Síntese de Masarimicina, um inibidor de pequenas moléculas do crescimento bacteriano gram-positivo

Resumo

Um protocolo detalhado é apresentado para preparar a diamida bacteriostática masarimycina, uma pequena sonda de moléculas que inibe o crescimento de Bacillus subtilis e Streptococcus pneumoniae mirando a degradação da parede celular. Sua aplicação como sonda química é demonstrada em ensaios de sinergia/antagonismo e estudos morfológicos com B. subtilis e S. pneumoniae.

Resumo

Peptidoglycan (PG) na parede celular das bactérias é uma estrutura macromolecular única que confere forma e proteção do ambiente circundante. Central para entender o crescimento e a divisão celular é o conhecimento de como a degradação do PG influencia a biossíntese e a montagem da parede celular. Recentemente, foi relatada a rotulagem metabólica de PG através da introdução de açúcares modificados ou aminoácidos. Embora o interrogatório químico de passos biossintéticos com inibidores de pequenas moléculas seja possível, ferramentas de biologia química para estudar a degradação de PG por autolysinas são subdesenvolvidas. As autolysinas bacterianas são uma ampla classe de enzimas que estão envolvidas na degradação fortemente coordenada de PG. Aqui, um protocolo detalhado é apresentado para o preparo de uma pequena sonda de moléculas, a masarimicina, que é um inibidor de N-acetilglucosaminidase LytG em bacillus subtilis, e metabolismo de parede celular em Streptococcus pneumoniae. A preparação do inibidor por meio de síntese orgânica assistida por micro-ondas e clássica é fornecida. Sua aplicabilidade como ferramenta para estudar fisiologia gram-positiva em ensaios biológicos é apresentada.

Introdução

Peptidoglycan (PG) é um polímero em forma de malha que delineia a forma e a estrutura das células em ambas as bactérias Gram-positivas e^{Gram-negativas 1,2}. Este heteropolímero é uma matriz de açúcares aminosatrados intercides por peptídeos curtos ^3,4,5,6 com uma espinha dorsal composta de resíduos de β N-acetilglucosamina alternada (GlcNAc) e ácido n-acetilmuramic (MurNAc) (Figura 1)¹. Anexado ao c-3 lactyl moiety de MurNAc é o pe....

Protocolo

1. Métodos gerais

NOTA: Todos os compostos foram comprados de fornecedores padrão e utilizados sem maiores purificações.

1. Realize cromatografia de camada fina (TLC) em uma placa de alumínio pré-revestida com gel de sílica XG F254. Detecte manchas sob uma lâmpada UV, por imersão na mancha de p-anisaldeído, ou expondo-se ao vapor I₂ .
2. Registo de ressonância magnética nuclear (NMR) em um espectrômetro de 400 MHz.
   NOTA: ¹H-NMR e ¹³espectros C-NMR foram referenciados a picos de solventes residuais. Constantes de acoplamento são dadas em [Hz] e mudanças químicas em [....

Resultados

Masarimicina é uma pequena molécula inibidora bacteriostática de B. subtilis e S. pneumoniae e tem sido mostrado para inibir o exo-ato glcNAcase LytG em B. subtilis^35,37 e atingir a parede celular em S. pneumoniae³⁷. A masarimicina pode ser preparada eficientemente pela síntese orgânica clássica ou assistida por micro-ondas com rendimentos na faixa de 55%-70%. A síntese assistida por micro-ondas tem a va.......

Discussão

Masarimicina é um único inibidor bacteriostático micromolar de B. subtilis³⁵ e S. pneumoniae³⁷ . Em B. subtilis, a masarimicina tem sido demonstrada para inibir o GlcNAcase LytG³⁵, enquanto o alvo molecular preciso na parede celular de S. pneumoniae não foi identificado³⁷. A síntese de masarimicina usando a síntese orgânica clássica ou o procedimento de micro-ondas fornece o inibidor em bom rendiment.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ácido 2-iodobenzóico	SIGMA-ALDRICH	I7675-25G	corrosivo, irritante, pó amarelo claro a marrom-alaranjado
2-Propanol	SIGMA-ALDRICH	109827-4L	líquido inflamável, irritante e incolor
Acetonitrila	SIGMA-ALDRICH	34851-4L	líquido inflamável, irritante e incolor
Placas de sílica com suporte de alumínio	Sorbtech	4434126	gel de sílica XG F254 em placas de alumínio com suporte
clorofórmio-d	SIGMA-ALDRICH	151823-50G	solvente para
espectrômetro de massa compacto	Advion-Interchim	Advion CMS	espectrômetro de massa compacto equipado com fonte APCI e sonda de análise de sólidos atmosféricos
Corning Costar 96 placas de fundo plano de poço -	produto químico fisher	estéril 07-200-90	para ensaios de sinergia / antagonismo
lamínulas	fisher chemical	12-547	para microscopia
Ciclohexanocarboxaldeído	CHEM-IMPEX INT'L INC.	24451	líquido inflamável, irritante, incolor a rosado
Isocianeto de ciclohexilo	SIGMA-ALDRICH	133302-5G	irritante, líquido incolor, odor extremamente desagradável
Ciclohexilamina	SIGMA-ALDRICH	240648-100ML	líquido corrosivo, inflamável, irritante, incolor, a menos que contaminado
Acetato de etila	SIGMA-ALDRICH	537446-4L	inflamável, irritante, incolor
cartucho de sílica flash líquido (12g)	Advion-Interchim	PF-50SIHP-F0012	pacote de colunas de sílica flash (12g) para purificação de masarimicina
formaldeído	SIGMA-ALDRICH	F8775-25ML	agente de fixação para microscopia
HEPES	SIGMA-ALDRICH	H8651-25G	tampão para solução de fixação de microscopia
Hexano, mistura de isômeros	SIGMA-ALDRICH	178918-4L	prejudicial ao meio ambiente, inflamável, irritante, perigoso para a saúde, líquido incolor
Espectrômetro de massa compacto de alto desempenho	Sonda de análise de sólidos atmosféricos de	expressão	Advion
Alta Vac	eppendorf	Vacufuge mais	vácuo auxiliado por força centrífuga e temperatura
Ácido clorídrico	SIGMA-ALDRICH	258148-2.5L	corrosivo, irritante, incolor líquido
clorídrico	SIGMA-ALDRICH	320331-2.5L	em ácido forte
	fisher chemical	12-365-19	para microscopia
Iodo, cristais ressublimados	Alfa Aesar	41955	ambientalmente prejudicial, irritante, perigoso para a saúde, cristais cinza escuro/roxo
Mestre Mnova	MestreLab Research		software para processamento de espectros de RMN
Metanol	SIGMA-ALDRICH	439193-4L	inflamável, tóxico, perigoso para a saúde,
incolor azul de metileno	SIGMA-ALDRICH	M9140-25G	coloração de microscopia para coloração de paredes celulares
placas de ágar meuller-hinton + 5% de sangue de ovelha	pescador		de B21176X químico meio de crescimento para caldo de Streptococcus pneumoniae
meuller-hinton	Fisher Chemical	DF0757-17-6	Meios de Crescimento para Streptococcus pneumoniae
Lâminas de microscópio	Fisher Chemical	22-310397	para Microscopia Microscopia
Síntese de Microondas Labstation	Dispositivo MILESTONE	START SYNTH	que requer a ventilação de uma capela de exaustão, equipada com tubos de
RMN	de síntese SIGMA-ALDRICH	Z562769-5EA	5mm Tubos de RMN 600 MHz
Ressonância Magnética Nuclear (NMR)	Bruker	Ascend 400	grande ímã supercondutor (400MHz)
optochin	fisher químico	AAB21627MC	cloridrato de etilhidrocupreína
placas de petrie	Celltreat	229695	para preparar placas de ágar para crescimento bacteriano
Primo Star Microscópio de contraste de campo / fase brilhante com câmera ERc5s	Zeiss		para estudos de morfologia
puriFlash	interchim	XS520plus	sistema de purificação de cromatografia flash
resazurina	SIGMA-ALDRICH	R7017-1G	para ensaios de sinergia/antagonismo
Evaporador rotativo	Heidolph	Hei-VAP Valor "The Collegiate"	evaporador de solvente
Bicarbonato de sódio	SIGMA-ALDRICH	S6014-500G	irritante, branco pó
Cloreto de sódio	fisher químico	S271-1	cristalino, incolor
Cloreto de sódio	SIGMA-ALDRICH	S5886-500G	para o crescimento de B.subtilis e preparação de meios LB
Sulfato de sódio	SIGMA-ALDRICH	7985592-500G	anidro, granular,
triptona	fisher químico	BP1421-500	para o crescimento de B.subtilis e preparação de meios LB
Whitney DG250 Workstation	Microbiology International	DG250	estação de trabalho anaeróbia. Mistura anaeróbica de gases utilizada: 5% de hidrogênio, 10% de dióxido de carbono, equilíbrio de extrato
de levedura	fisher químico	BP1422-500	para crescimento de B.subtilis e preparação de mídia LB
Zen Lite (azul) software	Zeiss		para aquisição de micrografias

de RMN (ASAP), baixa resolução ácido óleo de imersão líquido de carrossel branca de nitrogênio