Para obter um inseto axenic, sua superfície de ovo é esterilizada, e a larva eclodida é posteriormente criada usando folhas axenic. Este método fornece uma maneira eficiente de preparação de insetos machados sem administrar antibióticos ou desenvolver uma dieta artificial, que também pode ser aplicada a outros insetos comedores de folhas.
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Artigo de método
Preparando e criando insetos axeônicos com mudas cultivadas de tecido para estudos de interação microbiota hospedeiro-intestinal do besouro-folha
Neste artigo
Resumo
Resumo
As entranhas dos insetos são colonizadas por diversas bactérias que podem impactar profundamente os traços fisiológicos do hospedeiro. Introduzir uma cepa bacteriana particular em um inseto axenic é um método poderoso para verificar a função microbiana intestinal e elucidar os mecanismos subjacentes às interações entre micróbios intestinais. Administrar antibióticos ou esterilizar superfícies de óvulos são dois métodos comumente usados para remover bactérias intestinais de insetos. No entanto, além dos potenciais efeitos adversos dos antibióticos em insetos, estudos anteriores indicaram que a alimentação de antibióticos não poderia eliminar bactérias intestinais. Assim, dietas artificiais sem germes são geralmente empregadas para manter insetos axenic, que é um processo tedioso e intensivo em mão-de-obra que não pode se assemelhar totalmente a componentes nutricionais em alimentos naturais. Descrito aqui é um protocolo eficiente e simples para preparar e manter larvas axenic de um besouro de folhas (Plagiodera versicolora). Especificamente, superfícies dos ovos de besouro foram esterilizadas, seguindo as quais folhas de álamo sem germes foram usadas para retrotecanças. O status axenic dos insetos foi confirmado ainda através de ensaios dependentes da cultura e independentes da cultura. Coletivamente, combinando desinfecção de ovos e cultivo livre de germes, um método eficiente e conveniente foi desenvolvido para obter a P. versicolora axenic, fornecendo uma ferramenta facilmente transferível para outros insetos comedores de folhas.
Introdução
Semelhante aos mamíferos, o trato digestivo de insetos é uma cavidade para digestão e absorção de alimentos. A maioria dos insetos abriga diversas bactérias commensais que prosperam em suas entranhas e vivem de nutrição fornecida pelos hospedeiros1. A comunidade commensal intestinal tem um impacto profundo em múltiplos processos fisiológicos em insetos, incluindo digestão e desintoxicaçãode alimentos 2,3,4, nutrição e desenvolvimento 5,6,7, defesa contra patógenos e parasitas
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Protocolo
1. Criação de insetos
- Manter a população de P. versicolora em uma câmara de crescimento na condição de 27 °C e 70 ± umidade relativa de 5% com um fotoperíodo de 16 h de luz/8 h escuro. Coloque-os em caixas de plástico perfuradas com papel absorvente molhado de azulejos e alimente-os galhos de álamo frescos. Pulverize a água limpa no papel absorvente para manter a umidade e troque os galhos a cada dois dias.
- Isole adultos para oviposição após a pupação. Alimente-os com folhas macias para obter mais ovos.
- Coletar ovos recém-colocados (dentro de 24 h). Coloque os ovos em papel absorvente úmido por 60 h para preparar....
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Resultados
As fases de vida de P. versicolora são mostradas na Figura 1. O macho adulto é menor que o feminino adulto (Figura 1A). No campo, o besouro agrupa seus ovos em uma folha; aqui, quatro ovos foram retirados de uma folha (Figura 1B). Os segmentos de haste de álamo e as mudas utilizadas para a criação de insetos axeônicos são mostrados na Figura 2. O intestino de uma larva instar 3é most.......
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Discussão
A preparação de larvas livres de germes e a obtenção de larvas gnotobióticas, reintroduzindo cepas bacterianas específicas, são métodos poderosos para elucidar os mecanismos subjacentes às interações hospedeiro-micróbio. Larvas recém-eclodidas obtêm microbiota intestinal de duas formas principais: transmissão vertical da mãe para a prole ou aquisição horizontal de irmãos e ambiente34. O primeiro pode ser cumprido pela transferência dos pais para a prole através da contaminação da superfície do ovo.......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pela National Natural Science Foundation of China (31971663) e pelo Young Elite Scientists Sponsorship Program by CAST (2020QNRC001).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,22 µ m filtros de seringa | Millipore | SLGP033RB | |
| 1 mg/mL de solução | a. Prepare a solução de NaOH 0,1 M (dissolva 0,8 g de NaOH em 200 mL de água destilada). b. Adicione 0,2 g de NAA em um béquer de 250 mL, adicione pouca solução de NaOH 0,1 M até que o NAA se dissolva e ajuste o volume final para 200 mL com água destilada. c. Filtre a solução para remover bactérias com um 0,22 µ m e uma seringa estéril de 50 ml, subembalar a solução em tubos de centrífuga de 1,5 ml e restaurar a -20 °C. | ||
| Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL | Sangon Biotech | F600620 | |
| 10x solução estoque PBS | Biosharp Life Sciences | BL302A | |
| Solução de KOH | Dissolva 22,44 g de KOH (peso molecular: 56,1) em 200 mL de água destilada e autoclave por 20 min a 121 °C. | ||
| Copos de 250 mL e 2.000 mL | Shubo | sb16455 | |
| Seringas estéreis de 50 mL | Jinta | JT0125789 | |
| Cilindro de medição de 500 mL | Shubo | sb1601 | |
| 50x TAE solução | a. Dissolver 242 g de Tris e 18.612 g de EDTA em 700 mL de água destilada. b. Ajuste o pH para 7,8 com cerca de 57,1 mL de ácido acético. c. Ajuste o volume final para 1.000 mL. d. A solução estoque foi diluída para 1x tampão TAE quando usada. | ||
| 75% etanol | Xingheda trade | ||
| α-naftaleno ácido acético (NAA) | Solarbio Life Sciences | 86-87-3 | |
| Papel | 22,3 cm x 15,3 cm x 9 cm | ||
| Ácido acético | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Agar | Coolaber | 9002-18-0 | |
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Autoclave | Panasonic | MLS-3781L-PC | |
| Homogeneizador de batida de grânulos | Jing Xin | XM-GTL64 | |
| Kit de extração de DNA | MP Biomedicals | 116560200 | |
| EDTA | Saiguo Biotech | 1340 | |
| Papel de filtro | Jiaojie | 70 mm de diâmetro | |
| Unidade | de eletroforese em gelBio-rad | 164-5052 | |
| Gel Sinal Corante de ácido nucleico verde | TsingKe | TSJ003 | |
| Mudas de choupo sem germes | Choupo Shan Xin da Universidade de Ludong na província de Shandong Golden | ||
| Star Super PCR Master Mix (1,1 e vezes;) | TsingKe | TSE101 | |
| Câmara de crescimento | Ruihua | HP400GS-C | |
| LB meio | a. Dissolva 5 g de triptona, 5 g de NaCl, 2,5 g de extrato de levedura em 300 mL de água destilada. b. Ajuste o volume final para 500 mL, transfira a solução para um frasco cônico de 1.000 mL e adicione 7,5 g de ágar. c. Autoclave o meio por 20 min a 121 °C. | ||
| Mini centrífuga | DRAGONLAB | D1008 | |
| MS meio básico | Coolaber | PM1121-50L | M0245 |
| MS meio sólido para cultura de mudas de choupo livre de germes | a. Dissolva 4,43 g de pó médio básico MS e 30 g de sacarose em 800 mL de água destilada. b. Ajuste o pH para cerca de 5,8 com 2 M KOH por um medidor de pH. c. Ajuste o volume final para 1.000 mL, separar em duas partes, transferir para dois frascos cónicos de 1.000 ml e adicionar 2,6 g de ágar por 500 ml. d. Autoclave por 20 min a 121 °C. | ||
| Espectrofotômetro NanoDrop 1000 | Pincel | ||
| 1 | cm de largura, usado para coletar os ovos | ||
| Pipetas 0,2-2 µ L | Gilson | ECS000699 | |
| Pipetas 100-1,000 µ L | Eppendorf | 3120000267 | |
| Pipetas 20-200 µ L | Eppendorf | 3120000259 | |
| Pipetas 2-20 µ L | Eppendorf | 3120000232 | |
| Recipiente para cultura de tecidos vegetais | Chembase | ZP21 | 240 mL |
| Caixa | 2,35 L | ||
| Hidróxido de potássio (KOH) | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | ||
| Primers para amplificar o gene bacteriano 16S rRNA | Sangon Biotech | 27-F: 5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3', 1492R: 5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3' | |
| Cloreto de sódio (NaCl) | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | ||
| Hidróxido de sódio (NaOH) | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | ||
| Esferas | de 0,25 mm | usadas para moer tecidos | |
| Estereomicroscópio | OLYMPUS | SZ61 | |
| Sacarose | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | ||
| , Trans2K plus II DNA marcador | Transgene Biotech | BM121-01 | |
| Base Tris | Biosharp Life Sciences | 1115 | |
| Triptona | Thermo Fisher Scientific | LP0037 | |
| Transiluminador UV | Monad Biotech | QuickGel 6100 | |
| Vortexer | Scilogex | MX-S | |
| de salgueiro | Sha Lake Park, Wuhan, China | ||
| Besouro | Huazhong Agricultural University, Wuhan, China | ||
| Extrato de levedura | Thermo Fisher Scientific | LP0021 |
Referências
- Moran, N. A., Ochman, H., Hammer, T. J. Evolutionary and ecological consequences of gut microbial communities. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 50 (1), 451-475 (2019).
- Warnecke, F., et al. M....
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Reimpressões e permissões
