Identificação da fonte de proteínas secretadas no rim por injeção de Brefeldin A

Resumo

Identificar o tipo de célula responsável pela secreção de citocinas é necessário para entender a patobiologia da doença renal. Aqui, descrevemos um método para corar quantitativamente o tecido renal em busca de citocinas produzidas por células epiteliais ou intersticiais renais usando brefeldina A, um inibidor de secreção e marcadores específicos do tipo de célula.

Resumo

A doença renal crônica (DRC) é uma das dez principais causas de morte nos EUA. A lesão renal aguda (LRA), embora muitas vezes recuperável, predispõe os pacientes à DRC mais tarde na vida. As células epiteliais renais foram identificadas como nós-chave de sinalização tanto na LRA quanto na DRC, por meio das quais as células podem determinar o curso da doença por meio da secreção de citocinas e outras proteínas. Especialmente na DRC, várias linhas de evidência demonstraram que as células tubulares reparadas de forma inadequada impulsionam a progressão da doença por meio da secreção do fator de crescimento transformador beta (TGF-β), fator de crescimento do tecido conjuntivo (CTGF) e outras citocinas pró-fibróticas. No entanto, identificar a fonte e o número relativo de proteínas secretadas de diferentes tipos de células in vivo continua sendo um desafio.

Este trabalho descreve uma técnica que utiliza brefeldina A (BFA) para prevenir a secreção de citocinas, permitindo a coloração de citocinas no tecido renal usando técnicas padrão de imunofluorescência. O BFA inibe o transporte do retículo endoplasmático (RE) para o aparelho de Golgi, que é necessário para a secreção de citocinas e outras proteínas. A injeção de BFA 6 h antes do sacrifício leva a um acúmulo de TGF-β, PDGF e CTGF dentro das células do túbulo proximal (PTCs) em um modelo de cisplatina de camundongo de LRA e TGF-β em um modelo de ácido aristolóquico (AA) de camundongo de DRC. A análise revelou que BFA + cisplatina ou BFA + AA aumentou significativamente o sinal positivo para TGF-β em comparação com BFA + solução salina, cisplatina ou AA isoladamente. Esses dados sugerem que o BFA pode ser usado para identificar o tipo de célula produtora de citocinas específicas e quantificar as quantidades relativas e/ou diferentes tipos de citocinas produzidas.

Introdução

Estima-se que >10% da população mundial tenha algum tipo de doença renal¹. Definida por seu rápido início, a LRA é amplamente curável; no entanto, um episódio de LRA pode predispor os pacientes a desenvolver DRC mais tarde na vida ^2,3. Ao contrário da LRA, a DRC é marcada por fibrose progressiva e piora da função renal, levando à doença renal terminal que requer terapia renal substitutiva. A maioria das lesões nos rins tem como alvo as células epiteliais especializadas, como podócitos ou células dos túbulos proximais, que compõem o néfron ^4,5. Após a lesão, as células epiteliais sobreviventes ajudam a coordenar a resposta de reparo por meio da secreção de citocinas e outras proteínas. Dessa forma, as células sobreviventes podem modular a resposta imune, direcionar a remodelação da matriz extracelular e auxiliar na recuperação de órgãos.

As citocinas são pequenas proteínas secretadas essenciais para modular a maturação, o crescimento e a capacidade de resposta de organismos multicelulares ^6,7. Eles funcionam como mensageiros de sinal entre vários tipos de células, incluindo células imunes e epiteliais⁸. Embora se acredite que as citocinas sejam secretadas principalmente por células imunes, pesquisas de longa data demonstraram que as células epiteliais e intersticiais renais também secretam citocinas como sinais para outras células renais residentes, como células tubulares, células intersticiais e células imunes ^9,10. Os PTCs, em particular, desempenham um papel importante na fase de iniciação e recuperação após a LRA¹¹. No entanto, sabe-se que os PTCs reparados de forma inadequada secretam citocinas pró-fibróticas, como o fator de crescimento transformador-β (TGF-β), o fator de crescimento derivado de plaquetas D (PDGF-D) e o fator de crescimento do tecido conjuntivo (CTGF), contribuindo para a progressão da DRC¹². Assim, as células epiteliais renais usam citocinas secretadas para modular a lesão renal.

Embora se saiba que as células epiteliais renais secretam citocinas, a fonte exata e a contribuição relativa de cada tipo celular têm sido difíceis de determinar devido aos desafios técnicos do estudo das proteínas secretadas¹³. A citometria de fluxo, uma abordagem comum usada para medir citocinas, é difícil de realizar em rins lesionados, especialmente em rins altamente fibróticos. Com a Cre recombinase impulsionada por um promotor de citocinas, os camundongos repórteres de citocinas são frequentemente usados para identificar o tipo de célula que expressa uma determinada citocina. No entanto, o uso de camundongos repórteres é limitado devido à necessidade de cruzar camundongos repórteres em vários fundos de nocaute, à falta de repórteres adequados e ao fato de que apenas uma citocina pode ser analisada por vez. Assim, é necessário desenvolver uma técnica simples, versátil e acessível para detectar células renais liberadoras de citocinas.

Nossa hipótese é que a injeção de BFA, um inibidor de secreção que bloqueia o transporte de retículo endoplasmático-Golgi in vivo, permitiria a coloração de proteínas secretadas no tecido renal (Figura 1A, B), como mostrado em ensaios baseados em citometria de fluxo^14,15. Juntamente com os fabricantes específicos do tipo de célula, essa técnica pode ser usada para identificar a fonte e a contribuição relativa das células produtoras de citocinas nos rins lesionados. Ao contrário das amostras para citometria de fluxo, os tecidos fixos podem ser mantidos a longo prazo com preservação de proteínas e estruturas celulares, permitindo uma investigação mais completa das células secretoras. Para testar essa hipótese, os rins de camundongos foram lesados com um modelo de LRA (cisplatina) e um modelo de DRC (nefropatia por ácido aristolóquico (AAN)), injetados com BFA e corados usando técnicas imunofluorescentes padrão.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com o protocolo de uso de animais aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados com Animais e Usuários do Vanderbilt University Medical Center.

1. Animais

1. Use camundongos machos BALB/c de 8 a 12 semanas de idade (peso corporal: aproximadamente 25 g) para nefropatia induzida por cisplatina ou ácido aristolóquico.
2. Certifique-se de que os ratos estejam saudáveis e não tenham sinais óbvios de angústia ou ferimentos causados pela luta.
   NOTA: Ferimentos, especialmente na cauda, podem interferir no protocolo descrito aqui. Os camundongos BALB/c foram escolhidos porque é mais fácil visualizar a veia da cauda para injeção nesses camundongos. O protocolo descrito aqui funciona para outras linhagens de camundongos; no entanto, a dosagem de cisplatina ou ácido aristolóquico pode diferir de cepa para cepa.

2. Injeção de cisplatina

1. Dissolva a cisplatina em solução salina estéril até uma concentração final de 1 mg / mL.
   NOTA: A cisplatina não se dissolve completamente à temperatura ambiente. Deve ser manuseado em um exaustor.
2. Aquecer a solução de cisplatina em banho-maria a 37 °C e agitar repetidamente até que a cisplatina se dissolva completamente.
3. Pesar os ratinhos e calcular o volume de solução de cisplatina necessário para injectar 20 mg/kg de peso corporal (pc).
4. Desinfetar a pele abdominal com swabs de iodopovidona (7,5%) e álcool (70%) alternando 3x cada.
5. Usando uma seringa de insulina com uma agulha de 25 G, injete a solução de cisplatina por via intraperitoneal.
6. Prossiga para a secção 4 no dia 3 após a injeção.

3. Injeção de ácido aristolóquico (AA)

1. Dissolva o ácido aristolóquico-I em solução salina tamponada com fosfato (PBS) a uma concentração final de 0,5 mg / mL.
   NOTA: AA deve ser manuseado em um exaustor. AA-I deve ser usado, pois é a forma dominante que induz lesão renal.
2. Aquecer a solução de AA em banho-maria a 37 °C e vórtice repetidamente até dissolver completamente.
3. Pesar os ratinhos e calcular o volume da solução de AA para injectar 5 mg/kg de peso corporal.
4. Desinfetar a pele abdominal com cotonete de iodopovidona (7,5%) e álcool (70%) 3x.
5. Usando uma seringa de insulina com uma agulha de 25 G, injete a solução de AA por via intraperitoneal.
6. Injete AA em dias alternados para um total de 3 injeções.
7. Prossiga para a secção 4 no dia 42 após a última injeção.

4. Preparação da solução BFA

1. Dissolva o BFA em dimetilsulfóxido na concentração de 10 mg / mL para fazer uma solução estoque.
2. Conservar a solução-mãe a -20 °C.
3. Diluir a solução-mãe de BFA com PBS estéril na concentração final de trabalho de 1,25 mg/ml
   NOTA: Prepare uma nova solução de trabalho a cada vez imediatamente antes da injeção.

5. Injeção de BFA na veia da cauda

1. Antes da injeção, coloque a gaiola meio colocada, metade fora de uma almofada de aquecimento por 10 minutos para garantir que os camundongos estejam aquecidos para evitar uma queda na temperatura corporal, o que pode causar vasoconstrição dos vasos na cauda e interferir na injeção.
   NOTA: Coloque a gaiola nas almofadas de aquecimento de forma que metade da gaiola fique na almofada enquanto a outra metade não. Dessa forma, quando os ratos se sentirem aquecidos, eles podem se mover para o outro lado da gaiola e vice-versa.
2. Contenha os mouses usando dispositivos de retenção disponíveis comercialmente de tamanho apropriado.
3. Desinfete a cauda usando iodopovidona e cotonete embebido em álcool três vezes, conforme descrito acima.
4. Segure a cauda horizontalmente e visualize as veias laterais da cauda (Figura 1C). Use uma fonte de luz sob a cauda para ajudar a visualizar as veias.
5. Insira uma agulha de 28 G, mantendo a agulha e a seringa paralelas à veia na direção da cabeça.
6. Injete 200 μL da solução de BFA a 1,25 mg/ml (0,25 mg de BFA). Aguarde até que a veia fique clara à medida que o sangue é substituído pela solução injetável, indicando que a injeção foi bem-sucedida.
7. Remova a agulha e pressione a cauda suavemente até que o sangramento pare.
8. Retorne os ratos para a gaiola e monitore-os quanto a sangramento adicional ou sinais de angústia.

6. Sacrifício e colheita dos rins

1. Eutanasiar os camundongos com uma overdose de isoflurano seguida de luxação cervical 6 h após a injeção de BFA.
   NOTA: O ponto de tempo de 6 h foi escolhido com base na literatura que demonstra que 6 h de tratamento com BFA em outros órgãos permitem acúmulo suficiente de citocinas dentro das células para visualizá-las por coloração imunofluorescente¹⁶.
2. Imediatamente após o sacrifício, exponha o abdômen e o coração do camundongo por uma incisão na linha média ventral.
3. Colete 100-500 μL de sangue para um ensaio de nitrogênio ureico no sangue (BUN) por punção cardíaca. Use agulhas de 25 G com seringas de insulina de 1 mL para coletar o sangue. Para evitar a coagulação, adicione 5 μL de solução de heparina (100 mg / 15 mL de dH₂O) a cada amostra.
   NOTA: É necessário um mínimo de 20 μL de sangue para o ensaio de ureia; no entanto, aproximadamente 500 μL podem ser coletados por punção cardíaca após a eutanásia, o que pode ser útil para outros ensaios. Colete o máximo de sangue possível.
4. Conservar as amostras de sangue no gelo até que os rins sejam recolhidos na secção 7 abaixo.
   1. Centrifugue as amostras de sangue a 1.300 × g por 10 min.
   2. Isolar o plasma suavemente e conservá-lo a -20 °C até estar pronto para realizar o ensaio de ureia na secção 17 abaixo. Em alternativa, armazene as amostras de plasma para ensaios de creatinina.

7. Perfusão e remoção dos rins

1. Perfunda o camundongo com 10-20 mL de PBS através do ventrículo esquerdo usando uma seringa de 20 mL a uma taxa de fluxo de 2-4 mL / min até que o perfusato fique claro.
2. Remova os rins segurando a artéria e a veia renais com uma pinça perto da papila e cortando os vasos do lado oposto ao rim.
3. Remova suavemente a cápsula renal retirando-a manualmente ou com uma pinça fina e estéril.
4. Dependendo do anticorpo, prossiga para a seção 8 para preparação de tecido fixo embebido em parafina ou seção 10 para preparação de tecido congelado fixo.
   NOTA: O processamento de tecidos precisará ser otimizado para cada anticorpo a ser usado para coloração.

8. Tecido embebido em parafina para coloração de TGF-β e PDGF-D

1. Dividindo o rim colocando-o em uma lâmina de vidro limpa e cortando-o horizontalmente com uma nova lâmina de barbear. Coloque metade em 10 mL de paraformaldeído a 4% (PFA) em PBS por 24 h em um rotador de ponta a ponta a uma velocidade de 10 rotações por minuto (rpm).
   NOTA: O rim inteiro não é necessário para seccionamento. Metade do rim pode ser armazenada ou usada para outros ensaios.
2. Substitua o PFA por etanol 70%.
3. Envie a metade do rim para processamento e inclusão de parafina nesta fase, em seguida, corte os tecidos renais embebidos em parafina a 4-6 μm usando um micrótomo e monte-os em lâminas carregadas pré-limpas^17,18.
   NOTA: Os rins foram processados e incluídos em parafina pelo Recurso Compartilhado de Patologia Translacional do Centro Médico da Universidade Vanderbilt e armazenados em temperatura ambiente.

9. Desparafinização e reidratação

1. Coloque as lâminas em um rack de coloração de lâminas e mergulhe-as em um poço de coloração contendo D-limoneno por 5 min, garantindo que o tecido esteja completamente submerso. Repita em um poço contendo D-limoneno fresco.
2. Reidrate os tecidos mergulhando as lâminas em diluições seriadas de etanol 100% (2x), 95%, 90% e 70% por 5 min cada.
3. Lave as lâminas em fluxo dH₂O por 5 min.
4. Realize a recuperação do antígeno incubando as seções em tampão citrato (pH 6,0) em uma panela de pressão a 121 ° C e 15 psi por 45 min.
5. Lave as lâminas em fluxo dH₂O por 20 min.
6. Prossiga para a seção 12.

10. Preparação de tecido congelado para coloração CTGF

1. Dividir o rim ao longo do eixo horizontal usando uma lâmina de barbear nova.
   NOTA: O rim inteiro não é necessário para seccionamento. Metade do rim pode ser armazenada ou usada para outros ensaios.
2. Coloque a metade do rim em 10 mL de PFA a 0,5% em um tubo de 15 mL em um rotador por 2 h a 4 ° C a uma velocidade de 10 rpm.
3. Transvase o PFA para um recipiente para descarte adequado e adicione 10 mL de glicina 0,1 M em PBS por 1 h a 4 °C a uma velocidade de 10 rpm.
4. Transvase a glicina, adicione 10 ml de sacarose a 15% dissolvida em PBS e coloque o tubo num rotador durante a noite a 4 °C e 10 rpm.
5. Transvase a sacarose a 15% e substitua por 10 ml de sacarose a 30% dissolvida em PBS durante 1 h a 4 °C e 10 rpm.
6. Encha o molde de incorporação com composto de temperatura de corte ideal (OCT) e incorpore a metade do rim da etapa 10.5 com a superfície de corte do rim voltada para baixo.
7. Coloque o molde contendo o meio rim e a OCT cuidadosamente em uma poça de nitrogênio líquido para congelar.
   NOTA: Não deixe o nitrogênio líquido entrar em contato direto com a OCT, pois isso pode resultar na formação de bolhas. Equipamento de proteção individual adequado deve ser usado ao usar nitrogênio líquido, como óculos de proteção/protetor facial, luvas criogênicas e jaleco. É melhor usar uma pinça longa, ~ 25 cm, para colocar os moldes em nitrogênio líquido.
8. Depois de congelado, armazene o molde a -80 °C.

11. Seccionamento congelado

1. Certifique-se de que o criostato esteja a -20 °C.
2. Armazenar os moldes contendo amostras em OCT no criostato a -20 °C durante 2 h para equilibrar a temperatura.
3. Remova o molde segurando as abas e pressionando por baixo.
4. Coloque OCT fresco em um suporte de amostra e coloque o bloco de amostra congelado por cima, com o lado do tecido voltado para longe do suporte de amostra.
5. Coloque o suporte da amostra e a amostra na prateleira de congelamento.
6. Coloque um extrator de calor pesado no topo do bloco para achatar a superfície. Mantenha a tampa do criostato fechada quando não estiver em uso para evitar flutuações de temperatura.
7. Uma vez que o OCT fresco entre o bloco de amostra e o suporte de amostra esteja congelado, verifique se a conexão está segura.
8. Prenda o suporte da amostra na cabeça do micrótomo do criostato.
9. Comece a seccionar até que o tecido fique visível no bloco da amostra.
10. Corte o tecido renal a 4-6 μm e pegue as seções em uma lâmina carregada à temperatura ambiente¹⁹.
11. Depois que o tecido for coletado, armazene a lâmina de -20 °C a -80 °C até que esteja pronta para colorir. Não deixe descongelar até que esteja pronto para começar a manchar.
12. Antes da coloração, remova a(s) lâmina(s) do armazenamento e deixe aquecer até a temperatura ambiente. Não deixe as seções secarem.
13. Uma vez em temperatura ambiente, lave imediatamente as seções com PBS por 5 min duas vezes em temperatura ambiente para eliminar o composto OCT.
14. Prossiga para a seção 12.

12. Coloração de imunofluorescência

1. Contorne as seções de tecido com uma caneta marcadora de barreira hidrofóbica. Mantenha pelo menos 5 mm de distância do tecido ao contorno da barreira hidrofóbica.
2. Adicione 50 μL de tampão de bloqueio contendo 3% de soro de burro e 0,1% de Triton em albumina de soro bovino a 1% / solução salina tamponada com Tris (TBS) no topo da seção e incube por 1 h em temperatura ambiente em uma câmara umidificada.
3. Diluir os anticorpos primários com PBS na concentração apropriada. Para detecção de citocinas, use 50 μL de soluções de anticorpos primários direcionados contra TGF-β1 (1:200), PDGF-D (1:400) e CTGF (1:200). Para marcar miofibroblastos, use 50 μL de uma solução do anticorpo primário direcionado contra a actina do músculo liso alfa (α-SMA) conjugada com Cy3 a 1:200.
4. Remova a solução de bloqueio e adicione os anticorpos primários à seção, garantindo que ela não vaze do contorno hidrofóbico circular e incube durante a noite a 4 ° C em uma câmara umidificada. Reaplique a barreira hidrofóbica se ocorrer vazamento.
5. Lave 3x com PBS por 5 min.
6. Diluir os anticorpos secundários apropriados a 1:200 com PBS.
7. Incubar as amostras com 50 μL de soluções de anticorpos secundários por 1 h à temperatura ambiente em uma câmara umidificada.
8. Lave com PBS por 5 min.
9. Lectina de lótus tetragonolobus diluída (LTL) conjugada com fluoresceína em PBS com Ca²⁺ e Mg²⁺ na concentração de 10 μg/mL.
   NOTA: Ca²⁺ e Mg²⁺ são necessários para a ligação LTL.
10. Incubar os tecidos com 50 μL de solução LTL por 30 min em temperatura ambiente em uma câmara umidificada.
11. Lave com PBS com Ca²⁺ e Mg²⁺ por 5 min.
12. Incubar com 50 μL de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, 5 μg/mL em água) para corar DNA/núcleos por 5 min em temperatura ambiente.
13. Monte as lamínulas adicionando 20 μL de reagente de montagem antidesbotamento no tecido e colocando lentamente a lamínula. Aguarde 24 h para que o reagente antidesbotamento solidifique antes de fazer a imagem.
    NOTA: A ligação da lectina pode se degradar com o tempo, resultando em perda de sinal. É melhor obter imagens de amostras coradas com lectina logo após a configuração do reagente de montagem. Se for observada perda de sinal, Ca²⁺ e Mg²⁺ podem ser adicionados ao reagente de montagem para preservar a coloração.

13. Aquisição de imagem

1. Ligue o microscópio invertido (consulte a Tabela de Materiais) com um estágio XY automatizado.
2. Selecione o objetivo 20x.
3. Abra o software de aquisição de imagem (consulte a Tabela de Materiais).
4. Clique em Ao vivo para abrir a janela de visualização ao vivo.
5. Encontre a seção de tecido e certifique-se de que esteja em foco.
6. Clique no menu Adquirir e selecione Digitalizar imagem grande.
7. Na janela Digitalizar imagem grande , configure a área a ser digitalizada movendo o palco usando o joystick para a parte mais à esquerda da seção de tecido e clique na seta para a esquerda. Repita para os segmentos de tecido superior, direito e inferior.
8. Clique no menu de aquisição .
9. Certifique-se de que a caixa de seleção para imagem grande esteja marcada.
   1. Se estiver capturando imagens multicanal, clique na guia Lambda .
   2. Clique em cada canal e defina o tempo de exposição para um nível em que a coloração seja aparente sem saturação de qualquer parte da imagem.
      NOTA: Essas configurações precisam ser consistentes dentro de um grupo experimental. Alterar as configurações de aquisição entre amostras levará a resultados imprecisos.
   3. Repita a etapa 9.2 para cada canal a ser coletado.
10. Clique em Digitalizar.

14. Análise de imagem

1. Abra o software de aquisição de imagem.
2. Clique em Arquivo | Abra e selecione a imagem.
3. Clique com o botão direito do mouse na janela da imagem e escolha a região de interesse poligonal (ROI).
4. Descreva o ROI com a ferramenta à mão livre . Descreva as células tubulares positivas para LTL ou células intersticiais positivas para α-SMA.
5. Clique na guia Medição | Limiar.
6. Configure os limites superior e inferior do limite ajustando os controles deslizantes para ambos os lados da área de sinal positivo.
7. Clique na guia ROI .
8. Clique no ícone Exportar para salvar os valores. Use um software de planilha para calcular a porcentagem de área de sinal positivo/área de ROI.

15. Alternativa: Análise de imagem com software livre (ImageJ)

1. Abra o ImageJ.
2. Clique em Arquivo | Abra para ver uma imagem.
3. Clique em seleções à mão livre.
4. Selecione o ROI delineando com a ferramenta à mão livre . Descreva as células tubulares positivas para LTL ou células intersticiais positivas para α-SMA.
5. Clique no menu Editar e selecione Limpar fora.
6. Clique em Analisar e selecione Medir para determinar a área de ROI.
7. Ir para a imagem | Cor | Canais divididos.
8. Ajuste os limites superior e inferior do limite para detectar a área do sinal positivo.
9. Clique em Analisar e selecione Medir.
10. Salve os dados.
11. Abra os dados com o software de planilha e calcule a relação entre a área do sinal positivo/área do ROI.

16. Opcional: Imagem latente com microscópio confocal da exploração do laser

NOTA: Para obter imagens de maior resolução para publicação, a microscopia confocal de varredura fornece imagens mais nítidas e fundo reduzido no tecido renal.

1. Ligue o microscópio confocal de varredura a laser (consulte a Tabela de Materiais).
2. Selecione a objetiva 40x (consulte a Tabela de Materiais).
3. Clique na guia Localizar e encontre os tecidos ajustando o foco.
4. Vá para a guia Aquisição , clique em Canais e escolha 1 UA na configuração pinhole.
5. Ajuste a intensidade de ganho do laser em cada canal de forma que o sinal positivo seja visível, mas não saturado. Certifique-se de que as configurações em um conjunto de amostras experimentais permaneçam constantes.
6. Clique em Ajustar e salve a imagem no formato desejado.

17. Nível de BUN plasmático

1. Retirar as amostras a -20 °C e descongelá-las sobre gelo.
2. Diluir o plasma com dH₂O na proporção de 1:10.
3. Para cada amostra, configure três reações separadas em duplicata em uma placa de 96 poços.
   1. Para amostra mais padrão, adicione 5 μL de ureia de 200 mg / dL e 20 μL de plasma diluído.
   2. Apenas para a amostra, adicionar 5 μL de dH₂O e 20 μL de plasma diluído.
   3. Para o branco da amostra, adicionar 5 μL de dH₂O e 20 μL de plasma diluído.
4. Misturar 85 μl do reagente + 1 μl de urease por amostra para preparar a solução de trabalho.
5. Adicionar 80 μL da solução de trabalho aos alvéolos «amostra mais padrão» e «amostra isolada».
6. Adicionar 80 μL do reagente (sem urease) ao alvéolo «amostra em branco» do passo 17.3 acima.
7. Bata suavemente no prato para misturá-lo e incubá-lo por 5 min em temperatura ambiente.
8. Leia o OD₅₆₀ com um leitor de placas.
9. Calcule a concentração de ureia Eq (1) e converta-a em BUN usando Eq (2).
   Ureia (mg/dL) = (Amostra isolada-Amostra em branco)/(Amostra-Padrão isoladamente) x (Padrão/4) x (fator de diluição) (1)
   BUN (mg/dL) = Concentração de ureia/2,14 (2)
   NOTA: Este ensaio mede o teor de ureia (peso molecular: 60) do soro; no entanto, o BUN faz referência apenas ao teor de nitrogênio da ureia (peso molecular: 28). Assim, uma correção de 2,14 (60/28) é necessária para converter a concentração de ureia em BUN.

Resultados

Para examinar o papel das células epiteliais tubulares na produção de citocinas após LRA induzida por cisplatina, a cisplatina foi injetada a uma concentração de 20 mg / kg, seguida por uma injeção intravenosa de 0,25 mg de BFA no dia 3 após a injeção de cisplatina. Os rins foram colhidos 6 h depois. Os rins embebidos em parafina foram seccionados e corados com TGF-β, PDGF-D e CTGF, citocinas representativas responsáveis pelo reparo tecidual na LRA. Conforme mostrado na Figura 2A, vesículas ...

Discussão

Sabe-se que os PTCs renais regulam a LRA e a DRC por meio da secreção de TGF-β, TNF-α, CTGF, PDGF, fator de crescimento endotelial vascular, bem como muitas outras proteínas 20,21,22,23. Da mesma forma, glomérulos, túbulos distais e outras células epiteliais renais, bem como células intersticiais, secretam essas e/ou outras proteínas durante a lesão 24,25,26.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Seringas de insulina de 1 mL	BD	329654
Seringa de 10 mL	BD	302995
tubo de 2 mL	marca Fisher	05-408-138
Seringa de 20 mL	BD	302830
Agulhas de 25 G	BD	305125
28 G Agulhas	BD	329424
placa de 96 poços	Corning	9017
ácido aristolóquico-I	Sigma-Aldrich	A9461
&alfa;-SMA conjugado com Cy3	Sigma-Aldrich	C6198	RRID:AB_476856
Lâmina para criostato	C.L. Sturkey. Inc	DT315R50
Albumina de soro bovino (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906
Brefeldin A	Sigma-Aldrich	B6542
Cisplatina	Sigma-Aldrich	P4394
Ácido cítrico	Sigma-Aldrich	791725
Microscópio confocal	ZEISS	LSM710
Objetivas de microscopia confocal	ZEISS	40x / 1.10 LD C-Apochromat ÁGUA
Software confocal	ZEISS	ZEN
Frasco Coplin	Fisher Scientific	19-4
Vidro de cobertura	Marca Fisher	12545F
Cryostat	Leica	CM1850
CTGF anticorpo	Genetex	GTX124232	RRID: AB_11169640
Cy3-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H + L)	Jackson immunoresearch	711-165-152	RRID: AB_2307443
Cy5-AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H + L)	Jackson immunoresearch	705-175-147	RRID: AB_2340415
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Dimetil sulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Moldes de base descartáveis	Fisher marca	22-363-553
soro de burro	Jackson immunoresearch	017-000-121
Etanol	Decon Labs, Inc.	2701
Fórceps	VETUS	ESD-13
Glycine	Fisher marca	12007-0050
Almofadas de aquecimento	Kent scientific	DCT-20
Heparina sal de sódio	ACROS orgânicos	41121-0010	100mg/15ml de dH2O
Câmara umidificada	Invitrogen	44040410	Uma caixa de plástico coberta com papel alumínio pode ser usada como um câmara umidificada alternativa.
Seringas de insulina	BD	329461
microscópio invertido	NIKON	Eclipse Ti-E2	imunofluorescência
KIM-1 anticorpo	R & D	AF1817	RRID: AB_2116446
Lemozole (Histo-clear)	National diagnostics	HS-200
lótus tetragonolobus lectina	Vector	FL-13212
Lâmina de microscópio	Fisher scientific	12-550-343
Micrótomo	Reichert	Jung 820 II
câmera CMOS monocromática	NIKON	DS-Qi-2
Kit cirúrgico para camundongos	Kent científico	INSMOUSEKIT
NIS Elementos	NIKON
Objetivos	NIKON	Plan Apo 20x/0.75	software de aquisição de imagem ligado ao Eclipse Ti-E2 (microscópio invertido)
OCT composto	Scigen	4586
Pap caneta	Vector	H-4000
PBS com cálcio e magnésio	Corning	21-030-CV
PBS sem cálcio e magnésio	Corning	21-031-CV
PDGF-D anticorpo	Thermo-Fisher scientific	40-2100
PFA	Microscopia Eletrônica Ciência	15710	RRID: AB_2533455
Leitor de placas	Promega	GloMax® O Discover Microplate Reader	4% de PFA é diluído de 16% em PBS.
iodopovidona (Betadine)	Avrio Health L.P.	NDC 67618-151-17
Panela de Pressão	Tristar 8	Qt. Power Cooker Plus
ProLong Gold Antifade Reagent	Invitrogen	P36930
Quantichrom Urea (BUN) II	BioAssay Systems	DUR2-100
Lâmina de barbear de borda única para dissecção renal (.009", 0.23 mm)	Ferramentas IDL	521013
Aquecedor de slides	Lab Scientific Inc.,	XH-2001
Software	NIKON	NIS elementos
Sacarose	RPI	S24060
TGF-b1 anitbody	Sigma-Aldrich	SAB4502954
Tris EDTA tampão	Corning	46-009-CM	RRID: AB_10747473
Citrato trissódico di-hidratado	Sigma-Aldrich	SLBR6660V
Citrato trissódico di-hidratado	Sigma-Aldrich
Triton	Sigma-Aldrich	9002-93-1
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379
Lâmina de Microscópio Carregada em Vidro Branco, Tamanho 25 x 75 mm, Bordas Retificadas, Azul Fosco	Globo Científico	1358D