Artigo de método

Um Contraste de Três Técnicas de Inoculação usado para determinar a raça do fusarium desconhecido oxysporum f.sp. niveum Isolados

DOI:

10.3791/63181

⸱

28 de outubro de 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Pathology, University of Florida, 2University of Florida Institute of Food and Agricultural Sciences, 3Gulf Coast Research and Education Center, University of Florida, 4Horticultural Sciences Department, University of Florida, 5Tropical Research and Education Center, University of Florida, 6Department of Horticulture, University of Georgia

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gerenciar o murmúrio fusarium de melancia requer o conhecimento das raças patógenas presentes. Aqui, descrevemos os métodos de inoculação de root-dip, infestado de kernel e métodos modificados de inoculação de mergulho de bandeja para demonstrar sua eficácia na digitação racial do fungo patogênico Fusarium oxysporum f. sp niveum (Fon).

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fusarium murcha de melancia (Citrullus lanatus), causada por Fusarium oxysporum f. sp. niveum (Fon), ressurgiu como uma grande restrição de produção no sudeste dos EUA, especialmente na Flórida. A implantação de estratégias integradas de manejo de pragas, como cultivares resistentes à raça, requer informações sobre a diversidade e densidade populacional do patógeno nos campos dos produtores. Apesar de alguns progressos no desenvolvimento de ferramentas de diagnóstico molecular para identificar isolados de patógenos, a determinação racial muitas vezes requer abordagens de bioensação.

A digitação de raça foi conduzida por inoculação de mergulho radicular, método de semeadura infestada de kernel, e o método modificado de mergulho de bandeja com cada um dos quatro diferenciais de melancia (Diamante Negro, Cinza Charleston, Calhoun Grey, Plant Introduction 296341-FR). Os isolados recebem uma designação de raça por cálculo da incidência da doença cinco semanas após a inoculação. Se menos de 33% das plantas para uma cultivar específica fossem sintomáticas, elas eram categorizadas como resistentes. As cultivares com incidência superior a 33% foram consideradas suscetíveis. Este artigo descreve três métodos diferentes de inoculação para determinar raça, mergulho radicular, núcleo infestado e inoculação modificada de mergulho de bandeja, cujas aplicações variam de acordo com o design experimental.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os fungos soilborne que compõem o complexo de espécies de oxisporo fusarium oxysporum (FOSC) são patógenos hemibiotrópicos impactantes que podem causar doenças graves e perda de rendimento em uma variedade diversificada de culturas1. O murche fusarium de melancia, causado por F. oxysporum f. sp. niveum (Fon), vem aumentando em escopo, incidência e gravidade em todo o mundo nas últimas décadas 2,3. Nas mudas, os sintomas do murche fusarium muitas vezes se assemelham a amortecimento. Em plantas mais antigas, a folhagem se torna cinza, clorolítica e necrótica. Eventualmente, a murcha das plantas progride para o colapso total da planta e a morte4. A perda direta de rendimento ocorre devido aos sintomas e morte da planta, enquanto a perda indireta de rendimento pode ocorrer devido aos danos solares causados pela eliminação do dossel foliar5. A reprodução sexual e as estruturas reprodutivas associadas nunca foram observadas em F. oxysporum. No entanto, o patógeno produz dois tipos de esporos assexuados, micro e macroconidia, bem como estruturas de sobrevivência maiores e de longo prazo chamadas clamídesporos, que podem sobreviver no solo por muitos anos6.

O FOSC é classificado em especial formae com base em faixas de hospedeiras observadas, geralmente limitadas a uma ou algumas espécieshospedeiras 1. Embora pesquisas recentes tenham indicado que este complexo de espécies pode ser um composto de 15 espécies diferentes, as espécies particulares que infectam a melancia são atualmente desconhecidas7. F. oxysporum f. sp. niveum (Fon) é o nome dos grupos de cepas que infectam exclusivamente Citrullus lanatus ou a melancia domesticada 8,9. As cepas de f. oxysporum dentro da maioria das especialidades de forma patogênica mostram certos níveis de diversidade em relação aos seus componentes genéticos e virulência em relação a uma espécie hospedeira. Por exemplo, uma cepa pode infectar todas as cultivares de um hospedeiro, enquanto outra só pode infectar as cultivares mais suscetíveis. Para explicar essa variação, esses grupos são informalmente classificados em raças baseadas em relações evolutivas ou características fenotípicas comuns. Dentro de Fon, quatro raças (0, 1, 2 e 3) foram caracterizadas com base em sua patogenicidade contra um conjunto de cultivares de melancia selecionadas, com a descoberta da raça 3 ocorrendo recentemente10.

Apesar dessa aparente diversidade, as morfologias dos esporos ou hifas não são distinguíveis entre as raças das raças Fon, o que significa que ensaios moleculares ou fenotípicos são necessários para identificar a raça única de um isolado11. Pesquisas moleculares identificaram algumas diferenças genéticas. Por exemplo, o papel dos efeitos Secreted in Xylem (SIX) tem sido estudado há anos em F. oxysporum, e alguns desses efeitos foram localizados nos cromossomos trocados durante a transferência horizontal de genes12. Por exemplo, SIX6 é encontrado nas corridas 0 e 1 fon, mas não na corrida 213. Seis efeitos foram implicados na patogenicidade de F. oxysporum f. sp. lycopersici e F. oxysporum f. sp. cubense, que causam murcha fusarium no tomate e banana, respectivamente 14,15,16,17. A análise de perfis de efeitos SEIS entre cepas de F. oxysporum f. sp. spiniciae, o patógeno murcho fusarium no espinafre, permitiu uma classificação que reflete com precisão a diversidade genética e fenotípica18. No entanto, as diferenças entre os mecanismos de virulência das raças Fon não são atualmente totalmente compreendidas, e os ensaios moleculares desenvolvidos após seu uso mostraram resultados inconsistentes e imprecisos19. Portanto, os resultados fenotípicos dos ensaios de infecção são atualmente a melhor maneira de classificar isolados.

F. oxysporum inicialmente infecta hospedeiros através das raízes antes de subir o xilema20. Isso torna a inoculação direta das raízes de uma determinada cultivar hospedeira uma maneira eficaz de realizar a digitação racial e é a base dos métodos de inoculação de mergulho de raiz e de mergulho de bandeja21. Quando não infecta um hospedeiro, F. oxysporum reside no solo e pode permanecer adormecido por anos. Cultivares de melancia suscetíveis no solo de um campo de interesse é uma maneira de testar a presença de Fon. Expandir este método para incluir cultivares de diferentes níveis conhecidos de resistência no solo que é deliberadamente infestado com Fon também é uma boa maneira de realizar a digitação racial (Tabela 1) e é a base do método infestado de sementes de kernel. O método modificado de mergulho de bandeja é uma variação do método original de mergulho de bandeja que permite uma digitação de corrida de alto rendimento onde muitas plantas e isolados de campo podem ser investigados rapidamente22. Fatores importantes de um bioensaio de digitação rápida e bem-sucedida incluem o uso de cultivares que documentaram diferenças na resistência às diferentes raças de patógenos, garantindo que o inóculo seja biologicamente ativo e abundante durante a infecção, mantendo um ambiente propício para o patógeno e hospedeiro, e usando um sistema de classificação consistente para gravidade ou incidência da doença. Este artigo descreve o mergulho raiz23,24, semeamento infestadode 25,26, e métodos modificados de mergulho de bandeja22 para digitação de raça fenotípica com base nos princípios descritos acima.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Determinando a raça por método de mergulho raiz (RDM)

  1. Preparação do ambiente experimental
    1. Como a expressão dos sintomas é altamente dependente das condições ambientais, mantenha plantas em uma área controlada. Monitore a umidade relativa, temperatura, fotoperíodo e intensidade da luz (Figura 1).
      1. Coloque a temperatura entre 26-28 °C, umidade relativa do ar para 50-75%, e estabeleça um fotoperíodo de 16 horas para garantir o crescimento adequado da planta e a saúde.
        NOTA: Para evitar a hipóxia, a murcha das mudas e/ou apodrecimento de sementes, não sobrea água ou deixe água parada ao redor das mudas.
      2. Use duas luzes de tubo fluorescentes, cada uma com pelo menos 1850 lúmens de luz e uma temperatura de cor de 2.800 K por banco de luzes para suportar o crescimento fotossintético.
      3. Mantenha a área limpa e use práticas higiênicas, incluindo a remoção de resíduos de solo e detritos vegetais, para evitar danos causados por pragas e infecções incidentais.
    2. Condições de plantio
      1. Encha 8 x 16 células (25 cm de largura x 50 cm de comprimento) começando planos com meio de plantio e bata para baixo para comprimir ligeiramente o solo (Figura 2).
      2. Obter sementes das quatro cultivares diferenciais: Black Diamond/Sugar Baby, Charleston Grey/Allsweet/Dixielee, Calhoun Grey e PI-296341-FR.
      3. Semear sementes com seu ápice (extremidade pontiaguda) apontando para cima para uma profundidade igual ao seu comprimento. Depois que as sementes forem semeadas, cubra o meio contendo as sementes enterradas com a Terra 100% Fuller ou outra alternativa de argila bentonita a uma profundidade de 0,3175-0,635 cm.
      4. Misture os apartamentos para amortecer o meio sem criar água em pé ou de piscina. Depois, mantenha a mídia úmida por neblina por 20 s a cada 180 minutos, ou rega à mão uma vez por dia até a germinação de sementes por aproximadamente 5 dias. Após a germinação, a água uma vez por dia e, conforme necessário, para suportar o crescimento das mudas.
    3. Preparação da mídia
      NOTA: Ambas as mídias são firmes com ágar granulado extra para permitir a colheita de esporos raspando a superfície.
      1. Meio de suco V8 esclarecido (V8)
        1. Prepare 500 mL de suco V8 clarificado (V8)27 adicionando 100 mL de v8 original 100% de suco vegetal com 1% caco3 a 400 mL de água destilada.
        2. Adicione 7,5 g de ágar granulado.
        3. Misture bem os ingredientes, autoclave, e deixe esfriar a 50 °C antes de derramar em pratos estéreis de Petri.
      2. Mídia de ágar dextrose de batata de quarto de força (qPDA)
        1. Prepare o meio qPDA adicionando 4,5 g de ágar granulado a 500 mL de água destilada, adicione 3,8 g de ágar de dextrose de batata.
        2. Misture bem os ingredientes, autoclave, e deixe esfriar a 50 °C antes de despejar 12-15 mL em pratos petri estéreis.
  2. Preparação de tratamentos experimentais
    1. Prepare o inóculo.
      1. Cinco dias pós-plantação (dpp), coloque discos de papel infiltrados (1-1,25 cm de diâmetro) contendo o f . oxysporum preferencial isolado em uma placa V8 e uma qPDA e armazene-os em uma incubadora (~28 °C) durante oito dias28 (Figura 3A).
      2. No oitavo dia de crescimento fúngico e no dia anterior à inoculação (ver seção 1.3.2), transfira as placas V8 e qPDA da incubadora para um armário de biossegurança.
      3. Para cada isolação, dispense 6 mL de água desionizada esterilizada em cada placa de cultura V8 e qPDA.
      4. Desalojar conidia raspando um espalhador de células estéreis pela superfície média (Figura 3B). Acumule a suspensão conidial líquida e transfira-a para um tubo de cultura estéril de 50 mL (Figura 3C).
      5. Repita este processo até que o volume total de suspensão conidial líquida no tubo de cultura de 50 mL seja de aproximadamente 12 mL.
      6. Antes de seguir para outro isolado, esterilize a superfície da área de trabalho e o espalhador celular com álcool. Esterilize o espalhador de células passando-o através de um queimador Bunsen depois de mergulha-lo em ≥70% de etanol.
      7. Uma vez que as suspensões conidiais líquidas tenham sido transferidas para tubos de cultura para todos os isolados, quantifique as contagens de esporos. Primeiro, o vórtice um tubo de cultura individual de 50 mL e dispense 10 μL em cada câmara de um hemacytómetro. Em seguida, calcule o número de esporos no hemacytómetro como descrito anteriormente29.
      8. Prepare a solução inóculo final transferindo o volume calculado para 106 + 10% para outro tubo de cultura estéril e leve o volume total a 30 mL adicionando água deionizada estéril.
      9. Armazene esses tubos de cultura durante a noite a 8 ± 1 °C.
        NOTA: Isso pode ser feito sem perda de viabilidade conidial, como indicado por dados não publicados.
  3. Inoculação
    1. Prepare a inoculação.
      1. Antes do dia da inoculação, a água robusta de mudas de treze dias de idade para a capacidade de transporte do solo.
      2. Prelabel as estacas com informações pertinentes, incluindo o isolado a ser testado, a cultivar de melancia e a data da inoculação.
      3. Coloque apartamentos de isopor de 6 x 12 células (20 cm de largura x 40 cm de comprimento), previamente higienizados com alvejante de 10% e bem enxaguados, para receber as plantas inoculadas.
      4. Preposição todos os materiais necessários (ver a Tabela de Materiais).
    2. Inocular as raízes da planta.
      1. Regar robustamente as plantas várias horas antes de iniciar a inoculação. Pelo menos 2 horas após a rega, remova as plantações dos apartamentos de isopor de 8 x 16 células e enxágue suas raízes para remover quaisquer partículas de material de plantio.
      2. Armazene temporariamente as plantas enxaguadas em recipientes limpos com água da torneira até o uso, mantendo as cultivares separadas umas das outras (Figura 4A). Separe as plantas em grupos de seis indivíduos e mantenha os grupos de mudas envoltos em toalhas de papel molhadas em uma bandeja de laboratório para evitar a dessecação.
      3. Coloque 25-30 cm3 de solo no fundo de cada célula da bandeja de isopor 6 x 12 e use uma garrafa de esguicho para molhar o solo até ficar visivelmente úmido.
      4. Inocular as plantas e replantá-las de acordo com a cultivar, de tal forma que Black Diamond, Charleston Grey, Calhoun Grey, e então PI 296341 01 FR são plantadas da esquerda para a direita.
      5. Começando pelo controle saudável, coloque um grupo de seis mudas intactas da mesma cultivar nos tubos de 50 mL contendo o inóculo. No caso do controle saudável, use água da torneira em vez de uma suspensão de esporos. Inocular as plantas com o controle positivo (Fon corrida 3) por último.
      6. Uma vez dentro do tubo, certifique-se de que as raízes da planta alcancem e sejam expostas ao inóculo (água da torneira).
      7. Vórtice os tubos com raízes de plantlet submersos por 30 s (Figura 4B). Após o vórtice, coloque uma única planta por célula nos apartamentos de isopor 6 x 12. Coloque as plantas da mesma cultivar na mesma coluna na bandeja.
      8. Após a colocação, higienize as mãos enluvadas segurando-as em baldes de 0,7% de solução de cloro disponível para 30 s, seguida por uma lavagem de água da torneira por 1 min.
      9. Em seguida, cubra as plantais colocadas com meio de plantio e coloque suavemente. Usando uma seringa ou pipeta, rega cuidadosamente as plantações com 20 mL por planta, evitando espirrar.
      10. Antes de seguir para o próximo conjunto de plantas, higienize novamente as mãos enluvadas usando solução de cloro e uma lavagem de água da torneira.
      11. Depois de todas as plantações terem sido replantadas, recorta-as novamente minimamente para evitar o escoamento do inóculo.
      12. Segure as plantas durante a noite em um ambiente fechado e escuro com uma temperatura média de 27 °C. No dia seguinte, transfira as plantas para a estufa, mantendo a temperatura média em 27 °C.
  4. Manutenção e cuidado de plantas inoculadas
    1. Para evitar o transbordamento de água excedente, rega os apartamentos levemente três vezes ao dia durante 4-5 dias até que as plantas se estabilizem.
    2. Verifique as bandejas 2-3 vezes por dia por pelo menos três dias para garantir uma cobertura adequada e uniforme da rega.
    3. Evite a secagem devido à luz solar ou sombreamento girando os apartamentos e/ou fornecendo sombreamento/rega suplementar conforme necessário.
    4. A 3 dpp, fertilize as plantas com um fertilizante de liberação rápida de 20-20-20 (10 g/3,78 L) a uma taxa de 3-6 mL por litro de água.
    5. Fertilize semanalmente por 3-4 semanas.
    6. Mantenha a mesma iluminação e condições ambientais ao longo desta etapa.

2. Determinação da corrida pelo método do kernel infestado (IKM)

  1. Infestação dos grãos
    1. Prepare o inóculo.
      1. Seja de uma amostra armazenada ou recém-coletada, isole e cultive um F. oxysporum f. sp. niveum strain of interest on a plate of qPDA ao ponto de seu crescimento cobrir metade da placa.
        NOTA: Isso demonstra que ele é ativo e viável, o que é necessário para infestação substancial do grão em etapas posteriores.
    2. Prepare os grãos.
      1. Em uma escala, meça 200 g de grãos de centeio (Secale spp.) (ou maxie var. wheat (Triticum spp.) em qualquer recipiente suficientemente grande e despeje-os em um ou mais frascos de vidro Erlenmeyer de vidro 1 L. Adicione água da torneira estéril aos frascos para cobrir completamente os grãos até pelo menos 5 cm (Figura 5A).
      2. Mergulhe os grãos à temperatura ambiente (~24 °C) por 2 h. Drenar a água dos frascos; ligar a abertura com um pedaço de rolo de algodão embrulhado em pano de queijo; e cubra a abertura com envoltório de papel alumínio (Figura 5B).
    3. Descontaminar os grãos. Uma vez que o grão tenha água absorída, autoclave-o duas vezes em duas maneiras distintas de matar outros micróbios indesejados antes da inoculação.
      1. Durante a primeira vez, autoclave o grão nos frascos preparados em um ciclo de gravidade (121,2 °C, 1,06 kg/cm2) por 1h com 5 min de secagem. Deixe os frascos esfriarem à temperatura ambiente.
      2. Antes de autoclavar pela segunda vez, transfira os grãos para um pequeno saco de cultivo de cogumelos com um filtro de 0,5 μm. Retire o ar do saco e dobre o excesso de plástico ao redor do saco.
      3. Coloque o saco em uma lixeira de plástico, com segurança automática. Cubra a lixeira com envoltório de papel alumínio (Figura 5C).
        NOTA: Não utilize uma caixa de metal ao autoclavar os grãos nos sacos, pois isso pode fazer com que os sacos derretirem.
      4. Autoclave a lixeira em um ciclo de gravidade por 1h com 5 minutos de tempo de secagem, o mesmo ciclo de antes.
        NOTA: Apenas autoclave a bolsa na segunda vez, não a primeira, pois o filtro e a porta podem ficar comprometidos se as bolsas forem autoclavadas duas vezes. Evite a condensação no filtro, permitindo que os sacos esfriem lentamente e completamente antes de removê-los da autoclave, pois o filtro do saco de crescimento ficará comprometido se ficar molhado.
    4. Inocular os grãos.
      1. Trabalhando com a placa de cultura e o saco em um armário de biossegurança, discos de ágar cortados, 6 mm de diâmetro, da zona de crescimento ativo na placa de cultura com um furo de cortiça #4 de tamanho estéril. Desdobre o saco. Usando uma técnica estrita estéril, coloque 5 discos de ágar no saco. Use um cilindro graduado estéril de 50 mL para medir 35 mL de água estéril da torneira e adicioná-lo ao saco.
      2. Enrole um pouco a abertura do saco e depois pulverize o exterior com 70% de etanol para esterilizar a superfície.
        NOTA: Não pulverize o filtro, pois essa umidade também o comprometerá.
      3. Feche o saco dobrando os cantos em direção ao centro e, em seguida, mais de duas vezes acima do filtro. Fixar o saco com grampos de saco e tubos de vinil transparentes fornecidos pelo fabricante.
        NOTA: Os grampos são reutilizáveis.
      4. Remova o saco do armário de biossegurança.
    5. Armazene o patógeno para crescimento.
      1. Guarde a bolsa ereto. Certifique-se de que o filtro seja retirado do lado oposto do saco para permitir a troca máxima de gás (Figura 5D).
      2. Incubar os materiais em temperatura ambiente por aproximadamente três semanas. Redistribua os grãos regularmente para garantir o crescimento do patógeno.
        NOTA: As bolsas não são reutilizáveis.
  2. Infecção de mudas de melancia com grãos infestados
    1. Sementes de melancia de origem como descrito anteriormente.
    2. Determine os grupos experimentais.
      NOTA: A única cepa do patógeno necessária são os isolados que estão sendo testados para identificação de raça. No entanto, controles negativos e positivos ajudarão a fazer comparações com plantas sem infecção ou um nível específico de infecção.
      1. Para preparar um controle negativo, utilize grãos de trigo esterilizados de acordo com o método anteriormente mencionado, mas sem inoculação.
      2. Para preparar um controle positivo, use grãos de trigo inoculados com uma cepa já classificada para comparação com o isolado desconhecido.
    3. Misture solo e grãos.
      1. Meça 14 grãos de grãos infestados em um grande saco plástico (Figura 5E). Encha potes plásticos (15 cm de diâmetro x 10 cm de altura) com mistura de vasos para medir a quantidade de mistura necessária. Esvazie a mistura no saco. Crie uma almofada de ar no saco e torça ou sele-a fechada.
      2. Misture os grãos e o solo invertendo o saco várias vezes. Para um controle negativo, realize o mesmo processo em uma bolsa diferente com grãos limpos. Para um controle positivo, realize o mesmo processo em uma bolsa diferente com grãos infestados com a cepa de comparação.
      3. Encha quatro potes esterilizados pela superfície com a mistura de solo infestada. Para um controle negativo, pote essa mistura antes de manusear qualquer solo contaminado por Fon.
    4. Semear as sementes de melancia.
      1. Semear seis sementes em cada panela. Certifique-se de que cada pote contém apenas sementes de uma cultivar. Posicione as sementes com o ápice da semente voltada para cima para permitir o crescimento adequado durante o surgimento (Figura 6A).
      2. Usando uma garrafa de spray, molhe a parte superior de 0,3-0,6 cm de solo com água. Coloque um prato de plástico transparente (15 cm de diâmetro) sobre cada panela para criar um ambiente úmido para germinação de sementes (Figura 6B).
    5. Estabelecer condições de crescimento.
      1. Rega os potes três vezes ao dia com uma garrafa de spray para manter a turísia sem escoamento até que as sementes germinem (aproximadamente 5 dias).
        NOTA: A quantidade de água utilizada aumentará com o tamanho da planta e o tamanho do vaso.
      2. Uma vez que as sementes tenham germinado, mova o prato superior para a parte inferior da panela.
      3. Regar as plantas diariamente conforme necessário para o crescimento ideal da planta. Exponha as plantas a um fotoperíodo de 16 horas em condições de iluminação semelhantes às descritas anteriormente e a uma temperatura de 27 °C (± 1 °C).

3. Determinando a raça pelo método modificado de mergulho de bandeja (MTDM)

  1. Preparação dos materiais para inoculações
    1. Estabeleça condições de plantio.
      1. Encha 48 células (3,68 cm de largura x 5,98 cm de comprimento x 4,69 cm de profundidade) insere com areia pasteurizada a vapor: turfa: vermiculite (4:1:1) e bata para baixo para comprimir ligeiramente o solo. Coloque as pastilhas em bandejas plásticas (27,9 cm de largura x 53,3 cm de comprimento x 5,1 cm de profundidade).
      2. Semear as sementes com seu ápice (extremidade proximal) apontando para cima a uma profundidade igual ao seu comprimento.
      3. Fonte das sementes como descrito anteriormente.
      4. Depois, mantenha a mídia úmida por neblina por 20 s a cada 180 minutos ou rega à mão uma vez por dia.
      5. Após a germinação (aproximadamente 5 dias), a água uma vez por dia e conforme necessário para suportar o crescimento das mudas.
    2. Prepare a mídia.
      1. Prepare o meio qPDA adicionando 5.625 g de ágar granulado a 500 mL de água destilada; adicionar 4,875 g de dextrose de batata ágar. Misture bem os ingredientes, autoclave e esfrie a 50 °C antes de derramar em pratos estéreis de Petri. Sele as placas de Petri com parafilm e guarde os pratos em uma geladeira (4 °C) até usar.
      2. Para preparar o caldo médio, pese e adicione 24 g de dextrose de batata em uma garrafa de 1 L. Leve a mistura a 1000 mL adicionando água destilada à garrafa, e coloque a garrafa em uma placa quente e mexa até dissolver. Dispense 100 mL do caldo em frascos de Erlenmeyer de 250 mL. Use pano de queijo para selar os frascos e autoclave.
    3. Prepare o inóculo.
      1. Sete dias antes do plantio, inocular cinco placas qPDA com papelinfiltrado 28 e armazená-las em uma área incubada por oito dias em um ciclo escuro de 14 h/10 h22.
      2. No sétimo dia, transfira dois plugues de 1 cm2 ágar em cada frasco de 250 mL Erlenmeyer contendo dextrose de batata de 100 mL. Coloque os frascos de Erlenmeyer em um shaker de bancada a 200 rpm por 7 dias em um ciclo claro/escuro de 14 horas/10h.
      3. No dia da inoculação (14 dias após a semeadura), colhe os esporos filtrando o inóculo através de quatro camadas de pano de queijo estéril.
      4. Determine a concentração microconidial nos frascos usando um hemócito como descrito anteriormente. Prepare uma suspensão inóculo 7 L em uma banheira de plástico (40,6 cm de largura x 67,3 cm de comprimento x 16,8 cm de profundidade) transferindo o volume correto de suspensão de esporos para água estéril para uma concentração final de esporos de 1 × 106 mL−1 (Figura 7A).
  2. Inoculação
    1. Quatorze dias após a semeadura (pelo menos primeiro estágio de folha verdadeira), transfira as pastilhas celulares com as mudas em bandejas de teia (26,9 cm de largura x 53,7 cm de comprimento x 6,28 cm de profundidade). Coloque delicadamente as bandejas com as mudas em uma banheira de plástico contendo a suspensão do 7 L inóculo. Inocular cada bandeja uma de cada vez (Figura 7B).
    2. Deixe as mudas permanecerem no inóculo sem serem perturbadas por 15 minutos. Após 15 minutos, transfira suavemente as pastilhas celulares contendo as mudas inoculadas em bandejas sem orifícios (largura de 27,9 cm x 53,3 cm de comprimento x 5,1 cm de profundidade). Repita este processo para cada bandeja.
    3. Coloque as bandejas sem buracos no banco da estufa e na água, conforme necessário. Mantenha a mesma iluminação e condições ambientais descritas para o bioensaio de mergulho radicular.

4. Classificação de doenças

  1. Selecione intervalos de tempo para classificação.
    1. Para os métodos de mergulho de raiz e de mergulho de bandeja modificado, comece a classificar uma semana após as plantações serem inoculadas e continue semanalmente por mais quatro semanas.
      NOTA: O conjunto de dados combinado incluirá cinco conjuntos de observações durante este período.
    2. Ao usar o método do kernel, só comece a classificar quando as mudas surgirem e continuar semanalmente para um total de seis classificações.
  2. Observe e calcule a incidência.
    1. Durante cada classificação, tire imagens digitais para documentar o progresso da doença.
    2. Relatar a incidência de murchar e morrer vegetal. Calcule a incidência tomando a soma das plantas sintomáticas em comparação com o controle saudável e o número de plantas mortas como proporção do número total de plantas naquela cultivar.
  3. Analise os resultados. Compare os padrões de infecção entre as cultivares e entre os grupos de experimentos se foram utilizados controles.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esses experimentos ajudam a definir a resistência relativa de cultivares comumente cultivadas (Tabela 1). Essas informações podem então ser usadas para orientar recomendações de gerenciamento com base nas populações locais de Fon. Em outras palavras, se a raça 0 ou 1 é conhecida por estar presente em um campo comercial, então o agricultor pode estar inclinado a crescer uma variedade "resistente" como Calhoun Gray, Sunsugar, ou equivalente. Os resultados dos bioensativos utilizando todos os métodos mostra...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Três métodos de digitação racial foram apresentados. Cada um desses métodos é mais adequado para questões particulares e condições experimentais. O método de inoculação de kernel infestado (infestação do solo) é talvez mais simples e simples, tornando-o especialmente útil para a avaliação da patogenicidade30. Usar este método para digitação de raça simples é altamente eficaz. No entanto, a aplicação do método para determinar a resistência de uma cultivar específica pode ser um desafio, uma vez que...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gostaríamos de reconhecer o Dr. Ali e o Laboratório de Diagnóstico Molecular vegetal, bem como o Dr. Pingsheng Ji da Universidade da Geórgia, cuja liderança e apoio ajudaram a estabelecer nosso programa Fon.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
100% mais cheio' s EarthSigma-AldrichF200-5KG
1 L frasco de vidro ErlenmeyerPYREX4980-1L
15 mL tubos de falcãoFisher Scientific14-959-49B
50 mL cilindro graduadoFornecimento de Segurança de Laboratório41121805
50 mL Eppendorf Tubos CônicosFisher Scientific05-413-921
Embalagemde folha de alumínioReynolds Wrap720
BleachWalmart587192290
Bico de BunsenFisher Scientific03-391-301
CaCO3sigma-Aldrich239216
espalhadores de célulasFisher Scientific08-100-11
GazeclothLions Services, Inc8305-01-125-0725
Pratos de plástico transparenteVisions Wave999RP6CLSS~15 cm de diâmetro
Tubo de vinil transparente para braçadeiras de saco de cogumeloShroom Supply6" para saco pequeno, 8" para saco médio, 10" para saco grande
Bolas de AlgodãoFisherbrand22-456-885Etanol Estéril
Fisher ChemicalA4094100%, depois combine com água para fazer 70% para uso
Luzes de tubo fluorescenteMaxLumeModelo T52800 K Temperatura de cor, ágar granulado de 24'' ou 48'' de comprimento
VWR International90000-786
Garrafa de spray portátilCapacidade Umde 24122002~0,95 L
Fisher Scientific02-671-55AHemacitômetro de duas câmaras
Bandejas delaboratórioFisher Scientific15-236-2A
Sacos plásticos grandes e seláveisZiploc43080538 cm x 38 cm
Mister / regadorBar5FB10H22
Grampo de Saco de CogumeloShroom Supply6" para saco pequeno, 8" para saco médio, 10" para saco grande
Luvas de NitriloFisher Scientific19-130-1597D
Orgânico Rye BerriesShroom SupplySacos de 0,5 galão ou 25 lb
Pipeta e pontas P1000 PlacasFisher Scientific14-388-100
FisherbrandFB0875713Redondo, 100 mm de diâmetro, 15 mm de altura
Meio de plantioJolly GardenerPro-Line C/B
Jarro de PlásticoBrandTechUX06008501 L ou maior
Vasos de plantio de plásticoNeo/SCI01-1177~15 cm de diâmetro e ~10 cm
de altura Contentor de plástico, seguro para autoclaveThermo ScientificUX06010223 L
Meio de ágar dextrose de batata de um quarto de forçaCole-ParmerUX1420028Use pó em combinação com a receita da Balança Científica QPDA
, medindo em gOhaus30208458Qualquer escala precisa que possa conter e medir 200g funcionará
Tamanho #4 furo de cortiçaCole-ParmerNC9585352
Pequeno saco de cultivo de cogumelosFiltro Shroom Supply0.5 micron, também vem em tamanhos médios e grandes
Espátula de soloWalmart563876946
Planos de isopor (6 x 12 células)Modelo SpeedlingTR72A
Planos de isopor (8 x 16 células)SpeedlingModelo TR128A
Seringa (5 ou 10 mL)fisher Scientific14-829-19C
TimerWalmartTM-01
V8 Original 100% Suco de VegetaisWalmart564638212
vortexFisher Scientific02-215-418
Semente de Melancia - Black DiamondWillhite Seed Inc17
Semente de melancia - Calhoun GrayHolmes Seed Company4440
Semente de melancia - Charleston GrayBonnie Plants7.15339E+11
Semente de melancia - PI 296341-FREntre em contato com os autoresEntre em contato com os autores
Grãos de trigo (Maxie var.) (opcional)Alachua County Feed & Semente
hemacitômetro de Petri

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Edel-Hermann, V., Lecomte, C. Current status of Fusarium oxysporum formae speciales and races. Phytopathology. 109 (4), 512-530 (2019).
  2. Everts, K. L., Himmelstein, J. C. Fusarium wilt of watermelon: Towards sustainable management of a re-emerging plant disease. Crop Protection. 73, 93-99 (2015).
  3. Martyn, R. Cucurbitaceae 2012. Proceedings of the Xth EUCARPIA Meeting on Genetics and Breeding of Cucurbitaceae. , University of Cukurova, Ziraat Fakultesi. Antalya, Turkey. 136-156 (2012).
  4. Roberts, P., Dufault, N., Hochmuth, R., Vallad, G., Paret, M. [PP352] Fusarium wilt (Fusarium oxysporum f. sp. niveum) of watermelon. EDIS. 2019 (5), 4(2019).
  5. Keinath, A. Integrated management for Fusarium wilt of watermelon. Land-Grant Press by Clemson Extension, LGP 1022. , Available from: http://lgpress.clemson.edu/publication/integrated-management-for-fusarium-wilt-of-watermelon (2019).
  6. Costa, A. E. S., et al. Resistance to Fusarium wilt in watermelon accessions inoculated by chlamydospores. Scientia Horticulturae. 228, 181-186 (2018).
  7. Lombard, L., Sandoval-Denis, M., Lamprecht, S. C., Crous, P. Epitypification of Fusarium oxysporum-clearing the taxonomic chaos. Persoonia: Molecular Phylogeny and Evolution of Fungi. 43, 1(2019).
  8. Martyn, R. D. Fusarium wilt of watermelon: 120 years of research. Horticultural Reviews. 42 (1), 349-442 (2014).
  9. Zhou, X., Everts, K. Characterization of a regional population of Fusarium oxysporum f. sp. niveum by race, cross pathogenicity, and vegetative compatibility. Phytopathology. 97 (4), 461-469 (2007).
  10. Zhou, X., Everts, K., Bruton, B. Race 3, a new and highly virulent race of Fusarium oxysporum f. sp. niveum causing Fusarium wilt in watermelon. Plant Disease. 94 (1), 92-98 (2010).
  11. Leslie, J. F., Summerell, B. A. The Fusarium laboratory manual. , John Wiley & Sons. (2008).
  12. Lo Presti, L., et al. Fungal effectors and plant susceptibility. Annual Review of Plant Biology. 66, 513-545 (2015).
  13. Niu, X., et al. The FonSIX6 gene acts as an avirulence effector in the Fusarium oxysporum f. sp. niveum-watermelon pathosystem. Scientific Reports. 6 (1), 1-7 (2016).
  14. Lievens, B., Houterman, P. M., Rep, M. Effector gene screening allows unambiguous identification of Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici races and discrimination from other formae speciales. FEMS Microbiology Letters. 300 (2), 201-215 (2009).
  15. Houterman, P. M., Cornelissen, B. J., Rep, M. Suppression of plant resistance gene-based immunity by a fungal effector. PLoS Pathogens. 4 (5), 1000061(2008).
  16. Houterman, P. M., et al. The effector protein Avr2 of the xylem-colonizing fungus Fusarium oxysporum activates the tomato resistance protein I-2 intracellularly. The Plant Journal. 58 (6), 970-978 (2009).
  17. Czislowski, E., et al. Investigation of the diversity of effector genes in the banana pathogen, Fusarium oxysporum f. sp. cubense, reveals evidence of horizontal gene transfer. Molecular Plant Pathology. 19 (5), 1155-1171 (2018).
  18. Batson, A. M., Fokkens, L., Rep, M., du Toit, L. J. Putative effector genes distinguish two pathogenicity groups of Fusarium oxysporum f. sp. spinaciae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 34 (2), 141-156 (2021).
  19. Keinath, A. P., DuBose, V. B., Katawczik, M. M., Wechter, W. P. Identifying races of Fusarium oxysporum f. sp. niveum in South Carolina recovered from watermelon seedlings, plants, and field soil. Plant Disease. 104 (9), 2481-2488 (2020).
  20. Gordon, T. R. Fusarium oxysporum and the Fusarium wilt syndrome. Annual Review of Phytopathology. 55, 23-39 (2017).
  21. Martyn, R., Netzer, D. Resistance to races 0, 1, and 2 of Fusarium wilt of watermelon in Citrullus sp. PI-296341-FR. HortScience. 26 (4), 429-432 (1991).
  22. Meru, G., McGregor, C. Genotyping by sequencing for SNP discovery and genetic mapping of resistance to race 1 of Fusarium oxysporum in watermelon. Scientia Horticulturae. 209, 31-40 (2016).
  23. Freeman, S., Rodriguez, R. A rapid inoculation technique for assessing pathogenicity of Fusarium oxysporum f. sp. niveum and F. o. melonis on cucurbits. Plant Disease. 77 (12), 1198-1201 (1993).
  24. Martyn, R. Fusarium oxysporum f. sp. niveum race 2: A highly aggressive race new to the United States. Plant Disease. 71 (3), 233-236 (1987).
  25. Lai, X., et al. Evaluating inoculation methods to infect sugar beet with Fusarium oxysporum f. Beat and F. secorum. Plant Disease. 104 (5), 1312-1317 (2020).
  26. Kirk, W., et al. Optimizing fungicide timing for the control of Rhizoctonia crown and root rot of sugar beet using soil temperature and plant growth stages. Plant Disease. 92 (7), 1091-1098 (2008).
  27. Ferguson, A., Jeffers, S. Detecting multiple species of Phytophthora in container mixes from ornamental crop nurseries. Plant Disease. 83 (12), 1129-1136 (1999).
  28. Fong, Y., Anuar, S., Lim, H., Tham, F., Sanderson, F. A modified filter paper technique for long-term preservation of some fungal cultures. Mycologist. 14 (3), 127-130 (2000).
  29. Rice, W. N. The hemocytometer method for detecting fungus spore load carried by wheat. Proceedings of the Association of Official Seed Analysts of North America. 31, 124-127 (1939).
  30. Kleczewski, N. M., Egel, D. S. A diagnostic guide for Fusarium wilt of watermelon. Plant Health Progress. 12 (1), 27(2011).
  31. Dhingra, O. D., Sinclair, J. B. Basic plant pathology methods. , CRC Press. (2017).
  32. Latin, R., Snell, S. Comparison of methods for inoculation of muskmelon with Fusarium oxysporum f. sp. melonis. Plant Disease. 70 (4), 297-300 (1986).
  33. Martyn, R. An iInitial survey of the United States for races of Fursarium oxysporum f. HortScience. 24 (4), 696-698 (1989).
  34. Zhou, X., Everts, K. Races and inoculum density of Fusarium oxysporum f. sp. niveum in commercial watermelon fields in Maryland and Delaware. Plant Disease. 87 (6), 692-698 (2003).
  35. Fulton, J. C., et al. Phylogenetic and phenotypic characterization of Fusarium oxysporum f. sp. niveum isolates from Florida-grown watermelon. PLoS One. 16 (3), 0248364(2021).
  36. Zhou, X., Everts, K. Quantification of root and stem colonization of watermelon by Fusarium oxysporum f. sp. niveum and its use in evaluating resistance. Phytopathology. 94 (8), 832-841 (2004).
  37. Nutter, F. W., Esker, P. D., Netto, R. A. C. Disease assessment concepts and the advancements made in improving the accuracy and precision of plant disease data. European Journal of Plant Pathology. 115 (1), 95-103 (2006).
  38. Nutter, F., Gleason, M., Jenco, J., Christians, N. Assessing the accuracy, intra-rater repeatability, and inter-rater reliability of disease assessment systems. Phytopathology. 83 (8), 806-812 (1993).
  39. Chiang, K. -S., Bock, C. H., Lee, I. -H., El Jarroudi, M., Delfosse, P. Plant disease severity assessment-how rater bias, assessment method, and experimental design affect hypothesis testing and resource use efficiency. Phytopathology. 106 (12), 1451-1464 (2016).
  40. Nita, M., Ellis, M., Madden, L. Reliability and accuracy of visual estimation of Phomopsis leaf blight of strawberry. Phytopathology. 93 (8), 995-1005 (2003).
  41. Zhang, Z., Zhang, J., Wang, Y., Zheng, X. Molecular detection of Fusarium oxysporum f. sp. niveum and Mycosphaerella melonis in infected plant tissues and soil. FEMS Microbiology Letters. 249 (1), 39-47 (2005).
  42. Lin, Y. -H., et al. Development of the molecular methods for rapid detection and differentiation of Fusarium oxysporum and F. oxysporum f. sp. niveum in Taiwan. New Biotechnology. 27 (4), 409-418 (2010).
  43. van Dam, P., de Sain, M., Ter Horst, A., vander Gragt, M., Rep, M. Use of comparative genomics-based markers for discrimination of host specificity in Fusarium oxysporum. Applied and Environmental Microbiology. 84 (1), 01868(2018).
  44. Baayen, R. P., et al. Gene genealogies and AFLP analyses in the Fusarium oxysporum complex identify monophyletic and nonmonophyletic formae speciales causing wilt and rot disease. Phytopathology. 90 (8), 891-900 (2000).
  45. O'Donnell, K., Kistler, H. C., Cigelnik, E., Ploetz, R. C. Multiple evolutionary origins of the fungus causing Panama disease of banana: concordant evidence from nuclear and mitochondrial gene genealogies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2044-2049 (1998).
  46. Laurence, M., Summerell, B., Liew, E. Fusarium oxysporum f. sp. canariensis: evidence for horizontal gene transfer of putative pathogenicity genes. Plant Pathology. 64 (5), 1068-1075 (2015).
  47. Hudson, O., et al. Marker development for differentiation of Fusarium oxysporum f. sp. Niveum race 3 from races 1 and 2. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 822(2021).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Murcha de FusariumDoen a da MelanciaTipagem de Ra aM todo de Imers o da RaizM todo do Gr o InfestadoM todo de Imers o em BandejaIsolado do Pat genoIncid ncia da Doen aCultivares Resistentes

Artigos relacionados