O desenvolvimento inicial depende de produtos herdados maternalmente, e o papel de muitos desses produtos é atualmente desconhecido. Neste trabalho, descrevemos um protocolo que utiliza CRISPR-Cas9 para identificar fenótipos de efeito materno em uma única geração.
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Artigo de método
Determinando o papel dos genes materno-expressos no desenvolvimento inicial com crispants maternos
Neste artigo
Resumo
Resumo
O desenvolvimento precoce depende de um conjunto de fatores maternos incorporados ao ovócito maduro durante a oogênese que desempenham todas as funções celulares necessárias para o desenvolvimento até a ativação do genoma zigótico. Normalmente, o direcionamento genético desses fatores maternos requer uma geração adicional para identificar fenótipos de efeito materno, dificultando a capacidade de determinar o papel dos genes expressos maternalmente durante o desenvolvimento. A descoberta das capacidades de edição bialélica da CRISPR-Cas9 permitiu a triagem de fenótipos embrionários em tecidos somáticos de embriões injetados ou "crispants", aumentando a compreensão do papel que os genes zigoticamente expressos desempenham nos programas de desenvolvimento. Este artigo descreve um protocolo que é uma extensão do método crispant. Neste método, a edição bialélica de células germinativas permite o isolamento de um fenótipo de efeito materno em uma única geração, ou "crispants maternos". A multiplexação de RNAs guia para um único alvo promove a produção eficiente de crispants maternos, enquanto a análise de sequência de haploides crispantes maternos fornece um método simples para corroborar lesões genéticas que produzem um fenótipo de efeito materno. O uso de crispants maternos suporta a rápida identificação de genes maternos essenciais expressos, facilitando assim a compreensão do desenvolvimento precoce.
Introdução
Um conjunto de produtos depositados maternalmente (por exemplo, RNAs, proteínas e outras biomoléculas) é necessário para todos os processos celulares iniciais até que o genoma zigótico do embrião seja ativado1. O esgotamento prematuro desses produtos do ovócito é tipicamente letal embrionário. Apesar da importância desses genes no desenvolvimento, o papel de muitos genes expressos maternalmente é atualmente desconhecido. O avanço da tecnologia de edição de genes em peixes-zebra, como o CRISPR-Cas9, possibilita o direcionamento de genes expressos maternalmente 2,3,4. No entanto, a identificação de um fenótipo de efeito materno requer uma geração extra quando comparada a um fenótipo zigótico, necessitando, portanto, de mais recursos. Recentemente, a capacidade de edição bialélica da CRISPR-Cas9 tem sido utilizada para rastrear fenótipos embrionários em tecidos somáticos de embriões injetados (F0), conhecidos como "crispants"5,6,7,8,9,10. A técnica crispante permite a triagem eficiente em termos de recursos de genes candidatos em células somáticas, facilitando a compreensão de aspectos específicos no desenvolvimento. O protocolo descrito neste trabalho permite a identificação de fenótipos de efeito materno, ou "crispants maternos", em uma única geração11. Este esquema é alcançável pela multiplexação de RNAs guia para um único gene e promovendo eventos de edição bialélica na linha germinativa. Esses embriões crispantes maternos podem ser identificados por fenótipos morfológicos macroscópicas e submetidos à caracterização primária, como marcação para limites celulares e padronização do DNA11. A análise combinada do fenótipo observável e a caracterização molecular básica dos INDELs induzidos permitem a previsão do papel do gene alvo no desenvolvimento inicial.
No peixe-zebra, durante as primeiras 24 h pós-fertilização (hpf), um pequeno grupo de células se desenvolve nas células germinativas primordiais, precursoras da linha germinativa12,13,14,15. Nas garras colocadas por fêmeas F0, a proporção de embriões crispantes maternos recuperados depende de quantas células germinativas contêm um evento de edição bialélico no gene alvo. Em geral, quanto mais cedo o evento de edição ocorrer no embrião, maior a probabilidade de mutações CRISPR-Cas9 serem observadas na linha germinativa. Na maioria dos casos, os fenótipos de embriões crispantes maternos vêm da perda de função nos dois alelos maternos presentes no ovócito em desenvolvimento. À medida que o ovócito termina a meiose, um dos alelos maternos é extrudado do embrião através do corpo polar, enquanto o outro alelo é incorporado ao pronúcleo materno. O sequenciamento de múltiplos haploides crispantes maternos representará uma mistura das mutações (inserções e/ou deleções (INDELs)) presentes na linha germinativa que contribuem para o fenótipo11.
O protocolo a seguir descreve as etapas necessárias para criar mutações CRISPR-Cas9 em genes de efeito materno e identificar o fenótipo correspondente usando uma abordagem materna crispante (Figura 1). A seção um explicará como efetivamente projetar e criar RNAs guia, enquanto as seções dois e três contêm etapas críticas para a criação de crispants maternos por microinjeção. Após a injeção da mistura CRISPR-Cas9, os embriões injetados são rastreados para edições somáticas via PCR (secção quatro). Uma vez que os embriões F0 injetados se desenvolvem e atingem a maturidade sexual, as fêmeas F0 são cruzadas para machos selvagens e seus descendentes são rastreados para fenótipos de efeito materno (seção cinco). A seção seis inclui instruções sobre como fazer haploides crispantes maternos que podem ser combinados com o sequenciamento de Sanger para identificar os INDELs induzidos por CRISPR-Cas9. Além disso, a Discussão contém modificações que podem ser feitas no protocolo para aumentar a sensibilidade e o poder desse método.
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Protocolo
Nos estudos que levaram ao desenvolvimento deste protocolo, todos os alojamentos e experimentos de peixe-zebra foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Wisconsin-Madison (IACUC-M005268-R2).
1. Síntese de RNAs Guia
NOTA: Os crispants zigóticos foram criados usando um único RNA guia ou multiplexando múltiplos RNAs guia para um único alvo 5,6,7,8,9,10. A multiplexação de RNAs-guia aumenta a porcentagem de embriões que apresentam fenótipo crispante zigótico10. Devido a esse aumento da frequência de embriões que exibem um fenótipo, os crispants maternos são criados pela multiplexação de quatro RNAs guia para um único gene. Um protocolo mais detalhado sobre o uso do CHOPCHOP para o projeto de RNAs guia e um método de recozimento para sintetizar RNAs guia para peixe-zebra podem ser encontrados em outros lugares 16,17,18,19,20.
- Para identificar um gene expresso maternalmente para o alvo, verifique os níveis de transcrito de mRNA durante o desenvolvimento através de um banco de dados de sequência de RNA que fornece informações de transcriptoma do zigoto a 5 dias21. Em geral, os genes materno-específicos são altamente expressos no embrião inicial e são degradados após a ativação do genoma zigótico22.
- Uma vez que um gene alvo expresso maternalmente tenha sido identificado, determine o primeiro domínio proteico previsto usando a seção "domínios e características" disponível no navegador do genoma Ensembl23. Use este domínio como a região de destino para os quatro RNAs guia.
- Use o programa de seleção de RNA guia CHOPCHOP para identificar quatro locais-alvo de RNA guia no primeiro domínio ativo. Projetar oligonucleotídeos específicos de genes, conforme mostrado abaixo para cada local de destino. No oligonucleotídeo específico do gene, a seção N20 corresponde à sequência alvo menos o sítio PAM (NGG) do CHOPCHOP. Ordene estes oligonucleotídeos específicos de genes e o oligonucleótido constante usando purificação de dessal padrão (ver Tabela de Materiais).
Oligonucleotídeo gene-específico:
5' TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG 3' - Para criar um modelo de RNA guia para cada oligonucleotídeo específico do gene, recozê-lo ao oligonucleotídeo constante e preencher as saliências com T4-DNA polimerase conforme descrito anteriormente16. Depois que os quatro modelos de RNA guia forem montados, purifice-os e concentre-os juntos usando um kit de limpeza e concentrador de DNA de acordo com as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
- Sintetize a mistura de sgRNA a partir do modelo de RNA guia agrupado usando um kit de transcrição T7 in vitro (consulte Tabela de Materiais). Realizar a transcrição in vitro de acordo com as instruções do fabricante. O uso de meias-reações do kit de transcrição T7 pode diminuir o custo por reação.
- Após a síntese de RNA, purificar o pool resultante de sgRNAs utilizando um protocolo de etanol/acetato de amônio, conforme descrito anteriormente 16,20,24. Após o RNA ter sido isolado, ressuscite-o em 20 μL de água livre de nuclease. Se meias-reações do kit de transcrição T7 foram usadas para transcrever o pool de sgRNAs, ressuspense o RNA purificado em 10-15 μL de água livre de nuclease.
- Quantifique a quantidade de sgRNAs agrupados que foram criados usando um espectrofotômetro. Diluir o pool de sgRNAs em água livre de nuclease para uma diluição de 1500 ng/μL ± 500 ng/μL. Normalmente, o volume final da diluição de trabalho varia de 30-50 μL.
- Depois de determinar a concentração do pool de sgRNAs, verifique a integridade dos sgRNAs em um gel de agarose a 1%.
- Lançar um gel de brometo de etídio/TBE a 1% de agarose/0,5 μg/mL. Uma vez que o gel tenha se solidificado, coloque-o no buffer de execução TBE.
- Misture 1 μL da mistura de sgRNA e 1 μL de tampão de carregamento de gel de RNA (ver Tabela de Materiais). Carregue esta amostra no gel e passe o gel a 100 V por 5 min.
- Visualize as bandas usando luz ultravioleta (UV). O pool de sgRNAs deve aparecer como uma única banda. Se um esfregaço for observado, a degradação do RNA provavelmente ocorreu.
- Armazenar o conjunto de sgRNAs em alíquotas de 1 μL de uso único em tubos de tira de PCR sem nuclease no congelador de -80 °C. Para grandes volumes de mistura de sgRNAs (30 μL ou mais), alíquota metade do volume nos tubos de tira de PCR livres de nuclease e armazene a outra metade como um volume maior em um tubo de microcentrífuga livre de nuclease. Descongelar e alíquota quando necessário.
- Para evitar a degradação do ARN, certifique-se de que as amostras no tubo de microcentrífuga não sofram mais do que dois ciclos de congelamento-descongelamento.
2. Preparação de reagentes e materiais para microinjeção
NOTA: No peixe-zebra, a injeção de mRNA Cas9 pode criar crispants zigóticos. No entanto, estudos têm demonstrado que a proteína Cas9 é mais eficiente na criação de INDELs em embriões injetados16,25. Este protocolo usa a proteína Cas9 para gerar crispants maternos porque esta proteína não experimenta o mesmo atraso na atividade que o mRNA Cas9 injetado. Em teoria, isso deve aumentar a probabilidade de uma mutação bialélica no início do desenvolvimento, resultando em uma maior chance de uma seção mais extensa da linha germinativa ser afetada. Outros protocolos e recursos detalhando como se preparar para microinjeções podem ser encontrados em outros lugares24,26.
- Compre ou gere proteína Cas9 (consulte Tabela de Materiais). Ressuscite a proteína Cas9 em água isenta de nuclease para produzir uma solução de 2 mg/mL e uma alíquota de 1 μL em tubos de microcentrífuga de polipropileno livres de RNase. Armazene-os como tubos de uso único a -80 °C.
- Na tarde anterior à injeção, use um extrator de micropipeta para puxar um capilar de vidro e criar uma agulha de injeção. Armazene a agulha ininterrupta em um suporte de agulha fechado até a manhã das microinjeções.
- Para criar uma placa de injeção, despeje 20 mL de agarose/H2O estéril a 1,5% para encher metade de uma placa de Petri de 100 mm X 15 mm e aguarde que ela se solidifique. Uma vez ajustada a solução de agarose, adicione 20 ml de agarose/H2O estéril a 1,5% à placa de Petri e coloque o molde de plástico (ver Tabela de Materiais) na agarose líquida e deixe-a endurecer.
- Depois que a agarose endurecer, remova o molde de plástico e armazene a placa de injeção de cabeça para baixo em uma geladeira até a manhã das injeções. Uma única placa pode ser usada para múltiplas injeções, desde que os poços mantenham sua integridade.
3. Microinjeção de coquetel CRISPR-Cas9 em um embrião de peixe-zebra de uma célula para gerar crispants maternos
NOTA: Mais recursos para microinjeção em embriões de peixe-zebra podem ser encontrados em outros lugares24,26,27. Injetar a mistura CRISPR-Cas9 no blastodisco em desenvolvimento de embriões unicelulares pode aumentar a probabilidade de criar crispants maternos. A mistura também pode ser injetada no saco vitelino até o estágio de 2 células. No entanto, as misturas injetadas na gema dependem do fluxo ooplasmático para atingir o blastodisco, de modo que o CRISPR-Cas9 injetado na gema poderia diminuir a eficiência de corte do CRISPR-Cas928.
- Na tarde anterior às microinjeções, configure cruzamentos do tipo selvagem em caixas de acasalamento de peixe-zebra. Mantenha os peixes machos e fêmeas no mesmo aquário, mas separe-os com um divisor de caixa de acasalamento ou coloque a fêmea dentro de uma inserção de postura de ovos.
- Na manhã do experimento, retirar uma alíquota de 2 mg/mL de proteína Cas9 e uma alíquota do pool de sgRNAs. No tubo de microcentrífuga de polipropileno livre de RNase que contém a proteína Cas9, monte uma mistura de injeção de 5 μL que inclua o pool de sgRNAs, 1 μL de solução vermelha de fenol a 0,5% e água livre de nuclease. Apontar para uma concentração final de 400 ng/μL de proteína Cas9 e 200 ng/μL dos sgRNAs agrupados em água livre de RNase ou uma proporção de 2:1 de proteína Cas9 para sgRNAs no embrião injetado. Esta mistura de injeção pode ser armazenada em gelo durante a manhã da injeção.
- Retire uma placa de injeção do frigorífico e deixe-a aquecer até à temperatura ambiente (RT) durante, pelo menos, 20 minutos.
- Após a montagem do coquetel de injeção, permita que o macho e a fêmea acasalem, por exemplo, removendo o divisor da caixa de acasalamento ou colocando o macho na mesma inserção de postura de ovos que a fêmea, conforme apropriado.
- Depois que o peixe tiver colocado, mas antes que os embriões tenham sido coletados, corte a ponta de uma agulha ininterrupta usando uma nova lâmina de barbear ou pinça fina para criar uma agulha que tenha um furo pequeno o suficiente para evitar danos ao embrião, mas seja larga o suficiente para que não fique entupida com a mistura de injeção. Depois de a agulha ter sido cortada, carregue a agulha com a mistura de injeção utilizando uma ponta de pipeta microcarregadeira inserida na extremidade traseira do capilar (ver Tabelas de Materiais).
- Depois que a agulha estiver cheia, incube a agulha por 5 minutos no RT para montar os complexos de Cas9-sgRNA.
- Ligue o microinjetor e insira a agulha no micromanipulador. Coloque uma gota de óleo mineral em uma lâmina de micrômetro e calibre a agulha ajustando a pressão de injeção até que a agulha ejete um bolo de 1 nL no óleo mineral.
NOTA: Ao injetar no óleo mineral, um bolus de 1 nL terá um diâmetro de aproximadamente 0,125 mm (ou raio de 0,062 mm), conforme medido com a lâmina do micrômetro. - Para sincronizar os embriões, colete-os após 10 min usando um filtro de plástico e enxágue-os em uma placa de Petri usando 1x meio E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4 e adicione 20 μL de 0,03 M de Azul de Metileno por 1 L de 1x E3). Remova 10-15 embriões e coloque-os em uma placa de Petri separada para serem mantidos como controles não injetados.
- Transfira o resto dos embriões em desenvolvimento para os poços da placa de injeção.
- Injetar 1 nL de solução (um total de 400 pg de proteína Cas9 e 200 pg de sgRNAs) no blastodisco em desenvolvimento de um embrião de uma célula. Se a ponta da agulha ficar entupida, use fórceps para quebrar a ponta para trás e recalibre a agulha para ejetar um bolo de 1 nL. Certifique-se de injetar todos os embriões durante os primeiros 40 minutos de desenvolvimento após a fertilização.
- Após a conclusão da injeção, devolva os embriões injetados em uma placa de Petri marcada que contenha 1x meio E3 e permita que eles se desenvolvam ao longo do dia. Remova quaisquer embriões que não estejam fertilizados ou que não estejam se desenvolvendo normalmente de acordo com a série de estadiamento do peixe-zebra29.
4. Rastreio de INDELs somáticos em embriões injetados F0
NOTA: Outros métodos para identificar INDELs, como o ensaio de endonuclease I T7 ou a análise de fusão de alta resolução, podem ser usados para determinar se os embriões contêm INDELs somáticos 30.
- No dia seguinte após as injeções, remova embriões defeituosos e lisados da placa de Petri e substitua o meio 1x E3 para manter a saúde do embrião.
- Depois de limpar o prato, colete seis embriões saudáveis injetados e dois embriões de controle da placa não injetada. Coloque cada embrião individualmente em um único poço de um tubo de tira de PCR e rotule a parte superior dos tubos.
- Para extrair o DNA genômico de embriões individuais, remova o excesso de meios E3 dos poços do tubo de tira e adicione 100 μL de 50 mM de NaOH por poço.
- Incubar os embriões a 95 °C durante 20 min. Em seguida, arrefecer as amostras até 4 °C, adicionar 10 μL de 1 M Tris HCL (pH 7,5) e vórtice durante 5 a 10 s. Este ADN extraído pode ser armazenado a -20 °C durante, pelo menos, 6 meses sem degradação significativa do ADN.
- Projete iniciadores de triagem exclusivos para cada local de guia para amplificar um fragmento de DNA de 100-110 pb que inclui o local alvo CRISPR-Cas9. Se possível, coloque o local de destino no meio do fragmento amplificado, permitindo a identificação de deleções maiores.
- Para cada um dos quatro locais-alvo de guia, configurar oito reações de PCR de 25 μL usando 5 μL do DNA genômico de embrião único preparado, mistura de PCR e os primers de triagem específicos do guia para identificar mutações somáticas no local alvo (Tabela 1).
- Lançar um gel de brometo de etídio/TBE de 2,5% de agarose/0,5 μg/mL usando pentes que criem poços de aproximadamente 0,625 cm de largura. Este pente largo permite uma melhor resolução ao detectar alterações de tamanho na sequência genômica. Depois que o gel se solidificar, coloque-o em uma câmara de eletroforese que contenha tampão de execução TBE.
- Adicione 5 μL de corante de carga 6x ao produto de PCR e carregue 25 μL desta mistura no gel. Certifique-se de que as amostras injetadas e de controle sejam executadas na mesma linha do gel. Depois de todas as amostras terem sido carregadas, adicionar 5 μL de brometo de etídio por 1 L de tampão de corrida TBE à extremidade positiva da caixa de gel.
- Execute o gel a 120 V até que as bandas de DNA se resolvam ou o DNA se aproxime do final da pista. Se o Cas9 criou INDELs no local de destino, um esfregaço é tipicamente observado em amostras injetadas, mas não nos controles.
- Se os esfregaços forem observados em um mínimo de três dos quatro locais de guia em embriões injetados com quatro RNAs guia, cresça os embriões irmãos injetados.
- Sempre que as amostras injetadas não contiverem esfregaços no número necessário de locais de guia, projete novos RNAs guia para substituir aqueles que não funcionaram e crie um novo pool de RNAs guia que inclua os que funcionaram e os recém-projetados. Injete e teste o novo pool para INDELs somáticos, conforme descrito acima.
5. Identificação de fenótipos de efeito materno em embriões maternos crispantados
NOTA: Uma vez que as fêmeas F0 injetadas tenham atingido a maturidade sexual, suas células germinativas têm o potencial de gerar uma mistura de embriões maternos crispantes e do tipo selvagem. Mesmo que essa mistura permita controles internos para fertilização e tempo de desenvolvimento, ainda é benéfico configurar um cruzamento do tipo selvagem como um controle externo no caso de uma embreagem da fêmea F0 conter apenas embriões maternos crocantes.
- Na tarde anterior ao experimento, configure as fêmeas injetadas F0 contra machos do tipo selvagem e controle cruzamentos do tipo selvagem em caixas de acasalamento padrão de peixe-zebra. Coloque os peixes machos e fêmeas no mesmo aquário, mas separe-os com um divisor de caixa de acasalamento ou coloque a fêmea dentro de uma inserção de postura de ovos.
- Na manhã do experimento, permita que o macho e a fêmea comecem a acasalar, por exemplo, removendo o divisor da caixa de acasalamento ou colocando o macho na mesma inserção de postura de ovos que a fêmea.
- Colete os embriões a cada 10 minutos, movendo a inserção de postura de ovos para um novo fundo de tanque de acasalamento que contenha água fresca do sistema e rotule o tanque com uma etiqueta identificando a fêmea F0 individual. Pegue o velho tanque de acasalamento e despeje a água através de um coador de chá para coletar os embriões de uma embreagem individual de 10 minutos.
- Uma vez que os embriões de uma única embreagem de 10 minutos tenham sido coletados no filtro, transfira-os para uma placa de Petri contendo 1x meio E3. Rotule a placa de Petri com o tempo de coleta e as informações do peixe.
- Sob um microscópio de dissecação com uma fonte de luz transmitida, observe os embriões em desenvolvimento a cada hora durante as primeiras 6-8 h e diariamente durante os próximos 5 dias.
- Identificar potenciais embriões crispantes maternos por alterações morfológicas grosseiras em seu desenvolvimento em comparação com controles do tipo selvagem pareados pelo tempo29.
- Mova os embriões potencialmente crispantados maternos para uma placa de Petri que contenha 1x meio E3 e ensaio para fenótipo morfológico a 24 hpf e viabilidade (por exemplo, inflação da bexiga natatória) em 5 dias após a fertilização.
6. Sequenciamento de alelos em haploides crispantes maternos
NOTA: Os haploides crispantes maternos contêm um único alelo no locus alvo, permitindo a identificação de INDELs no gene alvo através do sequenciamento de Sanger. Embriões de haploides crispantes maternos também podem ser analisados usando ensaios de sequenciamento de próxima geração. Espera-se que embriões que apresentem um fenótipo crispante materno carreguem uma lesão em pelo menos um dos quatro locais-alvo (Ver Discussão).
- Na tarde anterior ao experimento, montou pares de fêmeas F0 conhecidas por produzir embriões maternos entrelaçados cruzados para machos do tipo selvagem. Mantenha os machos do tipo selvagem fisicamente separados das fêmeas usando um divisor de caixa de acasalamento ou coloque a fêmea na inserção de postura de ovos.
- Na manhã do experimento, remova a partição física ou coloque os machos e as fêmeas dentro da inserção de postura de ovos para iniciar o acasalamento. Ao primeiro sinal de postura de ovos, interrompa a reprodução separando os machos e as fêmeas F0. Mantenha cada fêmea F0 separada em caixas de acasalamento individuais.
- Preparar solução espermática tratada com UV utilizando testículos de um macho selvagem para cada 100 μL de solução de Hank (Tabela 2), suficiente para fertilizar óvulos extrudados de uma fêmea, conforme descrito anteriormente31.
- Extrudar manualmente óvulos maduros das fêmeas F0 pré-selecionadas e realizar fertilização in vitro (FIV ) utilizando o espermatozoide tratado com UV31.
- Após a fertilização in vitro , permita que os embriões haploides se desenvolvam até que o fenótipo crispante materno seja observado e coloque esses embriões em uma placa de Petri diferente.
- Uma vez que os embriões haploides crispantes maternos tenham sido identificados, permita que eles se desenvolvam por pelo menos 6 h após a fertilização.
- Para extrair o DNA genômico de pelo menos dez embriões haploides crispantes maternos, coloque um único embrião haploide em um poço individual de um tubo de tira de PCR, remova o excesso de meios E3 do poço e adicione 50 μL de 50 mM de NaOH.
- Incubar os embriões a 95 °C durante 20 min. Em seguida, arrefecer as amostras até 4 °C, adicionar 5 μL de 1 M Tris HCL (pH 7,5) e vórtice durante 5-10 s. O DNA extraído pode ser armazenado a -20 °C por até 6 meses.
- Para identificar quais locais de guia contêm INDELs, projete iniciadores de sequenciamento para amplificar um fragmento de DNA que inclua todos os quatro locais-alvo CRISPR-Cas9. Esses primers de sequenciamento permitem a identificação de INDELs que abrangem vários locais de guia.
- Configure duas reações de PCR de 25 μL por embrião usando 5 μL do DNA genômico preparado e os primers de sequenciamento.
- Após o término da PCR, purifice e concentre as duas amostras usando um kit de limpeza e concentrador de DNA (consulte a Tabela de Materiais). Em seguida, submeta o fragmento de DNA ao sequenciamento de Sanger usando os primers de sequenciamento para frente e para trás.
- Após o fragmento crispante materno haploide ter sido sequenciado, alinhe-o à sequência do tipo selvagem e identifique INDELs nos locais-alvo usando um programa de alinhamento de sequência.
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Resultados
A abordagem experimental descrita neste protocolo permite a identificação de fenótipos de efeito materno de forma rápida e eficiente em termos de recursos (Figura 1).
Gerando crispants maternos:
Ao projetar os quatro RNAs guia para atingir um único gene de efeito materno candidato, deve-se considerar especialmente onde os RNAs guia se ligarão ao DNA. Em geral, todos eles devem ser agrupados com regiões mínimas ou nenhuma sobreposição entre os R...
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Discussão
O protocolo apresentado neste manuscrito permite a identificação e caracterização molecular primária de um fenótipo de efeito materno em uma única geração, em vez das múltiplas gerações necessárias para técnicas genéticas avançadas e reversas. Atualmente, o papel de muitos genes expressos maternalmente é desconhecido. Essa falta de conhecimento se deve, em parte, à geração extra necessária para visualizar um fenótipo ao identificar genes de efeito materno. No passado, a rápida identificação de genes de efeito materno em ...
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Divulgações
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Agradecemos aos antigos e atuais membros da equipe de criação de animais de laboratório da Pelegri por seu cuidado com a instalação aquática. Também somos gratos pelos comentários e insights sobre o manuscrito de Ryan Trevena e Diane Hanson. O financiamento foi fornecido pela subvenção do NIH à F.P. (GM065303)
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1 M Tris-HCl (pH 8,4) | Invirogen | 15568025 | Para mistura de PCR |
| 1,5 mL Eppendorf Tubes | Qualquer fabricante | ||
| 10 mM dNTPs | Thermo Fischer Scientific | 18427013 | Síntese de gRNA |
| 100 BP ladder | Qualquer fabricante | Para eletroforese em gel | |
| 100% etanol livre de RNAse | Qualquer fabricante | ||
| 100% RNAse etanol grátis | Qualquer fabricante | ||
| 100ml Béquer | Qualquer fabricante | para FIV | |
| 5 M Acetato de amônio | Thermo Fischer Científico | Encontrado no MEGAshortscript T7 Kit de Transcrição | Síntese de gRNA |
| 70% Etanol | Síntese de gRNA (70 mL de etanol + 30 mL de água livre de nuclease) | ||
| Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID | FHC INC | 27-30-1 | para Microinjeção |
| a Granel Pharma Bicarbonato de Sódio 35 libras Fornecimento de | Recife a Granel | 255 | Suprimentos |
| de Peixe CaCl2 | MiliporeSigma | C7902 | |
| Cas9 Proteína com NLS | PNABio | CP01 | |
| ChopChop | https://chopchop.cbu.uib.no/ | ||
| Oligonucleotídeo constante | DNA integrado Tecnologias (IDT) | AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTA GCCTTATTTTAACTTGCTATTTC TAGCTCTAAAAC | |
| Placa de vidro para depressão | Thermo Fischer Scientific | 13-748B | fertilização in vitro |
| Dumont | SS | de fertilização in vitro | |
| Ferramentas de ciências finas | 14091-09 | para fertilização | |
| in vitroEstereoscópio de dissecação (com fonte de luz transmitida) | Qualquer fabricante | para DNA de fertilização in vitro | |
| limpo e Pesquisa | D4014 | Zymo | do gRNA |
| (6x) | Any Maker | para a eletroforese | |
| Polimerase Lucigen | 30032-1 | ADN de EconoTaq | para a fonte |
| de alimentação da eletroférese | Todo o fabricante | para o | |
| conjunto | do gel https://useast.ensembl.org/index.html | ||
| Eppendorf Pontas de Microcarregador Femtotips para Microinjetor Femtojet | Thermo Fischer Scientific | E5242956003 | para Microinjeção |
| de Etanol (200 provas, sem nuclease) | Any Maker | ||
| FemtoJet 4i | Eppendorf | 5252000021 | para Microinjeção |
| Rede de Pesca | Qualquer Maker | Fish fornece | |
| Camarão de Salmoura Congelado | Camarão de Salmoura Direto | Suprimentos de peixe | |
| Geral Agarose multiuso | Qualquer fabricante | Para eletroforese | |
| em gel Oligonucleotídeo específico do gene Tecnologias | integradas de DNA (IDT) | TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG | |
| Luvas | Qualquer fabricante | ||
| Balde de gelo | Qualquer fabricante | ||
| Sal oceânico instantâneo | Qualquer fabricante | Suprimentos para peixes | |
| Brometo de Etídio UltraPure Invitrogen, 10 mg/mL | Thermo Fischer Scientific | 15-585-011 | |
| KCl | MiliporeSigma | P5405 | |
| KH2PO4 | MiliporeSigma | 7778-77-0 | |
| Kimwipes | Thermo Fischer Scientific | 06-666 | |
| Masculino & Kit de | |||
| MEGAshortscript | Thermo Fischer Scientific | AM1354 | Síntese de gRNA |
| Azul de Metileno | Thermo Fischer Scientific | AC414240250 | Para E3 |
| MgCl2 | MiliporeSigma | 7791-18-6 | Para PCR mix |
| MgSO2· 7H2O | MiliporeSigma | M2773 | |
| Molde de plástico de microinjeção | World Precision Instruments | Z-Molds | para microinjeção |
| Micromanipulador | Qualquer fabricante | para micropipeters de microinjeção | |
| Qualquer fabricante | |||
| Extrator de micropipeta | Sutter | P-87 | para microinjeção |
| Pontas de micropipetter com filtros (todos os tamanhos) | Qualquer fabricante | ||
| Pontas de micropipetter sem filtros (todos os tamanhos) | Microondas de qualquer fabricante | ||
| fabricante | |||
| Óleo mineral | MiliporeSigma | m5904-5ml | para microinjeção |
| MS-222 (Tricaine-D) | Qualquer fabricante | aprovado pela FDA | |
| Na2 HPO4 | MiliporeSigma | S3264 | |
| NaCl | MiliporeSigma | S5886 | |
| NaHC03 | MiliporeSigma | S5761 | |
| Nanodrop | Any Maker | ||
| NaOH | MiliporeSigma | 567530 | |
| Tubos de Microfuga Antiaderentes, sem RNase, 1,5 mL | Ambion | AM12450 | Síntese de água livre de gRNA |
| nuclease | Qualquer fabricante | ||
| papel | Qualquer fabricante | ||
| Pipetas Pastro | Qualquer fabricante | ||
| Tubos de tiras de PCR | Qualquer fabricante | ||
| Placas de Petri de 100 mm de diâmetro | Qualquer fabricante | ||
| Solução de vermelho de fenol | MiliporeSigma | P0290 | para microinjeção |
| de pedais de plástico | VWR | 47747-358 | de fertilização in vitro |
| Qualquer fabricante | para fertilização in vitro | ||
| Ovos de artêmia de grau premium | Camarão de salmoura | ||
| encontrado no kit de transcrição MEGAshortscript T7 | para eletroforese em gel | ||
| 21-402-178 | |||
| Escala | Qualquer Fabricante | ||
| Sharpie | Qualquer Fabricante | ||
| Espátula | Qualquer Fabricante | ||
| Estéril H2O | Qualquer Fabricante | Para PCR mix | |
| T4 DNA Polimerase | NEB | M0203 | Síntese de fita de gRNA |
| Qualquer Fabricante | |||
| TBE (Tris-Borato-EDTA) 10x | Qualquer Fabricante | Para eletroforese em gel | |
| Chá Stainer | Amazon | IMU-71133W | Suprimentos |
| para peixesPente Thermo Scientific Owl 12-Tooth, 1.0/1.5 mm Thick, Dupla Face para B2 | Thermo Fischer Scientific | B2-12 | Para eletroforese em gel |
| Thermo Scientific Coruja EasyCast B2 Mini Sistemas de Eletroforese em Gel | Thermo Fischer Scientific | 09-528-110B | Para eletroforese em gel |
| Termociclador | Qualquer fabricante | ||
| Termociclador | Qualquer fabricante | ||
| Transiluminador | Qualquer fabricante | ||
| Lâmpada UV | UVP | Modelo XX-15 (Cat NO. UVP18006201) | de fertilização in vitro |
| Qualquer fabricante | de fertilização in vitro | ||
| Thermo Fischer Scientific | S39015 | Suprimentos para peixes | |
| Caixas de acasalamento de peixe-zebra | Aqua Schwarz | SpawningBox1 | Suprimentos para peixes |
| 1,5 ml Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | 05-402-11 | |
| 10 molares dNTPs | Thermo Fischer Scientific | 18427013 | |
| 100 BP escada | Thermo Fischer Scientific | 15628019 | |
| 100% de etanol livre de RNAse | qualquer fabricante | ||
| 5m Acetato de amônio | Thermo Fischer Scientific | ||
| 70% Etanol | 70ml de etanol e 30 ml de água livre de nuclease | ||
| Acessórios para caixa de gel horizontal | Fisher Scientific | 0,625 mm | |
| Agarose | qualquer fabricante | ||
| CaCl2 | Sigma | 10043-52-4 | |
| CaCl2, di-hidratado | Sigma | 10035-04-8 | E3 Tubo |
| Capilar | Cole-Parmer | UX-03010-68 | para agulhas de injeção |
| Cas9 Protein | Thermo Fischer Scientific | A36496 | |
| ChopChop | https://chopchop.cbu.uib.no/ | ||
| Computador | qualquer fabricante | ||
| Dissecando Forceptos | qualquer fabricante | ||
| Microscópio de dissecação | qualquer fabricante | ||
| Tesoura de dissecação | qualquer fabricante | ||
| DNA Limpo e Concentrador -5 | Zymo Research | D4014 | |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Fischer Scientific | R0611 | |
| EconoTaq DNA Polimerase | Lucigen | 30032-1 | |
| Ensemble | https://useast.ensembl.org/index.html | ||
| Eppendorf Microloader PipetaTips | Fischer Scientific | 10289651 | 20 microlitros |
| Etanol (200 provas, livre de nuclease) | qualquer fabricante | ||
| Brometo de Etídio | Thermo Fischer Scientific | 15585011 | |
| Rede de Pesca | qualquer fabricante | malha fina | |
| Camarão em Salmoura Congelado | LiveAquaria | CD-12018 | comida para peixes |
| Gel Comb (0,625 mm) | qualquer fabricante | ||
| Sistema de Eletroférese em Gel | qualquer fabricante | ||
| Tecnologias integradas de DNA de oligonucleotídeo específico de gene | (IDT) | ||
| Agulha capilar de vidro | Grainger | 21TZ99 | https://www.grainger.com/product/21TZ99?ef_id=Cj0KCQjw8Ia GBhCHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbpZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88 VVcI964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEAL w_wcB:G:s& s_kwcid=AL!2966!3! 264955916096!!! g!438976 780705!& gucid=N:N:PS:Paid :GGL:CSM-2295:4P7A1P:20501 231& gclid=Cj0KCQjw8IaGBh CHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbp ZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88VVcI 964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEALw _wcB& gclsrc=aw.ds |
| Pratos de vidro | qualquer fabricante | ||
| Luvas | qualquer fabricante | ||
| Solução de Trabalho | Combine 9,9 ml de Hank's Premix com 0,1 ml HS Stock #6 | ||
| Hank's Premix | combine o seguinte em ordem: (1) 10,0 ml HS #1, (2) 1,0 ml HS#2, (3) 1,0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1,0 ml HS#5. Armazene todos os HS Solotions em 4C | ||
| Hanks Solution | |||
| Hank's Solution | |||
| https://www.jove.com/pdf-materials/51708/jove-materials-51708-production-of-haploid-zebrafish-embryos-by-in-vitro-fertilization Hank's Stock Solution #1 | 8,0 g NaCl, 0,4 g KCl em 100 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #2 | 0,358 g de Na2HPO4 anidro; 0,60 g K2H2PO4 em 100 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #4 | 0,72 g CaCl2 em 50 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #5 | 1,23 g MgSO47H2O em 50 ml ddH20 | ||
| Hank's Stock Solution #6 | 0,35g NaHCO3 em 10,0 ml ddH20; faça fresco dia de uso | ||
| HCl | Sigma | 7647-01-0 | |
| Balde de Gelo | qualquer fabricante | ||
| Sal oceânico instantâneo | qualquer fabricante | para água de peixe | |
| Kit de Transcrição In Vitro Mega Short Script | Thermo Fischer Scientific | AM1354 | |
| Invitrogen™ UltraPure™ Água Destilada Sem DNase/RNase | Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| KCl | Sigma | 7447-40-7 | E3 Médio |
| KH2PO4 | Sigma | 7778-77-0 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Zebrafish | |||
| Mega Short Script T7 Kit de Tradução | Thermo Fischer Scientific | AM1354 | |
| azul de metileno | Fisher Scientific | AC414240250 | E3 Médio |
| MgSO2-7H2O | Sigma | M2773 | |
| Microimicromanipulador | |||
| Microinjeção molde de plástico | Instrumentos de Precisão Mundial | Moldes | |
| Z Microinjetor | |||
| Microagulha Slide | |||
| Micropipeter (1-10) com pontas | qualquer fabricante | precisa de pontas p10 filtradas | |
| Micropipetter (20-200) com pontas | qualquer fabricante | ||
| Micropippetter (100-1000) com pontas | qualquer fabricante | ||
| Microplastic slide | |||
| Microondas | qualquer fabricante | ||
| MiliQ Water | any fabricante | ||
| de óleo mineral | sigma-aldrich | m5904-5ml | |
| Na2HPO4 | Sigma | ||
| NaCl | Sigma S9888 | ||
| NaHC02 | Sigma | 223441 | |
| Nanodrop | |||
| NaOH | Sigma | 567530 | |
| Espátula estreita | qualquer fabricante | ||
| Extrator de Agulhas | Sutter | P-97 | |
| Toalha de Papel | qualquer fabricante | ||
| Pipetas Pastro Fisher | Scientific | 13-678-20A | |
| PCR primer flanking guide site | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| PCR primers flanqueando guia RNA cut site | Integrated DNA Technologies (IDT) | Padrão dessalinizado | |
| Tubos de tira PCR | Thermo Fischer Scientific | AB0771W | |
| Petri | Fisher Scientific | FB0875714 | 10 cm de diâmetro 100mm x 15mm |
| Fenol vermelho | Fisher Science | S25464 | https://www.fishersci.com/shop/products/phenol-red-indicator-solution-0-02-w-v-2/S25464 |
| pontas de pipeta | qualquer fabricante | 10ul, 200ul e 1000ul pontas | |
| Pestais de Plástico | Fisher Scientific | 12-141-364 | |
| Colher de Plástico | qualquer fabricante | ||
| Guia de Primer Site | Tecnologias Integradas de DNA (IDT) | ||
| Lâmina de Barbear | Uline | H-595B | |
| RNA gel Carregando Corante | em kit de script megashort(kit de transcipção in vitro) | ||
| RNAse away | Fisher | 21-402-178 | |
| Tubos de microcentrífuga de polipropileno livre de RNAse | Thermo Fischer Scientific | AM12400 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM12400#/AM12400 |
| água livre de RNAse | Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| Escala | qualquer fabricante | ||
| Sharpie | qualquer fabricante | ||
| Bicarbonato de sódio (célula cultura testada) | Sigma | S5761 | água de peixe |
| Brometo de Sódio Solotion | Sigma | E1510 | |
| Software para sequenciamento de sanger Análise | |||
| Espectrofotômetro | |||
| Sterlie H2O | qualquer marca | ||
| T4 DNA Polimerase | NEB | M0203S | https://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase#Product%20Information |
| Fita | de qualquer marca | ||
| TBE (Tris-Borato-EDTA) 10X | Thermo Fischer Scientific | B52 | |
| https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B52#/B52 Manchador de Chá | amazon | IMU-71133W | disponível na maioria das lojas de cozinha |
| Termociclador | |||
| Pipeta de transferência | Uline | S-24320 | |
| Transiluminador | |||
| Tricaine | Fisher Scientific | NC0872873 | |
| Tris HCl 7.5 | Thermo Fischer Scientific | 15567027 | |
| Universal Primer | Integrated DNA Technologies (IDT) | AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTAG CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTA GCTCTAAAAC | |
| Lâmpada UV | UVP | ||
| Óculos de segurança UV | qualquer fabricante | ||
| Garrafa de lavagem | fisher scientific | S39015 | |
| Caixas de acasalamento de peixe-zebra | qualquer fabricante | ||
| Receita | de buffer de PCRAdicione 171,12mL de H20 estéril; 0,393 mL 1M MgCl2; 2,616mL 1M MgCl2; 2,618 mL 1M Tris-HCl (pH 8,4) 13,092mL 1M KCl; 0,262 mL de gelatina a 1%. Autoclave por 20 minutos e depois resfrie o solo no gelo. Em seguida, adicione 3.468 mL 100mg / mL BSA; 0,262 mL dATP (100mM), 0,262mL dCTP (100mM); 0,262 mL dGTP (100mM); 0,262 mL dTTP (100mL). Alliquote em tubos |
Referências
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Reimpressões e permissões
