Os métodos aqui descritos descrevem um procedimento usado para reverter optogeneticamente a plasticidade induzida pela cocaína em um circuito comportamentalmente relevante em ratos. A estimulação óptica sustentada de baixa frequência das sinapses tálamo-amígdala induz depressão a longo prazo (LTD). A LTD induzida optogeneticamente in vivo em ratos com experiência em cocaína resultou na subsequente atenuação da procura de droga motivada por pistas.
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Artigo de método
Usando a optogenética para reverter a neuroplasticidade e inibir a busca de cocaína em ratos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Este protocolo demonstra os passos necessários para o uso de ferramentas optogenéticas para reverter a plasticidade induzida pela cocaína nos circuitos tálamo-amígdala para reduzir os comportamentos subsequentes de busca de cocaína no rato. Em nossa pesquisa, descobrimos que, quando os ratos autoadministram cocaína intravenosa emparelhada com uma sugestão audiovisual, as sinapses formadas nas entradas do núcleo geniculado medial do tálamo (MGN) nos neurônios principais da amígdala lateral (LA) tornam-se mais fortes à medida que a associação cue-cocaína é aprendida. Levantamos a hipótese de que a reversão da plasticidade induzida pela cocaína nessas sinapses reduziria o comportamento de busca de cocaína motivado por pistas. Para realizar esse tipo de neuromodulação in vivo, queríamos induzir depressão sináptica de longo prazo (LTD), que diminui a força das sinapses MGN-LA. Para tanto, utilizou-se a optogenética, que permite a neuromodulação dos circuitos cerebrais utilizando a luz. A opsina excitatória oChiEF foi expressa em terminais MGN pré-sinápticos no AL por infusão de um AAV contendo oChiEF no MGN. Fibras ópticas foram então implantadas no AL e a luz laser de 473 nm foi pulsada na frequência de 1 Hz por 15 minutos para induzir LTD e reverter a plasticidade induzida pela cocaína. Essa manipulação produz uma redução duradoura na capacidade das pistas associadas à cocaína de induzir ações de busca de drogas.
Introdução
O abuso de substâncias é um problema de saúde pública muito sério nos EUA e no mundo. Apesar de décadas de intensa pesquisa, existem pouquíssimas opções terapêuticas efetivas 1,2. Um grande revés para o tratamento é o fato de que o uso crônico de drogas gera memórias associativas de longo prazo entre pistas ambientais e a própria droga. A reexposição a pistas relacionadas a drogas impulsiona respostas fisiológicas e comportamentais que motivam o uso contínuo de drogas e a recaída3. Uma nova estratégia terapêutica é promulgar tratamentos baseados na memória que visam manipular os circuit....
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Protocolo
Os experimentos descritos neste protocolo foram consistentes com as diretrizes estabelecidas pelo National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Pittsburgh. Todos os procedimentos foram realizados com ratos Sprague-Dawley adultos e ingênuos que pesavam 275-325 g na chegada.
1. Construção de implantes de fibra óptica e cabos de remendo
- Preparar implantes de fibra óptica seguindo protocolos previamente publicados9. Os experimentos descritos neste protocolo utili....
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Resultados
Uma linha do tempo descrevendo a ordem dos experimentos é mostrada na Figura 1. Ao longo de experimentos comportamentais, o número de infusões de cocaína, bem como o número de respostas feitas na alavanca ativa, servem como uma medida da intensidade do comportamento de busca de cocaína. Durante os primeiros dias de autoadministração de cocaína, o número de respostas ativas deve aumentar gradualmente em cada dia de aquisição, antes de se estabilizar durante a segunda semana. Por outro lado, a.......
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Discussão
Como descrito acima, existem várias etapas críticas que são importantes para alcançar os resultados experimentais adequados. O protocolo provavelmente só será eficaz em animais que adquirem adequadamente a autoadministração de cocaína e, até o momento, ele só foi testado usando os parâmetros descritos acima. É possível que a dose de cocaína, o esquema de reforço e os parâmetros de sinalização possam ser modificados com provavelmente pouco efeito sobre os resultados comportamentais, com a exceção de que um esquema de refo.......
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Divulgações
Nada a divulgar.
Agradecimentos
Os autores desejam reconhecer o apoio dos subsídios da USPHS K01DA031745 (MMT), R01DA042029 (MMT), DA035805 (YHH), F31DA039646 (MTR), T32031111 (MTR) e do Departamento de Saúde da Pensilvânia.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,9% de solução salina | Fisher Scientific | NC0291799 | |
| A.M.P.I. Isolador de estímulo | Iso-Flex | ||
| AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomato | Duke Viral Vector Core (via Roger Tsien) | #268 | Ver Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014 |
| AAV5.hSyn.tdTomato (Controle) | Duke Viral Vector Core Control | Ver Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014 | |
| Lágrimas Artificiais (Pomada Oftálmica) | Covetrus | 70349 | |
| ATP Sal de Magnésio | Fisher Scientific | A9187 | |
| Betadine | Butler Schein | 38250 | |
| Cloreto de cálcio | Fisher Scientific | C1016 | |
| Cloreto de césio | Fisher Scientific | 289329 | |
| Césio hidróxido | Fisher Scientific | 516988 | |
| Cesio metanossulfonato | Fisher Scientific | C1426 | |
| Cocaína HCl | NIDA Centro de Abastecimento de Drogas | 9041-001 | |
| Criostato | Leica | CM1950 | |
| D-Glicose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-1 | |
| Controlador de Temperatura de Canal Duplo | Warner Instruments | TC-344C | |
| EGTA | Fisher Scientific | E3889 | |
| Etanol | Universidade de Pittsburgh Química Stockroom | 200C5000 | |
| Tampas de Poeira de Virola | Thor Labs | CAPL | Capas de poeira de plástico branco para 1,25 mm Virolas |
| Mangas de Acoplamento de Virola | Lentes Dóricas | F210-3011 | Sleeve_BR_1.25, Bronze, 1.25 mm ID |
| Ferrules | Produtos de Fibra de Precisão | MM-FER2007C-2300 | Ø virola cerâmica multimodo de 1,25 milímetros LC/PC, Ø 230 μ m tamanho do furo |
| Fibra Óptica | Thor Labs | FP200URT | 200 μ Fibra multimodo de núcleo m (0,5 NA) |
| Junta rotativa de fibra óptica | Prizmatix | (Encomendado na Amazon) | Conector FC-FC de 18 mm de diâmetro, conector FC-FC para fibra |
| Ferramenta de decapagem de fibra | Thor Labs | T12S21 | |
| Fluoroshield com DAPI | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Gentamicina | Henry Schein | 6913 | |
| GTP Sal de Sódio | Fisher Scientific | Seringa G8877 | |
| Hamilton | Hamilton | 80085 | 10 μ L volume, calibre 26, 2 polegadas, estilo de ponto 3 |
| Pistola de Calor | Allied Electronics | 972-6966 | 250 V, 750-800 ° F |
| Fibra de Precisão | Epóxi Curável por Calor | PFP-353ND-8OZ | |
| Heparina | Henry Schein | 55737 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Ácido Clorídrico | Fisher Scientific | 219405490 | |
| Isoflurano | Henry Schein | 29405 | |
| Cetamina HCl | Henry Schein | 55853 | A cetamina é uma substância controlada e deve ser manuseada de acordo com as diretrizes institucionais |
| Lactato Ringer' s | Henry Schein | 9846 | |
| Laser, driver e acoplador de laser-para-fibra | OEM Laser Systems | BL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0 | 100 mW, 473-nm, laser de estado sólido bombeado por diodo (Uma opção) |
| L-glutationa | Fisher Scientific | G4251 | |
| Lidocaína | Butler Schein | 14583 | |
| Sensor de Luz | Thor Labs | PM100D | Console compacto do medidor de energia com display digital |
| Loctite adesivo instantâneo | Grainger | 5E207 | |
| Sulfato de magnésio | Sigma-Aldrich | 203726 | |
| Amplificador de microeletrodo / Dispositivos | moleculares | MULTICLAMP700B / Digidata 1440A | |
| Bomba microinjetora | Harvard Apparatus | 70-4501 | Seringa dupla |
| Micromanipulador | Sutter Instruments | MPC-200/ROE-200 | |
| Microscópio | Olympus | BX51WI | Microscópio vertical para eletrofisiologia |
| Microscópio | Olympus | BX61VS | Microscópio epifluorescente de varredura de lâminas |
| N-metil-D-glucamina | Sigma-Aldrich | M2004 | |
| Orthojet cimento dentário, líquido | Lang Dental | 1504BLK | cimento dental Orthojet preto |
| , pó | Lang Dental | 1530BLK | Pó contemporâneo, |
| paraformaldeído | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Thor Labs | FP200ERT | Multimodo, Tubulação FT030 | |
| Picrotoxina | Fisher Scientific | AC131210010 | |
| Disco de Polimento | Thor Labs | D50FC | |
| Almofada de Polimento | Thor Labs | NRS913 | 9" x 13" |
| Papel de Polimento | Thor Labs | LFG5P | 5 μ Papel |
| de Polimento | Thor Labs | LFG3P | 3 μ Papel |
| de Polimento | Thor Labs | LFG1P | 1 μ Papel |
| de Polimento | Thor Labs | LFG03P | 0.3 μ grão m |
| Cloreto | de potássio Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Hidróxido de potássio | Fisher Scientific | P5958 | |
| Metanossulfonato de potássio | Fisher Scientific | 83000 | |
| QX-314-Cl | Alomone Labs | Q-150 | |
| Rimadyl (Carprofeno) | Henry Schein | 24751 | |
| Autoadministração Chambers/Software | Med Associates | MED-NP5L-D1 | |
| Bicarbonato de sódio | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Cloreto de sódio | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Hidróxido de sódio | Sigma-Aldrich | 1064980500 | |
| L-ascorbato de sódio | Sigma-Aldrich | A7631 | |
| Pentobarbital de sódio | Henry Schein | 24352 | |
| Fosfato de sódio | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Fosfocreatina de sódio | Fisher Scientific | P7936 | |
| Piruvato de sódio | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Parafusos de máquina de aço inoxidável | WW Grainger | Parafuso de Máquina 6GB25 | M2-0.40mm, Panela, Phillips, Aço Inoxidável A2, Simples, Comprimento de 3 mm |
| Adaptador estereotáxico para ferrules | Thor Labs | XCL | |
| Estrutura Estereotáxica | Stoelting | 51603 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Fio de Sutura | Fine Science Tools | 18020-50 | Fio de seda; Tamanho: 5/0, Diâmetro: 0,12 mm |
| Cloreto de chá | Fisher Scientific | T2265 | |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
| Vetbond Adesivo de Tecido | Covetrus | 001505 | |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Xylazine | Butler Schein | 33198 |
Referências
- Connors, N. J., Hoffman, R. S. Experimental treatments for cocaine toxicity: A difficult transition to the bedside. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 347 (2), 251-257 (2013).
- Makani, R., Pradhan, B., Shah, U., Parikh, T.
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Reimpressões e permissões
