Preparação Biológica e Técnica Mecânica para Determinar Propriedades Viscoelásticas de Fibras Zonulares

Resumo

O protocolo descreve um método para o estudo da viscoelasticidade da matriz extracelular e sua dependência da composição proteica ou fatores ambientais. O sistema de matriz alvo é o zonule do rato. O desempenho do método é demonstrado comparando o comportamento viscoelástico das fibraszonulares do tipo selvagem com as que não possuem glicoproteína associada a microfibril-1.

Resumo

A elasticidade é essencial para a função de tecidos como vasos sanguíneos, músculos e pulmões. Esta propriedade é derivada principalmente da matriz extracelular (ECM), a malha proteica que une células e tecidos. Como as propriedades elásticas de uma rede ECM se relacionam com sua composição, e se as propriedades de relaxamento do ECM desempenham um papel fisiológico, são questões que ainda não foram totalmente abordadas. Parte do desafio está na arquitetura complexa da maioria dos sistemas ECM e na dificuldade em isolar componentes ECM sem comprometer sua estrutura. Uma exceção é o zonule, um sistema ECM encontrado no olho de vertebrados. O zonule compreende fibras de centenas a milhares de micrômetros de comprimento que abrangem o espaço livre de células entre a lente e a parede do olho. Neste relatório, descrevemos uma técnica mecânica que aproveita a estrutura altamente organizada do zonule para quantificar suas propriedades viscoelásticas e determinar a contribuição de componentes proteicos individuais. O método envolve dissecção de um olho fixo para expor a lente e o zonule e emprega uma técnica de puxar para cima que estica as fibras zonulares igualmente enquanto sua tensão é monitorada. A técnica é relativamente barata, mas sensível o suficiente para detectar alterações nas propriedades viscoelásticas de fibras zonulares em camundongos sem proteínas zonulares específicas ou com envelhecimento. Embora o método aqui apresentado seja projetado principalmente para estudar o desenvolvimento ocular e doenças, também poderia servir como um modelo experimental para explorar questões mais amplas sobre as propriedades viscoelásticas dos ECM elásticos e o papel de fatores externos como concentração iônica, temperatura e interações com moléculas de sinalização.

Introdução

O olho de um vertebrado contém uma lente óptica viva que ajuda a focar imagens na ^retina1. A lente é suspensa no eixo óptico por um sistema de fibras delicadas e radialmente orientadas, conforme ilustrado na Figura 1A. Em uma extremidade, as fibras se prendem ao equador da lente e, na outra, à superfície do corpo ciliar. Seus comprimentos abrangem distâncias que variam de 150 μm em camundongos a 1 mm em humanos. Coletivamente, essas fibras são conhecidas como o zonule de ^Zinn2, o zonule ciliar, ou simplesmente o zonule. Traumas oculares, doenças e certos distúrbios genéticos podem afetar a i....

Protocolo

Todos os experimentos em animais foram aprovados pelo Comitê de Estudos Animais da Universidade de Washington e aderiram à Declaração ARVO para o Uso de Animais em Pesquisa Oftalmômica e De Visão.

1. Fabricação de peças especializadas e construção de aparelhos

1. Fabricação de peças especializadas
   1. Fabricação da sonda. Segure um capilar de vidro em um ângulo como mostrado no painel esquerdo da Figura 2A. Coloque uma chama de um isqueiro a cerca de 2 cm de uma extremidade e mantenha-a lá até que a extremidade se dobre em 90°, como mostrado no painel direito da ....

Resultados

A técnica de pull-up descrita aqui fornece uma abordagem simples para determinar propriedades viscoelásticas de fibras zonulares em camundongos. Resumindo, o olho do rato é primeiro preservado pela injeção de um fixador na pressão intraocular fisiológica. Essa abordagem mantém a inflação natural do olho e mantém as fibras adequadamente pré-tensionadas (a fixação foi considerada aceitável após experimentos preliminares demonstrarem que não alterou significativamente a elasticidade ou força das fibras). A parte de trás do .......

Discussão

O zonule é um sistema ECM incomum onde as fibras são organizadas simetricamente e podem ser manipuladas de forma idêntica deslocando a lente ocular ao longo do eixo óptico. O espaço também pode ser facilmente acessado sem interrupção celular, permitindo que as fibras sejam estudadas em um ambiente próximo ao seu estado natal. A técnica de pull-up aproveita esta apresentação de ECM para manipular as fibras delicadas de camundongos, um sistema geneticamente tratável, e quantificar com precisão suas propriedades mecânicas. .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Parafusos sextavados de 1/4-20 3/4 de polegada de comprimento	Thorlabs	SH25S075
1/4-20 porca	Loja
Impressora 3D SLA	Anycubic	Photon
4-40 parafusos 3/8 de polegada de comprimento, 2	de loja
, OD 1,2 mm e 3 polegadas de comprimento, sem filamento	WPI	1B120-3
Cianoacrilato (super) cola	Loctite
Balança Digital com precisão de 0,01 g	Vernier	OHAUS Scout 220
Excel	Microsoft		Spreadsheet
Isqueiro
Microscópio de inspeção/dissecação	Amscope	SKU: SM-4NTP	Distância de trabalho ~ 15 cm
Micromanipulador, Economia 4 eixos	WPI	Micrômetro motorizado Kite-L
	Thorlabs	Z812B
Lente cilíndrica negativa	Thorlabs		LK1431L1-75 mm de distância focal
Placas de Petri, suporte de poste de 50 mm
, 3 polegadas	Thorlabs	PH3
Post, 4 polegadas	Thorlabs	TR4
Software de registro de escala	Vernier	LoggePro
	Thorlabs	KDC101
Software do controlador de servo motor	Thorlabs	APT
Base com fenda, 1	Thorlabs	BA1S
Bases com fenda, 2	Thorlabs	BA2
Suporte para micromanipular	WPI	M-10
Câmera USB para microscópio		Amscope SKU: MD500
Cola ativada UV com fonte UV	Amazon

de ferragens capilares de ferragensa gás Controlador de servo motor