazios. Isso mudará assim que novos compostos forem adicionados ao PCDL.
   1. Adicione compostos à biblioteca de compostos especializados do banco de dados pessoal copiando-os da biblioteca geral do instrumento. Abra o banco de dados existente do instrumento incluído no software de gerenciamento de banco de dados. Clique no botão Encontrar compostos. Na opção de pesquisa Única , insira os critérios de pesquisa compostos para encontrar o composto de interesse.
      NOTA: Os compostos podem ser encontrados pelo nome, fórmula molecular, massa exata e tempo de retenção.
   2. Na tabela de resultados compostos, selecione o composto de juros. Para selecionar mais de um composto, clique no primeiro composto, segure a tecla CTRL e clique em cada composto de interesse. Em seguida, clique com o botão direito do mouse em todos os compostos destacados e selecione Apêndice para PCDL.
   3. Na nova janela, pesquise e selecione o arquivo especializado de banco de dados pessoal. Marque as caixas Inclua espectros para compostos se presentes e Inclua informações de mobilidade de íons para compostos, se presente. Clique no botão Anexar . Na nova caixa de diálogo, selecione Sim para verificar os novos compostos adicionados. Selecione Não para continuar procurando por mais compostos de interesse.
4. Se os compostos de interesse não estiverem disponíveis na biblioteca geral do instrumento, adicione novos compostos manualmente.
   1. Abra o banco de dados pessoal especializado. Uma vez aberto, siga o Passo 3.3. Selecione a opção Editar compostos . Clique no botão Adicionar novo .
   2. Na parte superior da janela, complete as informações para o novo composto. Preencha a fórmula, nome, nome IUPAC, número CAS, ID Chemspider e outros identificadores.
   3. Use as informações disponíveis nas bibliotecas online gratuitas (Chemspider, PubChem e Phenol Explorer) para preencher as informações para o novo composto de interesse. Uma vez terminado, clique no botão Salvar como novo para salvar as novas informações do composto no banco de dados pessoal especializado.
      NOTA: Ao adicionar informações de bibliotecas gratuitas, certifique-se de incluir as informações do composto sem a presença de íons de cloreto ou iodeto. Isso pode modificar a massa exata e a fórmula molecular do composto de interesse.
5. Repita o processo com todos os compostos de interesse para concluir o banco de dados pessoal especializado.

4. Análise de dados

1. Utilize o software qualitativo do instrumento para identificar os compostos fenólicos e metabólitos fenólicos presentes nas amostras.
2. Abra o arquivo de amostra. No painel cromatograma, selecione Definir Cromatogramas e extrair o cromatógrama de íon total (TIC), o íon-cromatgrama extraído de MS (EIC) e o EIC de MS/MS. Selecione a opção de cromatograma integrado.
3. No painel Encontrar compostos , selecione Encontrar por Opções de Fórmula. Na nova janela, selecione A Fonte de Fórmula e, em seguida, a opção Banco de Dados/Biblioteca . Encontre o banco de dados pessoal criado anteriormente e clique em Abrir.
4. Selecione a opção Formula Matching e defina uma tolerância de correspondência em massa de 5 partes por milhão (ppm).
   NOTA: Uma tolerância de correspondência diferente das massas pode ser definida em 10 ppm; essa diferença depende do espectrômetro de massa utilizado.
5. Selecione a opção Íons Negativos e selecione apenas a caixa de diálogo -H . Na opção Resultados , marque o Extrato EIC, Extraia espectro limpo, extraia espectro bruto e inclua caixas de diálogo estrutura.
6. Selecione a opção Filtros de resultado . Mark Warn se o placar for e definir a pontuação em 80,00%. Mark Não corresponde se o placar for e definir a pontuação em 75,00%.
   NOTA: As pontuações de correspondência/não podem ser alteradas para valores mais baixos, se necessário. Isso reduzirá a precisão da identificação.
7. Clique no Find Compounds by Formula para identificar compostos de interesse na amostra.

O processo passo-a-passo para a identificação de metabólitos fenólicos através da análise uplc-MS/MS semi-direcionada, em modo negativo, de amostras de plasma é retratado na Figura 2. Primeiro, o cromatógrama de íon total (TIC) do extrato de fenólicos plasmáticos (obtido após precipitação proteica da amostra de plasma total) foi obtido através do software qualitativo do instrumento. Em seguida, foi utilizado o cromatógrama de íon extraído, e o padrão exato de massa e fragmentação (análise ms/MS) de cada sinal (ou característica molecular) foi comparado com o de um banco de dados pessoal específico criado também no software do instrumento. Sinais com uma combinação de massa de menos de 5 ppm foram atribuídos a uma fórmula molecular do banco de dados. Finalmente, a distribuição isotópica de cada sinal foi comparada com a da fórmula molecular atribuída para alcançar a identificação provisória final. Os compostos que a) foram identificados apenas em uma réplica ou b) apresentaram uma área inferior a 10.000 foram tratados como identificações falsas. A partir desta análise, foram identificados 25 compostos fenólicos e metabólitos nas amostras de plasma (Tabela 3). Nesta lista, foram encontrados compostos fenólicos e seus metabólitos, como ácido 3-hidroxifenilvalerico e isopropílico 3-(3,4-dihidroxifenil)-2-hidroxipropanoato. Uma vez que o modo de ionização negativa é mais adequado para todas as classes de compostos fenólicos, exceto antocianinas, esses compostos não puderam ser detectados com o método atual. Se as antocianinas são componentes importantes da matriz alimentar, o modo positivo também deve ser utilizado.

Tabela 3: Identificação provisória de compostos fenólicos e metabólitos em amostras de plasma pelo método UPLC-MS/MS semi-direcionado.

Para avaliar a eficácia do método projetado para a identificação dos principais compostos fenólicos, ou seus metabólitos, que foram absorvidos do muffin e bebida contendo RSF, foram analisadas cinco amostras de chumbo dos participantes do estudo, obtidas antes e depois da intervenção de 30 dias. A abundância relativa de cada composto foi calculada dividindo a área sob a curva (AUC) após o tratamento pela AUC antes do tratamento. A partir dessa análise, foi possível observar que alguns compostos só apareceram nas amostras obtidas antes do tratamento, outros permaneceram inalterados, enquanto alguns deles aumentaram após o consumo dos alimentos funcionais. A Tabela 4 mostra a lista de 12 compostos fenólicos que apresentaram aumento no plasma após o consumo de 30 dias dos alimentos contendo RSF. O ácido fenílaceso foi o único metabólito encontrado consistentemente em concentrações mais elevadas após o tratamento. Glycitin, uma isoflavona glicosilada, e ácido 3-hidroxifenilvalerico (um metabólito fenólico) aumentaram em três das cinco amostras, mas diminuíram nas outras duas. Gomisin M2, um lignan, foi detectado em três das cinco amostras somente após a intervenção nutricional. Os outros compostos fenólicos (como hesperetina, secoisolariciresinol e vanillina) e metabólitos (como ácido 2-hidroxihippúrico) foram encontrados apenas em uma amostra e somente após o tratamento.

Tabela 4: Lista de compostos fenólicos que aumentaram no plasma de idosos após 30 dias de consumo de alimentos contendo RSF. Os dados são as razões da abundância (AUC) de cada composto após o tratamento em comparação com sua abundância antes do tratamento. T indica que o composto só foi identificado na amostra após o tratamento. Nd: não detectado.

Figura 2: Protocolo para identificação de metabólitos compostos fenólicos por UPLC-MS/MS semi-direcionados. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Todos os autores não declaram conflito de interesses.