Summary
De her beskrevne metoder skitserer en procedure, der anvendes til optogenetisk omvendt kokaininduceret plasticitet i et adfærdsrelevant kredsløb hos rotter. Vedvarende lavfrekvent optisk stimulering af thalamo-amygdala synapser inducerer langvarig depression (LTD). In vivo optogetisk induceret LTD hos kokainerfarne rotter resulterede i den efterfølgende svækkelse af cue-motiveret stofsøgning.
Abstract
Denne protokol demonstrerer de trin, der er nødvendige for at bruge optogenetiske værktøjer til at vende kokaininduceret plasticitet ved thalamo-amygdala-kredsløb for at reducere efterfølgende kokainsøgende adfærd hos rotten. I vores forskning havde vi fundet ud af, at når rotter selv administrerer intravenøs kokain parret med et audiovisuelt signal, bliver synapser dannet ved input fra thalamusens mediale genikulatkerne (MGN) på de vigtigste neuroner i lateral amygdala (LA) stærkere, efterhånden som cue-kokainforeningen læres. Vi antog, at reversering af den kokaininducerede plasticitet ved disse synapser ville reducere cue-motiveret kokainsøgende adfærd. For at opnå denne type neuromodulation in vivo ønskede vi at fremkalde synaptisk langvarig depression (LTD), hvilket reducerer styrken af MGN-LA-synapser. Til dette formål brugte vi optogenetik, som tillader neuromodulering af hjernekredsløb ved hjælp af lys. Den excitatoriske opsin oChiEF blev udtrykt på præsynaptiske MGN-terminaler i LA ved infusion af en AAV indeholdende oChiEF i MGN. Optiske fibre blev derefter implanteret i LA, og 473 nm laserlys blev pulseret med en frekvens på 1 Hz i 15 minutter for at inducere LTD og omvendt kokaininduceret plasticitet. Denne manipulation giver en langvarig reduktion i evnen hos signaler forbundet med kokain til at fremkalde narkotikasøgningshandlinger.
Introduction
Stofmisbrug er et meget alvorligt folkesundhedsproblem i USA og over hele verden. På trods af årtiers intens forskning er der meget få effektive terapeutiske muligheder 1,2. Et stort tilbageslag for behandling er, at kronisk stofbrug genererer langsigtede associative minder mellem miljømæssige signaler og selve stoffet. Geneksponering for narkotikarelaterede signaler driver fysiologiske og adfærdsmæssige reaktioner, der motiverer fortsat stofbrug og tilbagefald3. En ny terapeutisk strategi er at vedtage hukommelsesbaserede behandlinger, der sigter mod at manipulere de kredsløb, der er involveret i regulering af lægemiddel-cue foreninger. For nylig blev det observeret, at synapser i lateral amygdala (LA), specifikt dem, der stammer fra thalamus mediale genikulatkerne (MGN), styrkes ved gentagen cue-associeret kokain-selvadministration, og at denne potensering kan understøtte kokainsøgende adfærd 4,5. Derfor blev det foreslået, at cue-induceret genindsættelse kunne dæmpes ved at vende plasticitet ved MGN-LA synapser.
Evnen til præcist at målrette den synaptiske plasticitet af et specifikt hjernekredsløb har været en stor udfordring for feltet. Traditionelle farmakologiske værktøjer har haft en vis succes med at reducere tilbagefaldsadfærd, men er begrænset af manglende evne til at manipulere individuelle synapser. Den seneste udvikling af in vivo optogenetik har imidlertid givet de nødvendige værktøjer til at overvinde disse begrænsninger og kontrollere neurale veje med tidsmæssig og rumlig præcision 6,7,8. Ved at udtrykke lysfølsomme opsiner i et specifikt hjernekredsløb kan laserlys derefter bruges til at aktivere eller hæmme kredsløbet. Frekvensafhængig optisk stimulering kan bruges til specifikt at manipulere kredsløbets synaptiske plasticitet i et dyr, der opfører sig.
Dette manuskript skitserer den procedure, der er taget for at manipulere det adfærdsmæssigt relevante MGN-LA-kredsløb ved hjælp af in vivo optogenetik. For det første blev excitatorisk opsin oChIEF udtrykt i MGN, og optiske fibre blev bilateralt implanteret i LA. Dyr blev derefter trænet til selv at administrere kokain på en cue-afhængig måde, hvilket forstærker MGN-LA-vejen. Dernæst blev vedvarende, lavfrekvent stimulering med 473 nm laserlys brugt til at producere kredsløbsspecifik LTD. At vende plasticiteten induceret af kokainbrug genererede en langvarig reduktion i signalernes evne til at udløse handlinger, der er forbundet med stofsøgende adfærd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Eksperimenterne beskrevet i denne protokol var i overensstemmelse med retningslinjerne fra National Institutes of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals og blev godkendt af University of Pittsburghs Institutional Animal Care and Use Committee. Alle procedurer blev udført med voksne, naive Sprague-Dawley rotter, der vejede 275-325 g ved ankomsten.
1. Konstruktion af optiske fiberimplantater og patchkabler
- Forbered optiske fiberimplantater efter tidligere offentliggjorte protokoller9. Eksperimenter beskrevet i denne protokol anvendte 200 μm kernefiber (0,5 NA) og Ø1,25 mm Multimode LC/PC keramisk ferrule, Ø230 μm hulstørrelse.
- Brug et Dremel-værktøj til at score den nederste tredjedel af en ferrule (tættest på den flade ende af ferrule). Scoring af ferrules hjælper dem med at forblive fastgjort til tandcement, hvilket øger sandsynligheden for, at de forbliver sikre gennem hele omfanget af eksperimenter.
- Brug trådskærere til at skære ~ 35 mm fiber. Brug fiberstripningsværktøj til at strippe ~ 25 mm fiber, så 10 mm ikke er eksponeret.
- Forbered varmehærdende epoxy i henhold til producentens anvisninger. Opløs 1 g harpikspulver i 100 mg hærderforbindelse. Sæt en stumpet 25-gauge kanyle på en 1 ml sprøjte. Fyld sprøjten med epoxy og fastgør en stumpet 25-gauge nålespids.
- Brug en skruestik eller klemme til sikkert at holde ferrule med den flade side opad og den konvekse side nedad. Med den epoxyfyldte sprøjte tilsættes en dråbe epoxy til den flade side af ferrule, idet du er forsigtig med at tørre overskydende epoxy fra siderne af ferrule.
- Indsæt den strippede del af fiber gennem ferrulen, så der udsættes yderligere 5 mm strippet fiber. I tilfælde af LA-implantater implanteres fiberen 7,9 mm ventral til bregma, så den udsatte længde af ikke-strippet fiber skal være ~ 13 mm.
- Hærd epoxyen med en varmepistol i ca. 30-40 s, indtil den bliver sort/ravfarvet.
- Scor fiberen direkte ved grænsefladen mellem den konvekse ende af ferrule med diamantkniv og brug en finger til forsigtigt at banke fiberen af.
- Poler den konvekse ende af ferrule ved at holde med en hæmostat, sørg for at anvende jævnt tryk og lav 20 cirkulære rotationer hver på en række poleringspapir (fra høj kvalitet til lav kvalitet; 5, 3, 1, 0,3 μm).
- Fastgør ikke-strippet fiber til bordet ved hjælp af tape og score strippet fiber, hvilket efterlader ekstra 2 mm ud over den ventrale koordinat (For LA-implantater er fiberens endelige længde ~ 10 mm). Brug en hemostat til at trække i ferrule og jævnt bryde fiberen, hvor den er blevet scoret. Pas på ikke at skære fiber helt, når du scorer, ellers vil fiberens kerne blive beskadiget.
- Byg patchkabler, der er kompatible med optiske fiberimplantater. Specialdesignede patchkabler blev købt (Se materialetabel). Alternativt kan patchkabler konstrueres efter tidligere offentliggjorte protokoller9.
BEMÆRK: Diameteren og NA af ferrulefiberen og patchkabelfiberen skal matche ved koblingskrydset for at forhindre overskydende tab af lys, hvilket kan resultere i manglende stimulering af neural aktivitet tilstrækkeligt. - Mål lysudbyttet gennem plasterkablet og optiske fiberimplantater ved at fastgøre patchkabel/optisk fiber til en passende laserlyskilde (473 nm, 1 mW output) og måle output med en lyssensor. En vellykket konstrueret fiber udsender en koncentrisk cirkel af lys og har ikke mere end 30% lystab.
2. Intravenøs kateterisering af gnavere, viruslevering og optisk fiberimplantation
- Forbered dyr til operation.
- Bedøm rotter fuldt ud med bedøvelse efter eget valg baseret på institutionelle retningslinjer. En mulighed er ketaminhydrochlorid (87,5-100 mg / kg, i.m.) og xylazinhydrochlorid (5 mg / kg, i.m.). Sørg for, at rotten er fuldt bedøvet ved at kontrollere for manglende tåklemmerefleks.
FORSIGTIG: Ketamin er et kontrolleret stof, der skal håndteres i henhold til institutionelle retningslinjer.
BEMÆRK: Intramuskulær injektion af anæstetika anvendes i denne undersøgelse, da den producerede en hurtigere og pålidelig anæstesiinduktion end intraperitoneal injektion. Overvåg løbende rottens åndedræt og reaktionsevne og giv termisk støtte under hele operationen. - Barber et stort område af rottens ryg (øvre ryg fra lige over skulderbladene til midten af ryggen) samt området af nakken under højre forben og hovedbunden.
- Placer rotten i det kirurgiske område og påfør puralube (kunstige tårer) på øjnene. Injicer et legemsvægtvolumen carprofen (smertestillende) subkutant (s.c.) gennem huden på den øvre del af ryggen, og injicer derefter 5 ml Lactated Ringer's opløsning s.c. gennem huden på lænden.
- Desinficer alle kirurgiske steder ved at fugte et stykke sterilt gaze med betadin og tørre det ned i det barberede kirurgiske område ved hjælp af en cirkulær bevægelse. Gentag derefter processen med 70% ethanol. Gentag denne vekslende cyklus tre gange.
- Bedøm rotter fuldt ud med bedøvelse efter eget valg baseret på institutionelle retningslinjer. En mulighed er ketaminhydrochlorid (87,5-100 mg / kg, i.m.) og xylazinhydrochlorid (5 mg / kg, i.m.). Sørg for, at rotten er fuldt bedøvet ved at kontrollere for manglende tåklemmerefleks.
- Udfør intravenøs kateterimplantation i henhold til tidligere offentliggjorte protokoller 4,10.
BEMÆRK: En kirurgisk drapering anvendes ikke under denne operation for at undgå irritation under kateterimplantation. Steriliser alle instrumenter og udstyr før brug. Brug sterile handsker og skift handskerne, hvis en ikke-steril overflade kommer i kontakt. - Umiddelbart efter kateterimplantationer fastgøres rotten i en stereotaksisk ramme for at udføre AAV-injektioner.
- Levere en subkutan (s.c) injektion af 2% lidokain (0,2-0,3 ml) til hovedbunden som lokalbedøvelse.
BEMÆRK: Lokalbedøvelse anvendes ikke under intravenøs kateterimplantation for at undgå ændringer i de kirurgiske resultater. - Tilslut en 26-gauge injektionskanyle i rustfrit stål til en Hamilton-sprøjte fyldt med 1 μL koncentreret AAV-opløsning: enten AAV5-hSyn-tdTomato eller AAV5-hSyn-oChIEF-tdTomato
BEMÆRK: oChIEF er en variant af den blålysfølsomme opsinkanalrhodopsin (ChR2), der kan reagere på en bred vifte af frekvenser 8,11 og derfor har nytte til de lavfrekvente LTD-eksperimenter, der diskuteres i denne protokol, men også til højfrekvente LTP-eksperimenter (ikke diskuteret her). oChIEF-konstruktionen blev doneret af Dr. Roger Tsien og behandlet til emballering og oprensning af Duke Viral Vector Core. Mindst 3-4 uger er nødvendig mellem injektionsdagen og dagen for LTD-induktion for at muliggøre optimal virusekspression i MGN-axonterminaler.
FORSIGTIG: Generelt betragtes AAV som en biosikkerhedsniveau 1 (BSL-1) organisme med lav risiko for selvinfektion, medmindre der anvendes en hjælpervirus i produktionen. Dens anvendelse kræver IACUC-godkendelse, og korrekt PPE skal til enhver tid anvendes i overensstemmelse med institutionelle retningslinjer for at begrænse unødvendig eksponering. - Brug en skalpel til at lave et 0,5 mm snit fra forsiden til bagsiden af kraniet, og fjern overliggende væv for at udsætte overfladen af kraniet.
- Juster rottens hoved i den forreste / bageste akse og nul stereotaksiske koordinater til bregma.
- Bor tre små huller gennem kraniet ved hjælp af et Dremel-værktøj udstyret med et lille bor. Brug skruetrækker til at montere skruer i rustfrit stål (M2x4 965-A2) på plads.
BEMÆRK: Skruer er nødvendige for korrekt binding af tandcement og oprettelse af robuste, langvarige hovedhætter. Placeringen af skruer skal spredes over kraniets forreste bageste akse og væk fra AAV-injektionsstedet. - Bor bilaterale huller til injektion af AAV baseret på koordinaterne fra rottehjerneatlasset (Watson og Paxinos)12 for den mediale del af den mediale genikulatkerne (MGN); i mm fra bregma, AP: -5,4; ML: ±3.0; DV: -6.6. Sænk langsomt injektionskanulerne (4 mm/min), indtil de er placeret i MGN. Injicer koncentreret AAV-opløsning med en hastighed på 0,1 μL/min.
- Lad injektionskanellen sidde i 5 minutter efter infusionerne er afsluttet for at muliggøre diffusion væk fra kanylen, og træk derefter langsomt kanylen ud af hjernen.
- Levere en subkutan (s.c) injektion af 2% lidokain (0,2-0,3 ml) til hovedbunden som lokalbedøvelse.
- Umiddelbart efter virusinjektioner skal du fortsætte med at implantere optiske fibre 4,9 rettet mod MGN-LA-terminaler.
- Brug et Dremel-værktøj til at bore bilaterale huller til optiske fiberimplantater rettet mod lateral amygdala (i mm fra bregma, AP: -3.0; ML ±5.1).
- Brug tang til at gribe fat i ferrule af optisk fiberimplantat og fastgør det til stereotaxic adaptere, så de holdes sikkert på plads.
- Sænk langsomt fibre med en hastighed på 2 mm / min, indtil spidsen af fiberen sidder i den dorsale del af LA (DV: -7,9 mm).
- Fastgør ferrules til kraniet først ved hjælp af et tyndt lag Loctite instant klæbemiddel, efterfulgt af tandcement og dækselferrules med ferruleærmer og støvdæksler med en diameter på 1,25 mm.
BEMÆRK: Valget af klæbemiddel til fastgørelse af ferrules til kraniet skal godkendes af den lokale eller institutionelle dyrepleje- og brugskomité. Loctite bruges til denne undersøgelse til pålideligt at fastgøre ferrules til kraniet efter forsøg og fejl med flere klæbemidler; Tilgængelige alternativer kan dog overvejes.
- Efter kirurgiske procedurer husrotter individuelt og giver fri adgang til mad og vand. Giv postoperativ pleje i overensstemmelse med institutionelle retningslinjer. Skyl katetre dagligt med saltvand indeholdende gentamicin (5 mg / ml) og heparin (30 USP / ml) for at opretholde patency. Mindst 5 dage efter operationen og 24 timer før starten af adfærdseksperimenter begrænser mad rotter til ~ 90% af deres frifodervægt.
3. Selvadministration af gnaverkokain og udryddelse af instrumentelle håndtag
BEMÆRK: Alle adfærdsmæssige procedurer udføres i standard operant konditioneringskamre, udstyret med to udtrækkelige håndtag på den ene væg, et stimuluslys over hvert håndtag, en tonegenerator, et huslys og en infusionspumpe.
- Udsæt rotter for daglige 1-timers kokain (2 mg / ml) selvadministrationstræningssessioner under en FR1-plan for forstærkning.
- Placer rotter i operantkammeret hver dag, og lad rotterne trykke på håndtaget. Et tryk på det angivne "aktive håndtag" (kontrabalanceret over venstre og højre håndtag) resulterer i en kokaininfusion (1,0 mg/kg/infusion) og en 10 s præsentation af et sammensat lys- og tonesignal. Et tryk på det angivne "inaktive håndtag" har ingen programmerede effekter.
- Fortsæt selvadministrationsforsøg i mindst 10 d, og indtil rotter med succes tjener mindst 8 infusioner / dag over 3 på hinanden følgende dage. Manglende opfyldelse af erhvervelseskriterier inden dag 20 resulterer i udelukkelse fra undersøgelsen.
- Efter erhvervelseskriterier er opfyldt med succes, udsættes rotter for 1 time instrumentelle udryddelsessessioner for 6-10 d.
- Placer rotter i operant kamre og lad rotter frit løfte presse. Svar på både de aktive og inaktive håndtag har dog ingen programmerede konsekvenser.
- Lad rotter fortsætte instrumental udryddelse dagligt, indtil der i gennemsnit forekommer < 25 håndtagstryk over to på hinanden følgende dage.
4. In vivo optogenetisk induktion af LTD
BEMÆRK: Optogenetiske hæmningseksperimenter finder sted 24 timer efter den sidste dag med instrumentel udryddelse.
- Tilslut patchkabler til en 473 nm blå laserdiode via et roterende led ophængt over et rent, standard gnaverhusbur med dækslet fjernet. Denne opsætning gør det muligt for gnavere frit at bevæge sig rundt i buret under den optogenetiske stimulering.
- Tænd laserdioden i henhold til betjeningsvejledningen, og tilslut til en pulsgenerator. Juster indstillingerne, så rotten, når den tændes, modtager 900 2-ms lysimpulser ved 1 Hz.
FORSIGTIG: Der skal altid anvendes korrekt øjenbeskyttelse under laserbetjening. - Mål lysintensiteten gennem patchledningen ved hjælp af en lyssensor. Juster laserens intensitet, så lysudbyttet gennem patchkablet er ~5-7 mW.
- Placer rotter i et rent boligbur. Fjern støvdæksler og ferrule-ærmer, og udsæt ferrules. Tilslut patchkabler bilateralt til de optiske fiberimplantater. Lad rotter udforske miljøet i 3 minutter før LTD-induktion.
- Tænd pulsgeneratoren for at starte optogenetisk stimulering.
BEMÆRK: Selvom det er usandsynligt, hvis rotte oplever bivirkninger på stimulering, afsluttes eksperimentet straks, og rotter aflives korrekt baseret på institutionelle retningslinjer. - Efter LTD-induktion skal du holde rotter i buret i 3 minutter og derefter placere dem tilbage i deres hjemmebure.
- Til kontrolforsøg skal du bruge den samme stimuleringsprocedure på rotter, der udtrykker AAV5-tdTomato-kontrolvirus. Til falske eksperimenter skal du fastgøre en patchledning til den optiske fiber hos rotter, der udtrykker AAV5-oChIEF-virussen, men der leveres ingen stimulering i løbet af en 15 minutters session.
5. Test effekten af optogenetisk stimulering på cue-induceret kokainsøgning
- 24 timer efter in vivo optogenetiske stimulationer anbringes rotterne tilbage i operante konditioneringskamre. Rotter udsættes for en 1-timers standard cue-induceret genindsættelsessession for at vurdere kokainsøgende adfærd.
BEMÆRK: Under cue-induceret genindsættelse giver et svar på det aktive håndtag en 10-s præsentation af det kokainassocierede cue, men ingen kokaininfusioner. - Giv en anden genindsættelsestest mindst 1 uge efter den første test for at afgøre, om optogenetisk LTD-induktion resulterer i en langvarig undertrykkelse af kokainsøgning
6. Farvning, fluorescens og billeddannelse til histologisk verifikation af viral ekspression og optisk fiberplacering
- Lav 1x fosfatbufret saltvand (PBS) og 4% paraformaldehyd (PFA). Opbevar begge opløsninger på is. Den samlede volumen afhænger af antallet af rotter i undersøgelsen (~100 ml PBS og 200 ml PFA vil blive anvendt pr. rotte).
FORSIGTIG: PFA er et giftigt kemikalie og kendt kræftfremkaldende stof. Vær omhyggelig med at undgå indånding samt kontakt med huden. Dens anvendelse og bortskaffelse bør være i overensstemmelse med institutionelle retningslinjer, herunder brugen af korrekte PV'er og en kemisk strømningshætte. - Opsæt peristaltisk pumpe med en flowhastighed på 20 ml/min. Fyld slangen på pumpen med 1x PBS. Sæt en stumpet 20-gauge nål på enden af slangen.
- Bedøvelse af rotter dybt med natriumpentobarbital (100 mg / kg, i.p.). Bekræft dybden af anæstesi ved manglende reaktion på tåklemmen, inden du fortsætter videre.
BEMÆRK: Natriumpentobarbital anvendes, da perfusionen er en terminal procedure. - Brug kirurgisk saks til at skære rottens bughule op under membranen. Skær gennem brystkassen rostralt langs sidekanterne for at udsætte rottens hjerte. Brug hemostat til at klemme den rostrale del af brystkassen væk fra hjertet. Skær væk alt overliggende fedtvæv, der omgiver hjertet.
- Indsæt den afstumpede nål gennem venstre ventrikel og op i aorta. Skær et lille hul i højre atrium for at dræne opløsningen, når den vender tilbage til hjertet.
- Perfus hver rotte med 1x PBS i 5 min efterfulgt af 4% PFA, pH 7,4 i 10 min.
- Halshug rotten, ekstraher hjernen og postfix den i 4% PFA i 24 timer. Overfør derefter hjernen til 30% saccharoseopløsning i 2-3 d.
- Sektionshjerner ved 50 μm ved hjælp af en kryostat.
- Monter alle skiver, der indeholder LA eller MGN, på glasskinner og dæksel.
- Billedskiver ved hjælp af et epifluorescerende mikroskop til at verificere AAV-oChIEF-tdTomato-ekspression i MGN og dets fremskrivninger til LA samt placering af den optiske fiber over LA.
7. Perfusion og akut hjerneskiveforberedelse til elektrofysiologiske eksperimenter
BEMÆRK: Elektrofysiologiske eksperimenter udføres på en delmængde af dyr for at validere succesen med in vivo LTD.
- Der fremstilles elektrofysiologiske opløsninger ved hjælp af de reagenser, der er anført i tabel 1-3 4,13. Alle opløsningers pH-værdi justeres til 7,4 med HCl, og osmolariteten justeres til 300-310 mOsm/kg H2O. Opløsningerne fremstilles friske før forsøgene og opbevares ved 4 °C i op til 1 uge. Mæt altid alle opløsninger med carbogen (95% O 2/5% CO2) under brug.
- Brug isofluran i henhold til de lokale eller institutionelle retningslinjer for dyrepleje og brug, bedøvelse af rotten dybt i et lukket eutanasikammer. Bekræft, at dyret er fuldt bedøvet via tåklemmerefleksen.
- Fyld et lille bægerglas med 50 ml iskold skæreopløsning. Fyld slangen på den peristaltiske pumpe med opløsning, og juster flowhastigheden til 20 ml/min. Sæt en stumpet 20-gauge nål på enden af slangen.
- Åbn bughulen (se trin 6.4 og 6.5) og perfusér kortvarigt rotten med skæreopløsning (maks. 1-2 min).
- Efter perfusion halshugges rotten straks. Hjernen fjernes og anbringes i et lille bægerglas fyldt med 4 °C skæreopløsning i 30 s-1 min.
- Overfør hjerner med en spatel og fastgør dem hurtigt til kammeret i et vibratom. Fjern pia med fine pincet. Fyld kammeret med 4 °C skæreopløsning, og forbered akutte koronale skiver (250 μm tykke) af amygdala med en hastighed på 0,37 mm/sek. og en frekvens på 70 Hz.
- Når skiverne er udvundet, anbringes hver enkelt i et opbevaringskammer fyldt med skæreopløsning og inkuberes ved 37 °C i 10-12 minutter. Ca. 5-7 skiver indeholdende LA kan opnås pr. Dyr.
- Overfør skiverne til et bægerglas med stuetemperatur (RT) opbevaringsopløsning, og lad dem komme sig i >30 minutter før forsøget.
BEMÆRK: Skiver forbliver generelt sunde, mens de holdes i holdopløsning i 4-6 timer. På grund af AAV's fluorescerende karakter holdes skiver under dårlige lysforhold.
8. Ex vivo elektrofysiologiske optagelser
- Forbered intracellulære opløsninger ved hjælp af de reagenser, der er anført i tabel 4-5.
BEMÆRK: Intracellulære opløsninger skal fremstilles forud for eksperimenter og kan opbevares på lang sigt (3-12 måneder) ved -80 °C eller kortvarigt (1-2 måneder) ved -20 °C. Opløsningerne justeres pH til 7,3 (med CsOH til Cs-baseret intracellulær opløsning og med KOH til K-baseret intracellulær opløsning). Juster til en endelig osmolaritet på 290-300 mOsm/kg H2O. - Der fremstilles 500 mM picrotoxinstamopløsning opløst i dimethylsulfoxid (DMSO).
BEMÆRK: Picrotoxinlagre alinoteres og opbevares ved -20 °C. På brugsdagen optøes delprøver og tilsættes til optagelsesopløsningen til en slutkoncentration på 100 μM.
FORSIGTIG: Picrotoxin er en ikke-konkurrencedygtig antagonist af GABAA-receptorer , så infusion af picrotoxin har en stimulerende virkning. Det er alvorligt giftigt ved oral indtagelse eller hudabsorption. Korrekt PPE skal altid bruges, når der arbejdes med picrotoxin. - Overfør skiver til et opretstående mikroskop designet til elektrofysiologiske eksperimenter.
- Under forsøgene koges perfuseringsskiver kontinuerligt med optageopløsning, der opvarmes til 31-33 °C.
- Forstør LA ved hjælp af en 4x-målsætning. Identificer de vigtigste neuroner ved morfologi med en 40x vandnedsænkningslinse.
- Brug en glaspipette (3-5 MΩ) fyldt med enten en Cs-baseret intracellulær opløsning (til spændingsklemmeeksperimenter) eller en K-baseret intracellulær opløsning (til aktuelle klemmeeksperimenter) til at opnå helcelleplasterklemmeoptagelser.
- Identificer AAV-inficerede MGN aksonale projektioner under fluorescens (ved hjælp af et RFP-filter). Stimuler projektioner ved hjælp af en DPSS-laser med blåt lys (473 nm), der er tilsluttet en pulsgenerator.
FORSIGTIG: For at begrænse lasereksponeringen kobles kollimeret laserlys til en fluorescerende port på mikroskopet og fokuseres på skiven gennem målet.
BEMÆRK: I spændingsklemmetilstand fremkaldes excitatoriske postsynaptiske strømme (EPSC'er) optisk ved 0,1 Hz. Neuroner, der modtager input fra AAV-inficerede MGN-neuroner, vil udvise pålidelige EPSC'er. - For at inducere ex vivo LTD skal du i strømklemmetilstand registrere en stabil baseline af excitatoriske postsynaptiske potentialer (EPSP'er) i mindst 10 minutter. Derefter leveres 900 2-ms impulser på 473 nm lys med en frekvens på 1 Hz (samlet tid = 15 min). Optag derefter kontinuerligt EPSP'er ved 0,1 Hz i ≥60 minutter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En tidslinje, der skitserer rækkefølgen af eksperimenter, er vist i figur 1. Gennem adfærdseksperimenter tjener antallet af kokaininfusioner samt antallet af reaktioner på den aktive håndtag som et mål for intensiteten af kokainsøgende adfærd. I løbet af de første dage af kokainselvadministration bør antallet af aktive reaktioner gradvist stige i løbet af hver erhvervelsesdag, før det stabiliseres i løbet af den anden uge. Omvendt bør inaktive løftestangsresponser forblive lave under hele eksperimentet (figur 2A). På den første dag med instrumentel udryddelse er der typisk en stigning i antallet af aktive løftestangsreaktioner, da det uventede fravær af kokain resulterer i eskalering af kokainsøgende adfærd. Dette respons vil dog gradvist falde med efterfølgende sessioner, efterhånden som rotter lærer det nye beredskab, hvilket resulterer i et lavt og stabilt antal aktive løftestangsresponser inden for 6-10 d (figur 2B). Rotter, der ikke når de specificerede erhvervelseskriterier i enten forsøgets selvadministrations- eller instrumentelle udryddelsesfaser, fjernes fra undersøgelsen, og data medtages ikke i den endelige analyse.
Efter instrumentel udryddelse genindfører geneksponering for kokainassocierede signaler kokainsøgende adfærd, hvilket resulterer i en stigning i antallet af aktive løftestangsreaktioner. Denne stigning observeres i begge grupper af kontrolforsøg: rotter, der blev injiceret med virus uden oChIEF (AAV-kontrol) og rotter, der ikke modtog laserstimulering (SHAM-kontrol; Figur 3A) Imidlertid forårsagede in vivo optogenetisk LTD af MGN-LA-terminaler en reduktion i efterfølgende cue-induceret kokainsøgning. 24 timer efter optogenetisk LTD-induktion blev antallet af aktive håndtagspresser signifikant reduceret i forhold til både AAV-kontroller og SHAM-kontroller (figur 3A). Dette lave responsniveau blev opretholdt under en efterfølgende genindsættelsestest 7 dage senere (udført på en undergruppe af rotter) (figur 3B), hvilket indikerer en vedvarende reduktion i cue-motiveret kokainsøgning på tværs af flere genoptagelsestest.
Ex vivo elektrofysiologiske optagelser fra dyr, der blev udsat for optisk stimulering, bekræftede, at svækkelsen ved genindsættelse faktisk i det mindste delvis skyldtes en modulering af MGN-LA synaptisk plasticitet. Dette blev påvist ved et fald i optisk fremkaldt EPSC-amplitude i LA-neuroner efter eksponering for optisk LTD (figur 4A). Denne dæmpning i EPSC-amplitude var specifik for neuroner, der modtog optisk stimulering, da EPSC-amplitude forblev uændret i SHAM-kontroller. Derudover kunne LTD ikke genereres i skiver fra rotter, der allerede havde modtaget in vivo optisk stimulering, men blev pålideligt fremkaldt i neuroner fra rotter, der gennemgik SHAM-stimulering, som det fremgår af en vedvarende reduktion i EPSP-stigningshældning (figur 4B). Således synes in vivo optisk stimulering at okkludere yderligere LTD-induktion i skive. Under optagelse er det vigtigt at måle seriemodstand gennem optagelsens varighed for at sikre plasterets fortsatte helbred. Celler med en ændring i seriemodstand ud over 20% accepteres ikke til dataanalyse. Dette er især vigtigt for LTD-eksperimenter, der varer >60 minutter, da ændringer i serieresistens kan påvirke receptor- og kanaldynamikken. For at sikre, at de afferenter, der stimuleres under elektrofysiologiske optagelser, stammer fra MGN, er det vigtigt at indsamle skiver gennem omfanget af thalamus. Dette tjener som validering af, at MGN's cellelegemer faktisk fluorescerende udtrykker AAV. Ud over visuel bekræftelse er funktionel validering også nødvendig. Under strømklemmeforhold affyrer AAV-oChIEF-inficerede MGN-neuroner handlingspotentialer som reaktion på både høje og lave frekvenser af 473-nm-lysstimulering (figur 4C).
Alle adfærdsmæssige resultater blev betragtet som foreløbige, indtil viral ekspression og optiske fiberimplantater blev histologisk verificeret, og korrekt placering blev bekræftet (figur 5). Manglende AAV-ekspression i enten MGN eller LA og / eller dem, hvor de optiske fibre ikke var korrekt placeret i dorsal LA, blev udelukket fra eksperimentel analyse, men kan i nogle tilfælde indgå som en negativ anatomisk kontrol.
Figur 1: Tidslinje for eksperimentel procedure. En oversigt over de kritiske trin i protokollen, herunder det sekventielle tidsforløb og varigheden af hver eksperimentel fase. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Erhvervelse og udryddelse af kokainselvadministration. (A) Dyr udviser et stigende antal kokaininfusioner og aktive løftestangsreaktioner ved erhvervelse og et lavt niveau af inaktive løftestangsreaktioner. (B) Efter et indledende boost i håndtagstryk på dag 1 af udryddelsen reducerer dyrene responsen på både aktive og inaktive håndtag til et lavt, stabilt niveau. Fejlbjælker, middel ±SEM. Dette tal er ændret fra Rich et al. 20194. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: In vivo optogenetic LTD dæmper cue-induceret genindsættelse. (A) Optical LTD forårsager en signifikant reduktion i aktive håndtagspresser under genindsættelse i forhold til dyr, der modtog kontrolvirus eller stimulering af SHAM-kontrol. Tovejs ANOVA, hovedeffekt af gruppe (F(2,27) = 7,04, P = ,004) og en dag x gruppeinteraktion (F(2,27) = 8,08, P = ,002); Bonferronis post hoc-analyse: ***p < .001. (B) 7 dage senere gennemgik rotter en anden genindsættelsestest, der afslørede en signifikant reduktion i aktiv presning af håndtag hos dyr, der tidligere gennemgik MGN-LA LTD i forhold til skinkontrol. Tovejs ANOVA, hovedeffekt af gruppe (F(1,32) = 5,04, P = .032), signifikant interaktion (F(1,32) = 7,69, P = .009); Bonferronis post hoc-analyse, **p < .01. Fejlbjælker, gennemsnit ±SEM, n i søjler, antal rotter. Dette tal er ændret fra Rich et al. 20194. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Funktionel validering af in vivo lavfrekvent optogenetisk stimulering (A) In vivo dual hemisphere LTD af MGN-LA synapser dæmper EPSC-amplitude i forhold til SHAM-kontroller (Uparret t-test, t(10) = 2,73, *P = .021). Indsat: Stikprøve gennemsnitlige EPSC-spor fremkaldt ved Erev-70 mV. Skalastænger: 50 ms, 200 pA, n i barer, antal rotter (neuroner). (B) In vivo optisk LTD-induktion okkluserer ex vivo LTD. 24 timer efter in vivo LTD-induktion blev amygdala-skiver forberedt, og den samme stimuleringsprotokol blev anvendt. EPSP-stigningshældningen ved MGN-LA-terminaler blev reduceret ved ex vivo optisk stimulering i neuroner fra dyr, der havde modtaget in vivo SHAM-stimulering, men ikke i neuroner fra dyr, der havde modtaget in vivo optisk LTD. n i kursiv, antal neuroner. (C) Prøve aktuelle klemmeoptagelser fra AAV-oChIEF-inficerede MGN-neuroner. Handlingspotentialer blev fremkaldt af stimulering af blåt lys (5-100 Hz). Vægtstænger: 100 ms, 40 mV. Fejlbjælker, middel ±SEM. Dette tal er ændret fra Rich et al. 20194. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Histologisk verifikation af viral ekspression og optiske fiberplaceringer. (A) Repræsentative mikroskopiske billeder, der viser DAPI- og AAV-oChIEF-tdTomato-ekspression i LA (venstre) og MGN (højre). Skalabjælke: 2 mm. (B) Skematisk visning af injektion af AAV-oChIEF-tdTomato og i hele den forreste og bageste udstrækning af LA (venstre) og MGN (højre) og optiske fiberplaceringer i LA. Mørkerød skygge viser repræsentation af mindste acceptable virusspredning, og lyserød skygge viser repræsentation af største acceptable spredning. Blå cirkler svarer til vellykket optisk fiberplacering i begge halvkugler. Sorte cirkler svarer til vellykket optisk fiberplacering på kun en halvkugle. Sort "X" svarer til mislykket fiberplacering. For at blive inkluderet i den endelige analyse krævede rotter viral dobbelt halvkugleekspression i LA samt vellykket placering af fibre. Koordinaterne er i mm, bageste fra bregma. Dette tal er ændret fra Rich et al. 20194. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Kemisk | Mm | MW | g/1000 ml |
| N-methyl-D-glucamin | 92 | 195.215 | 17.96 |
| Kaliumchlorid | 2.5 | 74.551 | 0.19 |
| Natriumphosphat monobasisk | 1.25 | 119.98 | 0.15 |
| Natriumbicarbonat | 30 | 84.01 | 2.52 |
| HEPES | 20 | 238.301 | 4.77 |
| D-glukose | 25 | 180.16 | 4.5 |
| Natriumascorbat | 5 | 198.11 | 0.99 |
| Thiourea | 2 | 76.12 | 0.15 |
| Natriumpyruvat | 3 | 110 | 0.33 |
| Magnesiumsulfat | 10 | Brug 5,0 ml 2,0 m lager | |
| Calciumchlorid | 0.5 | Brug 250 μL 2,0 m lager | |
| 1. Til 1 liter opløsning tilsættes salte i den anførte rækkefølge til 850 ml ddH2O | |||
| 2. pH med koncentreret HCI til 7,3-7,4 (NMDG udgør en basisk opløsning) | |||
| 3. Oxygener i 5-10 minutter, tilsæt derefterMgSO4 ogCaCl2 | |||
| 4. Bring den endelige volutme til 1 L med ddH2O, og dobbelttjek den endelige pH | |||
| 5. Kontroller osmolariteten med osmometer, og juster til 300-310 mOsm/kg H2O | |||
Tabel 1: Ingrediensliste for ekstracellulær skæreopløsning. Ingredienser og instruktioner, der anvendes til fremstilling af NMDG-baseret ekstracellulær skæreopløsning.
| Kemisk | Mm | MW | g/1000 ml |
| N-methyl-D-glucamin | 86 | 195.215 | 5.03 |
| Kaliumchlorid | 2.5 | 74.551 | 0.19 |
| Natriumphosphat monobasisk | 1.25 | 119.98 | 0.15 |
| Natriumbicarbonat | 35 | 84.01 | 2.94 |
| HEPES | 20 | 238.301 | 4.77 |
| D-glukose | 25 | 180.16 | 4.5 |
| Natriumascorbat | 5 | 198.11 | 0.99 |
| Thiourea | 2 | 76.12 | 0.15 |
| Natriumpyruvat | 3 | 110 | 0.33 |
| Magnesiumsulfat | 1 | Brug 500 μL 2,0 m lager | |
| Calciumchlorid | 2 | Brug 1000 μL 2,0 m lager | |
| 1. Til 1 liter opløsning tilsættes salte i den anførte rækkefølge til 850 ml ddH2O | |||
| 2. pH med 1 N HCl eller KOH til 7,3-7,4 | |||
| 3. Oxygener i 5-10 minutter, tilsæt derefterMgSO4 ogCaCl2 | |||
| 4. Bring den endelige volutme til 1 L med ddH2O, og dobbelttjek den endelige pH | |||
| 5. Kontroller osmolariteten med osmometer, og juster til 300-310 mOsm/kg H2O | |||
Tabel 2: Ingrediensliste for ekstracellulær opbevaringsopløsning. Ingredienser og instruktioner, der anvendes til fremstilling af den ekstracellulære holdeopløsning.
| Kemisk | Mm | MW | g/1000 ml |
| N-methyl-D-glucamin | 119 | 195.215 | 6.95 |
| Kaliumchlorid | 2.5 | 74.551 | 0.19 |
| Natriumphosphat monobasisk | 1.25 | 119.98 | 0.15 |
| Natriumbicarbonat | 26 | 84.01 | 2.18 |
| HEPES | 5 | 238.301 | 1.19 |
| D-glukose | 12.5 | 180.16 | 2.25 |
| Magnesiumsulfat | 1 | Brug 500 μL 2,0 m lager | |
| Calciumchlorid | 2 | Brug 1000 μL 2,0 m lager | |
| 1. Til 1 liter opløsning tilsættes salte i den anførte rækkefølge til 850 ml ddH2O | |||
| 2. pH med 1 N HCl eller KOH til 7,3-7,4 | |||
| 3. Oxygener i 5-10 minutter, tilsæt derefterMgSO4 ogCaCl2 | |||
| 4. Bring den endelige volutme til 1 L med ddH2O, og dobbelttjek den endelige pH | |||
| 5. Kontroller osmolariteten med osmometer, og juster til 300-310 mOsm/kg H2O | |||
Tabel 3: Liste over ingredienser til ekstracellulær optagelsesopløsning. Ingredienser og instruktioner, der anvendes til fremstilling af den ekstracellulære optagelsesopløsning.
| Kemisk | Mm | MW | mg/50 ml |
| Cæsiummethrulfonat | 108 | 227.997 | 1231.3 |
| Cæsiumchlorid | 15 | 168.36 | 126.3 |
| Cæsium-EGTA | 0.4 | Der tilsættes 80 μL 250 mM Cs-EGTA | |
| TE-KLORID | 5 | 165.705 | 41.4 |
| HEPES | 20 | 238.301 | 238.3 |
| QX-314-BR | 1 | 343.31 | 17.2 |
| L-glutathion | 1 | 307.323 | 15.4 |
| Natriumphosphocreatin | 7.5 | 255.1 | 95.7 |
| Mg-ATP | 2.5 | 507.18 | 63.4 |
| Na-GTP | 0.25 | 523.18 | 6.5 |
| 1. Start med 40-45 ml HPLC-grade H2O | |||
| 2. Hold phosphocreatin, ATP og GTP på is hele tiden. | |||
| 3. Tilsæt ingredienser i den rækkefølge, der er angivet i tabellen | |||
| 4. pH til 7,3 med CsOH (ca. 200 μL af 2 M CsOH) | |||
| 5. Brug osmometer til at kontrollere osmolaritet. | |||
| 6. Der tilsættes HPLC-kvalitet H2O til en endelig osmolaritet på ca. 285-290 mOsm/kg H2O | |||
| 7. Forbered 500-1000 μL alikvoter og opbevar ved -80 °C eller -20 °C | |||
Tabel 4: Liste over ingredienser til cæsiummethansulfonat intracellulær elektrofysiologiopløsning. Ingredienser og instruktioner anvendt til fremstilling af cæsiummethansulfonat intracellulær opløsning.
| Kemisk | Mm | MW | mg/50 ml |
| Kaliumgluconat | 145 | 234.246 | 1698.2 |
| Kaliumchlorid | 2.5 | 74.56 | 9.3 |
| Natriumchlorid | 2.5 | 58.44 | 7.3 |
| K-BAPTA | 0.1 | Tilsæt 80 μL K-BAPTA | |
| HEPES | 10 | 238.301 | 119.2 |
| L-glutathion | 1 | 307.323 | 15.4 |
| Natriumphosphocreatin | 7.5 | 255.1 | 95.7 |
| Mg-ATP | 2 | 507.18 | 63.4 |
| Tris-GTP | 0.25 | 886.59 | 11.1 |
| 1. Start med 40-45 ml HPLC-grade H2O | |||
| 2. Hold phosphocreatin, ATP og GTP på is hele tiden. | |||
| 3. Tilsæt ingredienser i den rækkefølge, der er angivet i tabellen | |||
| 4. pH til 7,3 med KOH (ca. 200 μL af 2 M KOH) | |||
| 5. Brug osmometer til at kontrollere osmolaritet. | |||
| 6. Der tilsættes HPLC-kvalitet H2O til en endelig osmolaritet på ca. 285-290 mOsm/kg H2O | |||
| 7. Forbered 500-1000 μL alikvoter og opbevar ved -80 °C eller -20 °C | |||
Tabel 5: Ingrediensliste for kaliumgluconat intracellulær elektrofysiologiopløsning. Ingredienser og instruktioner anvendt til fremstilling af kaliumgluconat intracellulær opløsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som beskrevet ovenfor er der flere kritiske trin, der er vigtige for at opnå de rette eksperimentelle resultater. Protokollen vil sandsynligvis kun være effektiv i dyr, der korrekt erhverver kokain selvadministration, og til dato er den kun blevet testet ved hjælp af de parametre, der er skitseret ovenfor. Det er muligt, at kokaindosis, forstærkningsplan og cue-parametre kan ændres med sandsynlig lille effekt på adfærdsmæssige resultater, med den undtagelse, at en andenordens forstærkningsplan kan føre til amygdala-uafhængig kokainsøgning, der kan reducere effektiviteten af proceduren, selvom dette ikke er blevet testet direkte14 . Der er flere punkter i hele protokollen, hvor validering af korrekt konstruktion og funktion af optiske fibre vil hjælpe med at sikre en vellykket optisk stimulering. Det er nødvendigt at score ferrules korrekt for at forhindre tab fra hovedbeklædningen og polere optiske fibre og teste, at tab af lysudgang gennem implantaterne ikke overstiger 30%9. Derudover er laserstimuleringsparametrene vigtige overvejelser. Laseren skal betjenes med relativt lav effekt (5-7 mW). Vedvarende, lavfrekvent stimulering bruges til at inducere LTD, og dette kan funktionelt valideres ved at måle MGN-LA synaptisk styrke med elektrofysiologiske optagelser. Endelig viste resultaterne en signifikant reduktion i cue-induceret genindsættelse med en endelig n på 10 dyr pr. Gruppe, men eksperimenter bør forvente at starte med et større n, da det er sandsynligt, at nogle dyr skal udelukkes fra den endelige analyse. Det er afgørende at verificere den korrekte anatomiske placering og ekspression af virus og optiske fibre og kun bruge data fra dyr, hvor histologi er blevet verificeret.
På trods af den robuste adfærdsmæssige effekt på kokainsøgning, der observeres med denne protokol, er der flere begrænsninger, der skal overvejes. For det første er metoden kun blevet testet på rotter, der blev trænet med et enkelt audiovisuelt signal parret med kokain. Det er ikke klart, hvad der ville ske i et scenarie, hvor flere forskellige signaler blev betinget, hvilket ville være en mere præcis repræsentation af menneskelig afhængighed, hvorved flere miljømæssige stimuli bliver stærkt forbundet med stofbrug15,16,17. Beviser fra vores laboratorium indikerer, at optogenetisk LTD's evne til at reducere stofsøgning skyldes et fald i synaptisk styrke, der svækker lægemiddel-cue-associerede minder. Det er imidlertid ikke klart, i hvilket omfang neutrale eller minder, der ikke er forbundet med kokain-selvadministration, kan blive påvirket af denne protokol. Desuden, mens metoden kun påvirker synaptisk styrke ved et kredsløb, kan andre kredsløb også være vigtige for kodning af hukommelse og / eller kørsel kokainsøgende adfærd18,19,20. Endelig skal det bemærkes, at LTD kun kan induceres ved synapser, hvor virus er tilstrækkeligt udtrykt, hvilket sandsynligvis efterlader nogle synaptiske forbindelser upåvirket af stimuleringsprotokollen, hvilket potentielt begrænser adfærdsmæssig indvirkning. Desuden tyder beviser på, at kun små ensembler af neuroner og synapser er involveret i kodningen af en bestemt hukommelse, hvilket giver tillid til ideen om, at LTD-induktion inden for en hel hjerneregion ikke er den bedste strategi til at gennemføre adfærdsændringer, mens der findes andre tilgange til specifikt at målrette cue- eller kontekstuelt aktive populationer af neuroner21, 22. På trods af dette er protokollen effektiv til at dæmpe cue-motiveret stofsøgning, sandsynligvis fordi den lavfrekvente optiske stimulering begrænser LTD-induktion til synapser, der tidligere er blevet forstærket af gentagne kokain-cue-parringer4.
Denne protokol giver et betydeligt fremskridt til mere almindeligt anvendte optogenetiske adfærdsstudier, hvor neuronernes aktivitet aktiveres eller hæmmes, mens dyret udfører adfærden i realtid19,23. I stedet bruges optogenetik her som et neuromodulerende værktøj til at vende kokaininduceret plasticitet. En fordel ved denne metode er, at den optogenetiske manipulation er uafhængig af adfærdstesten, således at potentielle forvirrende virkninger af optogenetik (fx lokale kredsløbseffekter, ildfast periode efter lysstimulering, antidromiske stimuleringseffekter osv. 24 bør ikke påvirke resultaterne og derved øge tilliden til, at den hypotetiske neurale mekanisme medierer ændringer i adfærd. Denne metode kan derfor bruges i en række applikationer, der undersøger, hvordan synaptisk plasticitet, især en stigning i synaptisk styrke, som forekommer med LTP, relaterer til ændringer i adfærd. Lignende tilgange kan også være relevante for klinisk anvendelse af neurale stimuleringsteknologier, hvor unormale forbindelser i hjernen, der driver dysfunktionel adfærd, kan nedreguleres. Ligeledes, fordi oChIEF viral konstruktion reagerer på både lav- og højfrekvente stimuleringer, er der potentielle anvendelser af disse metoder ud over omfanget af de beskrevne eksperimenter. For eksempel kan optogetisk induceret LTP være gavnligt for at vende underskud i plasticitet, der findes i en lang række neurodegenerative og neuroudviklingsmæssige lidelser25. Desuden har tovejs plasticitet ved MGN-LA-synapser også været direkte forbundet med reguleringen af adfærd, der er relevant for frygtassocierede lidelser8.
Modulering af de specifikke neurale kredsløb, der understøtter narkotikamotiveret adfærd, er afgørende for at etablere langvarig afholdenhed fra stofbrug. Denne protokol udnytter nye fremskridt inden for in vivo optogenetik til at vende plasticiteten af et præcist neuralt kredsløb, der styrkes ved gentagen kokain selvadministration i nærvær af miljømæssige signaler. Resultatet af denne specifikke neuromodulation er en nedsat sandsynlighed for, at efterfølgende cue re-eksponeringer udløser en kokainsøgende respons, hvilket kan have vigtige konsekvenser for udviklingen af fremtidige terapier for stofbrugsforstyrrelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker at anerkende støtte fra USPHS-tilskud K01DA031745 (MMT), R01DA042029 (MMT), DA035805 (YHH), F31DA039646 (MTR), T32031111 (MTR) og Pennsylvania Department of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Saline | Fisher Scientific | NC0291799 | |
| A.M.P.I. Stimulus Isolator | Iso-Flex | ||
| AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomato | Duke Viral Vector Core (via Roger Tsien) | #268 | See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014 |
| AAV5.hSyn.tdTomato (Control) | Duke Viral Vector Core Control | See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014 | |
| Artificial Tears (Opthalmic Ointment) | Covetrus | 70349 | |
| ATP Magnesium Salt | Fisher Scientific | A9187 | |
| Betadine | Butler Schein | 38250 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C1016 | |
| Cesium chloride | Fisher Scientific | 289329 | |
| Cesium hydroxide | Fisher Scientific | 516988 | |
| Cesium methanesulfonate | Fisher Scientific | C1426 | |
| Cocaine HCl | NIDA Drug Supply Center | 9041-001 | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-1 | |
| Dual-Channel Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344C | |
| EGTA | Fisher Scientific | E3889 | |
| Ethanol | University of Pittsburgh Chemistry Stockroom | 200C5000 | |
| Ferrule Dust Caps | Thor Labs | CAPL | White plastic dust caps for 1.25 mm Ferrules |
| Ferrule Mating Sleeves | Doric Lenses | F210-3011 | Sleeve_BR_1.25, Bronze, 1.25 mm ID |
| Ferrules | Precision Fiber Products | MM-FER2007C-2300 | Ø1.25 mm Multimode LC/PC Ceramic ferrule, Ø230 μm hole size |
| Fiber Optic | Thor Labs | FP200URT | 200 μm core multimode fiber (0.5 NA) |
| Fiber Optic Rotary Joint | Prizmatix | (Ordered from Amazon) | 18 mm diameter, FC-FC connector for fiber |
| Fiber Stripping Tool | Thor Labs | T12S21 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Gentamicin | Henry Schein | 6913 | |
| GTP Sodium Salt | Fisher Scientific | G8877 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 80085 | 10 μL volume, 26 gauge, 2 inch, point style 3 |
| Heat Gun | Allied Electronics | 972-6966 | 250 V, 750-800 °F |
| Heat-Curable Epoxy | Precision Fiber Products | PFP-353ND-8OZ | |
| Heparin | Henry Schein | 55737 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | 219405490 | |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Ketamine HCl | Henry Schein | 55853 | Ketamine is a controlled substance and should be handled according to institutional guidelines |
| Lactated Ringer’s | Henry Schein | 9846 | |
| Laser, driver, and laser-to-fiber coupler | OEM Laser Systems | BL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0 | 100 mW, 473-nm, diode-pumped solid-state laser (One option) |
| L-glutathione | Fisher Scientific | G4251 | |
| Lidocaine | Butler Schein | 14583 | |
| Light Sensor | Thor Labs | PM100D | Compact energy meter console with digital display |
| Loctite instant adhesive | Grainger | 5E207 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 203726 | |
| Microelectrode Amplifier/Data Acquisition | Molecular Devices | MULTICLAMP700B / Digidata 1440A | |
| Microinjector pump | Harvard Apparatus | 70-4501 | Dual syringe |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-200/ROE-200 | |
| Microscope | Olympus | BX51WI | Upright microscope for electrophysiology |
| Microscope | Olympus | BX61VS | Epifluorescent slide-scanning microscope |
| N-methyl-D-glucamine | Sigma-Aldrich | M2004 | |
| Orthojet dental cement, liquid | Lang Dental | 1504BLK | black |
| Orthojet dental cement, powder | Lang Dental | 1530BLK | Contemporary powder, black |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Patch Cables | Thor Labs | FP200ERT | Multimode, FT030 Tubing |
| Picrotoxin | Fisher Scientific | AC131210010 | |
| Polishing Disc | Thor Labs | D50FC | |
| Polishing Pad | Thor Labs | NRS913 | 9" x 13" |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG5P | 5 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG3P | 3 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG1P | 1 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG03P | 0.3 μm grit |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium hydroxide | Fisher Scientific | P5958 | |
| Potassium methanesulfonate | Fisher Scientific | 83000 | |
| QX-314-Cl | Alomone Labs | Q-150 | |
| Rimadyl (Carprofen) | Henry Schein | 24751 | |
| Self-Administration Chambers/Software | Med Associates | MED-NP5L-D1 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1064980500 | |
| Sodium L-Ascorbate | Sigma-Aldrich | A7631 | |
| Sodium Pentobarbital | Henry Schein | 24352 | |
| Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Sodium phosphocreatine | Fisher Scientific | P7936 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Stainless steel machine screws | WW Grainger | 6GB25 | M2-0.40mm Machine Screw, Pan, Phillips, A2 Stainless Steel, Plain, 3 mm Length |
| Stereotaxic adapter for ferrules | Thor Labs | XCL | |
| Stereotaxic Frame | Stoelting | 51603 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-50 | Silk thread; Size: 5/0, Diameter: 0.12 mm |
| TEA-Chloride | Fisher Scientific | T2265 | |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | Covetrus | 001505 | |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Xylazine | Butler Schein | 33198 |
References
- Connors, N. J., Hoffman, R. S. Experimental treatments for cocaine toxicity: A difficult transition to the bedside. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 347 (2), 251-257 (2013).
- Makani, R., Pradhan, B., Shah, U., Parikh, T. Role of repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) in treatment of addiction and related disorders: A systematic review. Current Drug Abuse Reviews. 10 (1), 31-43 (2017).
- Shaham, Y., Shalev, U., Lu, L., De Wit, H., Stewart, J. The reinstatement model of drug relapse: History, methodology and major findings. Psychopharmacology. 168 (1-2), 3-20 (2003).
- Rich, M. T., Huang, Y. H., Torregrossa, M. M. Plasticity at Thalamo-amygdala Synapses Regulates Cocaine-Cue Memory Formation and Extinction. Cell Reports. 26 (4), 1010-1020 (2019).
- Rich, M. T., Huang, Y. H., Torregrossa, M. M. Calcineurin promotes neuroplastic changes in the amygdala associated with weakened cocaine-cue memories. Journal of Neuroscience. 40 (6), 1344-1354 (2020).
- Deisseroth, K. Optogenetics 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
- Gradinaru, V., et al. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141 (1), 154-165 (2010).
- Nabavi, S., Fox, R., Proulx, C. D., Lin, J. Y., Tsien, R. Y., Malinow, R. Engineering a memory with LTD and LTP. Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).
- Sparta, D. R., Stamatakis, A. M., Phillips, J. L., Hovelsø, N., Van Zessen, R., Stuber, G. D. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocols. 7 (1), 12-23 (2012).
- Stripling, J. S. A simple intravenous catheter for use with a cranial pedestal in the rat. Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 15 (5), 823-825 (1981).
- Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophysical Journal. 96 (5), 1803-1814 (2009).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates Hard Cover Edition. , 466 (2013).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: Application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).
- Bender, B. N., Torregrossa, M. M. Dorsolateral striatum dopamine-dependent cocaine seeking is resistant to pavlovian cue extinction in male and female rats. Neuropharmacology. 182, (2021).
- Milton, A. L., Everitt, B. J. The persistence of maladaptive memory: Addiction, drug memories and anti-relapse treatments. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 36 (4), 1119-1139 (2012).
- Torregrossa, M. M., Taylor, J. R. Learning to forget: Manipulating extinction and reconsolidation processes to treat addiction. Psychopharmacology. 226 (4), 659-672 (2013).
- Kalivas, P. W., Volkow, N. D. The Neural Basis of Addiciton: A Pathology of Motivation and Choice. American Journal of Psychiatry. 162 (8), 1403-1413 (2005).
- Stefanik, M. T., et al. Optogenetic inhibition of cocaine seeking in rats. Addiction Biology. 18 (1), 50-53 (2013).
- Arguello, A. A., et al. Role of a Lateral Orbital Frontal Cortex-Basolateral Amygdala Circuit in Cue-Induced Cocaine-Seeking Behavior. Neuropsychopharmacology. 42 (3), 727-735 (2017).
- Cruz, A. M., Spencer, H. F., Kim, T. H., Jhou, T. C., Smith, R. J. Prelimbic cortical projections to rostromedial tegmental nucleus play a suppressive role in cue-induced reinstatement of cocaine seeking. Neuropsychopharmacology. 46 (8), 1399-1406 (2021).
- Cruz, F. C., Javier Rubio, F., Hope, B. T. Using c-fos to study neuronal ensembles in corticostriatal circuitry of addiction. Brain Research. 1628, 157-173 (2015).
- Rubio, F. J., et al. Context-Induced Reinstatement of Methamphetamine Seeking Is Associated with Unique Molecular Alterations in Fos-Expressing Dorsolateral Striatum Neurons. Journal of Neuroscience. 35 (14), 5625-5639 (2015).
- Siuda, E. R., et al. Spatiotemporal Control of Opioid Signaling and Behavior. Neuron. 86 (4), 923-935 (2015).
- McCracken, C. B., Grace, A. A. High-frequency deep brain stimulation of the nucleus accumbens region suppresses neuronal activity and selectively modulates afferent drive in rat orbitofrontal cortex in vivo. Journal of Neuroscience. 27 (46), 12601-12610 (2007).
- Zhang, H., Bramham, C. R. Bidirectional Dysregulation of AMPA Receptor-Mediated Synaptic Transmission and Plasticity in Brain Disorders. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12 (26), (2020).
