Artigo de método

Avaliação quantitativa de reação em cadeia de polimerase em tempo real da expressão de microRNA em rim e soro de camundongos com comprometimento renal dependente da idade

DOI:

10.3791/63258

⸱

29 de abril de 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Nephrology, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University, 2Division of Intensive Care Unit, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University, 3Department of Medical Physiology, Meiji Pharmaceutical University

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Apresentamos um método para avaliar a expressão de microRNA no rim e soro de camundongos com comprometimento renal dependente da idade por reação quantitativa em cadeia de polimerase de transcrição reversa.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MicroRNAs (miRNAs) são RNAs pequenas e não codificantes que consistem em 21-25 bases. Eles não são traduzidos em proteínas, mas trabalham para impedir o funcionamento de seus RNAs (mRNAs) mensageiros-alvo, desestabilizando-os e interrompendo sua tradução. Embora os perfis de expressão do miRNA em vários órgãos e tecidos do camundongo tenham sido investigados, não houve métodos padrão para purificar e quantificar os miRNAs renais e soros. Estabelecemos um método eficaz e confiável para extrair e avaliar a expressão miRNA no soro e rim de camundongos com comprometimento renal dependente da idade.

O método utiliza reação quantitativa de cadeia de transcrição reversa-polimerase (qRT-PCR), e o protocolo requer seis etapas: (1) preparar ratos de resistência acelerada do rato 1 (SAMR1) e camundongos propensos a camundongos com resistência acelerada de senescência (SAMP1); (2) extração de amostras de soro desses camundongos; (3) extração de uma amostra de rim de cada camundongo; (4) extração total de RNA (incluindo miRNA) de amostras de rim e soro de cada rato; (5) a síntese do DNA complementar (cDNA) com transcrição reversa do miRNA; (6) condução de um qRT-PCR utilizando o cDNA obtido.

Este protocolo foi usado para confirmar que, em comparação com os controles, a expressão de miRNA-7218-5p e miRNA-7219-5p foi significativamente alterada no rim e soro de um modelo de camundongo de comprometimento renal dependente da idade. Este protocolo também esclareceu a relação entre o rim e o soro do modelo de camundongos de comprometimento renal dependente da idade. Este protocolo pode ser usado para determinar a expressão miRNA no rim e soro de camundongos com comprometimento renal dependente da idade.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A expressão de vários mRNAs que desempenham papéis importantes tanto na fisiologia quanto na doença (por exemplo, inflamação, fibrose, distúrbios metabólicos e câncer) é conhecida por ser regulada por miRNAs, que são RNAs curtas e não codificadoras que causam a degradação e inibem a transcrição do mRNA1. É possível, portanto, que certos miRNAs possam servir como novos biomarcadores candidatos e/ou metas terapêuticas para diversas doenças 2,3,4,5. Pesquisas têm sido conduzidas em perfis de expressão miRNA em uma variedade de órgãos e tecidos de camundongos (incluindo cérebro6, coração7, pulmão8, fígado9 e rim10). No entanto, não existem métodos padrão ou estabelecidos para extrair e avaliar miRNAs nos rins ou soro de camundongos com comprometimento renal dependente da idade.

Por isso, estabelecemos um protocolo que pode ser usado para purificar e detectar de forma confiável a expressão de miRNA no soro e rim de camundongos com comprometimento renal dependente da idade. Há seis etapas principais no protocolo: (1) preparação de ratos machos SAMR1 de 50 semanas de idade e camundongos machos SAMP1; (2) extração de amostras de sangue da veia cava inferior de ambas as cepas de camundongos, com o uso subsequente de um tubo de espia com heparina, seguido de centrifugação, para obtenção de uma amostra de soro; (3) a extração da amostra de rim do homogeneizador de silício é usada para homogeneizar a amostra renal separadamente, e a amostra é então transferida para um sistema de trituração de biopolímeros em uma coluna de spin de microcentrifuuge11; (4) extração total de RNA (contendo miRNA) das amostras de soro com o uso de uma coluna de spin baseada em membrana de sílica12 e RNA total contendo extração de miRNA das amostras renais com o uso de uma coluna de spin baseada em membrana de sílica11; (5) síntese de DNA complementar (cDNA) do RNA total utilizando transcriptase reversa, polimerase poli(A) e primer oligo-dT13,14; e (6) finalmente, determinação da expressão miRNA usando qRT-PCR e um corante intercalante13,14.

Este novo protocolo foi baseado em estudos que conseguiram extrair e avaliar miRNAs em vários tipos de tecido 11,12,13. O sistema de trituração de biopolímeros do protocolo foi demonstrado para ser capaz de purificar o RNA total de alta qualidade dos tecidos11. A precisão e sensibilidade dos aspectos deste protocolo utilizados para a avaliação da expressão miRNA por qRT-PCR com um corante intercalante foram estabelecidas13,14, por exemplo, a síntese cDNA com transcriptase reversa, poli(A) polimerase e primers oligo-dT do RNA total extraído. O novo protocolo tem várias vantagens: simplicidade, economia de tempo e redução de erros técnicos. Pode, assim, ser usado para investigações que requerem identificação precisa e sensível de perfis de miRNA renal e soro. Estudos de muitas condições patológicas também podem utilizar o novo protocolo.

Os perfis de expressão miRNA em camundongos SAMP1, que são um modelo de comprometimento renal dependente da idade, podem ser determinados como mostrado abaixo. Em humanos, o comprometimento renal dependente da idade está associado à progressão da insuficiência renal e é caracterizado tanto pelo aumento da área de fibrose intersticial renal quanto pela progressão da glomerulosclerose15,16. O comprometimento renal dependente da idade também é uma característica importante e frequente da doença renal crônica e da doença renal em estágio terminal15,16.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética Animal da Jichi Medical University e realizado de acordo com o Guia da Universidade Médica jichi para animais de laboratório e suas diretrizes relativas ao uso e cuidado de animais experimentais. Este protocolo usa quatro camundongos machos SAMR1 de 50 semanas de idade e camundongos machos SAMP1 (40-45 g).

1. Coleta de amostras de soro

  1. Prepare o seguinte para cada rato: agulhas de 30 G com uma seringa de 1,0 mL, um tubo de centrifugação de 1,0 mL com heparina, tubos de microcentrífade de 1,5 mL, anestésico isoflurane, uma folha de cortiça, 70% de etanol, duas cotonetes de algodão umedecidas com soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS), uma placa de Petri com PBS, pinças e tesoura cirúrgica.
  2. Anestesiar o mouse com isoflurane de 1,5% e manter em 1,5%. Administre um analgésico (Meloxicam 5 mg/kg) subcutâneamente, em seguida, injete 1,0 mL de 70% de etanol em seu abdômen e coloque-o na posição supina na folha de cortiça.
  3. Confirme a profundidade da anestesia pelo desaparecimento do reflexo de retirada do pedal. Com a pinça e a tesoura cirúrgica, inciso a pele do abdômen. Corte os músculos e a membrana peritoneal da bexiga até a borda inferior esquerda das costelas.
  4. Use a pinça para levantar a membrana peritoneal e faça uma incisão lateral na borda superior da membrana peritoneal com a tesoura cirúrgica. Continue a incisão ao longo da borda mais baixa das costelas.
  5. Identifique a veia cava inferior usando os dois cotonetes de algodão umedecidos pbs. Insira uma das agulhas de 30 G com a seringa de 1,0 mL na cava vena inferior e, em seguida, puxe a seringa. Puxe a agulha para fora da veia cava inferior lentamente para evitar hemólise. Transfira o sangue para o tubo de spitz de 1,0 mL com heparina e misture-o invertendo o tubo várias vezes.
    NOTA: O rato é eutanizado por luxação cervical.
  6. Gire o tubo de spitz à temperatura ambiente (RT), 3.000 × g por 10 min.
  7. Aspire lentamente o supernante, certifique-se de que ele não contém sedimentos e, em seguida, transfira-o para um tubo de microcentrifuge de 1,5 mL nãoutil.
  8. Armazene o tubo a −80 °C antes de usar.
    NOTA: Se seguir imediatamente para a Etapa 3, o tubo não precisa ser armazenado a −80 °C.

2. Coleta de amostras de rim

  1. Prepare o seguinte para cada rato: criobotos de 2,0 mL, anestésico isoflurane, uma folha de cortiça, 70% de etanol, uma placa de Petri com PBS, pinças e tesoura cirúrgica.
  2. Anestesiar o mouse com isoflurane de 1,5% e manter em 1,5%. Administre um analgésico (Meloxicam 5 mg/kg) subcutâneamente, em seguida, injete 1,0 mL de 70% de etanol em seu abdômen, e coloque-o na posição supina na folha de cortiça.
  3. Confirme a profundidade da anestesia pelo desaparecimento do reflexo de retirada do pedal. Use a pinça e a tesoura cirúrgica para fazer uma incisão na pele abdominal. Corte os músculos e a membrana peritoneal da bexiga até a borda inferior esquerda das costelas.
  4. Use a pinça para levantar a membrana peritoneal e fazer uma incisão lateral na borda superior da membrana peritoneal com a tesoura cirúrgica. Continue a incisão ao longo da borda mais baixa das costelas.
  5. Identifique o rim esquerdo. Refluxo com PBS para tirar o sangue dos vasos até que o rim se torne uma cor amarelada-branca. Extir nosso rim inteiro primeiro usando tesoura cirúrgica para cortar a artéria renal esquerda e veia. Coloque o rim em uma placa de Petri e lave-o cuidadosamente com PBS.
    NOTA: O rato é eutanizado por luxação cervical.
  6. Use a pinça e a tesoura cirúrgica para cortar o rim em amostras de 10 mg (10 mgs é um tamanho amostral adequado para o próximo passo). Coloque cada amostra do rim em seu próprio crioboto de 2,0 mL. Feche a tampa do tubo.
  7. Para armazenamento a longo prazo, transfira cada crioboto para nitrogênio líquido e armazene-o a −80 °C.

3. Extração total de RNA de uma amostra de soro

  1. Prepare os seguintes itens primeiro: um misturador de vórtice, reagente de lise à base de fenol/guanidina, 80% de etanol, 100% etanol, 100% clorofórmio, colunas de giro biopolímero (em tubos de coleta de 2,0 mL11), colunas de giro ancoradas em membrana (em tubos de coleta de 2,0 mL11), tampão de lavagem #1 (ou seja, tampão de lavagem contendo guanidina e 100% etanol em uma razão de 1:2), tampão de lavagem #2 (i.e., tampão de lavagem contendo guanidina e 100% etanol em uma proporção de 1:4), água sem RNase, tubos de microcentrifuuge de 1,5 mL e tubos de microcentrifuuge de 2,0 mL.
  2. Primeiro, pegue uma amostra de soro de 200 μL em um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL e, em seguida, adicione 1.000 μL do reagente de lise à base de fenol/guanidina. Vórtice a mistura para 5 s.
  3. Incubar a amostra em RT por 5 min.
  4. Adicione 200 μL de clorofórmio à amostra de soro no tubo e feche bem a tampa do tubo. Inverta o tubo 15x para misturar o clorofórmio e a amostra de soro.
  5. Cada amostra é incubada em RT por 3 minutos. Em seguida, gire a amostra a 4 °C por 15 min a 12.000 x g.
  6. Transfira os 300 μL de supernascer para um novo tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL sem perturbar a pelota. Adicione 450 μL de 100% de etanol, e vórtice do tubo por 5 s.
    NOTA: Em todas as etapas a seguir, coloque a coluna de giro ancorada em membrana para a separação de RNA e DNA em um tubo de coleta de 2,0 mL para centrífugue.
  7. Em seguida, remova 700 μL da amostra, carregue-a em uma coluna de giro ancorada em membrana e feche a tampa. Gire a coluna em RT por 15 s a 8.000 × g, e deixe o sobrenante na coluna. Descarte a pelota restante no tubo de coleta.
  8. Adicione 700 μL de tampão de lavagem #1 que faz parte do kit de soro/plasma (ver a Tabela de Materiais) à coluna de giro ancorada na membrana para limpar bem a amostra. Feche a tampa da coluna e gire a coluna em RT para 15 s a 8.000 × g, e deixe o sobrenante na coluna. Descarte a pelota restante no tubo de coleta.
  9. Para a remoção de sais de rastreamento, pegue 500 μL de tampão de lavagem #2 e carregue-o em uma coluna de giro ancorada em membrana. Após fechar a tampa da coluna, gire a coluna em RT por 15 s a 8.000 × g, e deixe o sobrenante na coluna. Descarte a pelota no tubo de coleta.
  10. Para a remoção de sais de rastreamento, pegue 500 μL de 80% de etanol e carregue-o em uma coluna de giro ancorada em membrana. Após fechar a tampa da coluna, gire a coluna em RT por 15 s a 8.000 × g, e deixe o sobrenante na coluna. Descarte a pelota no tubo de coleta.
  11. Gire novamente a coluna de giro ancorada em membrana na RT por 5 min a 15.000 × g.
  12. Depois de transferir a coluna de spin ancorada por membrana para um novo tubo de coleta de 1,5 mL, adicione 14 μL de água livre de RNase à coluna para dissolver o RNA total. Depois de fechar a tampa da coluna, espere 5 min com o tubo deixado no RT. Gire a coluna novamente por 1 min a 15.000 × g no RT.
  13. Armazene os tubos com amostras a −80 °C antes de usar.

4. Extração do RNA total de uma amostra de rim

  1. Prepare os seguintes itens primeiro: um homogeneizador de silício, gelo, um misturador de vórtice, 100% etanol, 100% clorofórmio, colunas de spin biopolímeras (em tubos de coleta de 2,0 mL11), colunas de spin ancoradas em membrana (em tubos de coleta de 2,0 mL11), reagente à base de fenol/guanidina, tampão de lavagem #1 (o mesmo tampão da Etapa 3.1.), tampão de lavagem #2 (o mesmo tampão do Passo 3.1.), tampão de lavagem #2 (o mesmo tampão do Passo 3.1.), tampão de lavagem #2 (o mesmo tampão do Passo 3.1.), Água sem rnase, tubos de microcentrifuus de 1,5 mL e tubos de microcentrifuuge de 2,0 mL.
  2. Coloque uma amostra de 10 mg de rim no homogeneizador de silício e adicione 700 μL do reagente de lise à base de fenol/guanidina.
  3. Coloque o homogeneizador. Pressione suavemente e torça o pilão do homogeneizador contra a amostra renal para homogeneizar a amostra. Continue pressionando e torça o pilão até que a amostra de rim esteja completamente homogeneizada no reagente de lise à base de fenol/guanidina.
  4. Para maior homogeneização, pegue o liseto homogeneizado (em um tubo de coleta de 2,0 mL) e transfira-o para uma coluna de giro de biopolímero.
  5. Centrifugar o lise homogeneizado em RT por 3 min a 14.000 × g e, em seguida, transferir toda a pelota precipitada para um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL nãoutil para inverter a pelota precipitada
  6. Misture a pelota com 140 μL de clorofórmio no tubo; em seguida, feche a tampa do tubo firmemente. Inverta o tubo 15x para misturar o liseto e o clorofórmio.
    NOTA: O clorofórmio pode ser usado com segurança sem um capô.
  7. Incubar a amostra em RT por 2-3 min. Centrifugar a amostra a 4 °C por 15 min a 12.000 × g.
  8. Transfira o supernatante (que geralmente é ~300 μL) para um novo tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL, sem perturbar o precipitado. Adicione 1,5 vezes seu volume (que geralmente é ~450 μL) de 100% de etanol. Vórtice a mistura para 5 s.
    NOTA: Em todas as etapas a seguir, coloque a coluna de giro ancorada em membrana para separar RNA e DNA em um tubo de coleta de 2,0 mL para centrifuá-lo.
  9. Carregue 700 μL de amostra em uma das colunas de giro ancoradas em membrana. Feche a tampa e centrifugar a coluna a 15.000 × g para 15 s. Descarte o lise precipitado que permanece no tubo de coleta.
  10. Adicione 700 μL de tampão de lavagem #1 à coluna de giro para lavá-lo completamente. Feche a tampa e centrifugar a coluna a 15.000 × g para 15 s. Descarte o lise precipitado que permanece no tubo de coleta.
  11. Para a remoção de vestígios de sal, carregue 500 μL de tampão de lavagem #2 na coluna de giro ancorada na membrana. Após fechar a tampa da coluna, centrifugar a coluna a 15.000 × g para 15 s. Descarte o lise precipitado no tubo de coleta.
  12. Repita o passo 4.11.
  13. Centrifugar a coluna de giro ancorada em membrana novamente por 1 min a 15.000 × g. Descarte o lise precipitado no tubo de coleta.
  14. Pegue a coluna de giro ancorada na membrana e transfira-a para um novo tubo de coleta de 1,5 mL. Adicione 30 μL de água sem RNase à coluna para dissolver o RNA total. Depois de fechar a tampa da coluna, espere por 5 min com o tubo no RT e, em seguida, centrifugar a coluna por 1 min a 15.000 × g.
  15. Transfira o volume total da amostra contendo RNA total para um novo tubo de microcentrífuga. Coloque o tubo no gelo e meça a concentração total de RNA por espectrofotometria. Certifique-se de que a concentração total de RNA seja ~300-1.500 ng/μL.
  16. Armazene tubos contendo amostras a −80 °C antes de usar.

5. Síntese de cDNA com a transcrição reversa do RNA total no soro

NOTA: As informações mínimas para a publicação de testes quantitativos em tempo real de PCR (MIQE) recomendam o uso de melhores práticas experimentais para obter resultados confiáveis e inequívocos17. Neste protocolo, o cDNA é sintetizado a partir do RNA total purificado em um procedimento de duas etapas usando transcriptase reversa, poli(A) polimerase e primers oligo-dT.

  1. Prepare o seguinte primeiro: um misturador de vórtice, um ciclofaente térmico, tubos de tira de oito poços, a tampa de cada tubo de oito tiras, água destilada, gelo, o kit de transcriptase reversa (ver a Tabela de Materiais)13,14 no estado derretido e tubos de microcentrifuagem de 1,5 mL.
  2. Inicie o ciclo cicruto térmico.
  3. Preparar a solução de mix mestre; para obter um total de 8,0 μL de mix mestre por tubo de tira de oito poços, adicione 2,0 μL de mistura de transcriptase reversa (incluído no kit) e 2,0 μL de mistura de ácido nucleico de 10x a 4,0 μL de tampão de transcrição reversa em um tubo de microcentrifus de 1,5 mL.
  4. Coloque 8,0 μL da solução de mistura mestre em cada tubo de um tubo de tira de oito poços.
  5. Coloque uma alíquota de 12 μL de RNA total em cada tubo do tubo de tira de oito poços e feche a tampa do tubo. Centrifugar o tubo por 15 s em RT e 2.000 × g.
  6. Coloque o tubo no ciclofatómpro térmico e incubar por 60 min a 37 °C. Incubar a amostra por mais 5 min a 95 °C min para sintetizar o cDNA.
  7. Após a incubação, transfira o cDNA para um novo tubo de microcentrifuge de 1,5 mL. Diluir o cDNA dez vezes (1:10) com água destilada. Vórtice e centrífuga do tubo para 5 s em RT e 2.000 × g.
  8. Armazene o cDNA diluído temporariamente no gelo. Armazene as amostras diluídas a −80 °C antes de usar.

6. Síntese de CDNA com a transcrição reversa do RNA total no rim

NOTA: As diretrizes do MIQE incentivam melhores práticas experimentais para garantir resultados confiáveis e inequívocos17. Este protocolo usa transcriptase reversa, poli(A) polimerase e primers oligo dT para sintetizar cDNA a partir de 1,0 μg de RNA total purificado em um procedimento de duas etapas.

  1. Primeiro, prepare o seguinte: um misturador de vórtice, um ciclofaente térmico, tubos de microcentrifusagem de 1,5 mL, tubos de tira de oito poços, a tampa de cada tubo de oito tiras, água destilada, gelo e um kit de transcriptase reversa (ver a Tabela de Materiais)13,14 no estado derretido.
  2. Inicie o ciclo cicruto térmico.
  3. Preparar a solução de mix mestre; para obter um total de 8,0 μL de solução de mix mestre por tubo, adicione 2,0 μL da mistura de transcriptase reversa que está incluída no kit e 2,0 μL de mistura de ácido nucleico 10x a 4,0 μL do buffer de transcrição reversa.
  4. Adicione 8,0 μL da solução de mixagem mestre a cada tubo de um tubo de tira de oito poços.
  5. Ajuste a densidade total do RNA da seguinte forma. Para a separação de 1,0 μg de RNA total de uma amostra de rim com 12 μL de água livre de RNase, pegue uma quantidade adequada de RNA total e transfira-a para água destilada usando a concentração medida como descrito acima (na Etapa 4.15.).
    NOTA: Na presença de contaminação do DNA, o DNA contaminado é co-amplificado pelo qRT-PCR.
  6. Realize o mesmo processo descrito acima nas Etapas 5.5.-5.8.

7. O qRT-PCR do miRNA

NOTA: Um método intercalador é usado para o qRT-PCR dos miRNAs. Os primers são usados para RNA: U6 pequeno nuclear 2 (RNU6-2), miRNA-223-3p, miRNA-423-5p, miRNA-7218-5p e miRNA-7219-5p.

  1. Prepare o seguinte: um misturador de vórtice, um sistema PCR em tempo real, uma placa de reação de 96 poços para qRT-PCR, película adesiva para a placa de reação de 96 poços, aplicador de filme adesivo, um rotor de centrífugas de 96 poços, primers específicos de miRNA, um kit PCR baseado em corante verde contendo 2x mistura mestre PCR e primer universal de 10x (ver a Tabela dos Materiais)13,14, e um tubo de microcentrifuge de 1,5 mL.
  2. Vórtice a seguir depois de misturá-los em um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL: 6,25 μL de água destilada, 1,25 μL cada um de 5 μM de primer miRNA dissolvido em água livre de nuclease, 12,5 μL de mistura mestre PCR 2x e 2,5 μL de 10x primer universal.
  3. Prepare e derreta o cDNA sintetizado como descrito na Etapa 5 (soro) ou passo 6 (rim). Vórtice e centrífuga o cDNA para 5 s.
  4. Pegue 22,5 μL alíquotas do reagente (conforme descrito na Etapa 7.2. acima) e coloque-os separadamente em cada poço da placa de 96 poços.
  5. Adicione uma alíquota de 2,5 μL de cDNA a cada poço da placa.
  6. Para fixar o filme adesivo na placa, use o aplicador de filme adesivo. Centrifugar a placa por 30 s a 1.000 x g no rotor centrífugas de 96 poços. Estabilize a reação na parte inferior de cada poço.

8. Usando o sistema e software PCR em tempo real para executar o programa de ciclismo PCR

  1. Inicie o sistema PCR em tempo real. Coloque a placa criada conforme descrito na Etapa 7.6. no sistema PCR em tempo real. Modificar as configurações; fornecer um nome para o experimento e, em seguida, selecione 96-well (0,2 mL) como o tipo de experimento do sistema, CT comparativo (ΔΔCT) como o método de quantitação, padrão como o modo de execução do sistema, e Reagentes Verdes SYBR como reagentes para detectar a sequência de destino.
  2. Forneça nomes para a amostra e os miRNAs de destino, e nomeie a amostra e o miRNA alvo em cada poço. Atribua amostras duplicadas para obter dados adequados para confirmar os resultados e escolha uma amostra de referência e o controle endógeno. Para que o corante use como referência passiva, selecione nenhum. Para eliminar a contaminação cruzada do reagente, configure transcriptase reversa negativa e um controle não-modelo para expressão miRNA.
  3. Em seguida, certifique-se de que o volume de reação está definido para 20 μL e as condições de ciclismo PCR são definidas da seguinte forma: 95 °C para 15 min, depois 40 ciclos de desnaturação a 94 °C para 15 s, ressarem a 55 °C para 30 s e, por último, extensão a 70 °C para 30 s.
  4. Clique em analisar no programa de software do sistema para analisar os dados qRT-PCR após o processo ser concluído. Confirme se a linha de limiar automaticamente selecionada pelo programa é apropriada para cada poço.
  5. Verifique o valor do ciclo limiar (CT) do controle endógeno e dos miRNAs de destino analisados em cada amostra. Determine os valores ct pela intersecção da curva de amplificação e linha limiar.
    NOTA: No presente estudo, RNU6-2 e miRNA-423-5p foram utilizados como controles endógenos para níveis de expressão miRNA alvo, e o método ΔΔCT foi utilizado para determinar os níveis de expressão relativos de cada miRNA18 alvo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para o modelo de camundongos com comprometimento renal dependente da idade, utilizamos camundongos machos SAMP1 de 50 semanas de idade pesando 40-45 g. Aproximadamente 0,8 mL de sangue foi coletado por rato e transferido para um tubo de espirro de 1,0 mL com heparina, invertido e centrifudo. Cada rim foi enxaguado com PBS, dissecado e armazenado em nitrogênio líquido para análise posterior. Os ratos SAMR1 de 50 semanas serviram como controles. Com base nos dados miRNA qRT-PCR obtidos usando este modelo de comprometimento renal dependente da idade, observou-se que o nível renal de miRNA-7219-5p foi significativamente aumentado e o nível renal de miRNA-7218-5p foi consideravelmente reduzido nos camundongos SAMP1 em comparação com os controles (Figura 1). Os níveis de soro tanto de miRNA-7219-5p quanto de miRNA-7218-5p foram consideravelmente aumentados nos camundongos SAMP1 em comparação com os controles (Figura 2). Os níveis de expressão do miRNA-223-3p não mudaram tanto na tensão quanto entre rim e soro (Figura 1 e Figura 2).

figure-results-1
Figura 1: MicroRNAs expressos diferencialmente nos rins de camundongos SAMP1. qRT-PCR análise da expressão de miRNA-223-3p, miRNA-7218-5p, e miRNA-7219-5p em camundongos SAMR1 (controle, n = 4) e camundongos SAMP1 (n = 4). Os dados são médios ± erro padrão (barras de erro); foram utilizados testes t para análise de diferenças entre grupos; p < 0,05 foi considerado significativo (*p < 0,05), n.s.: não significativo. Abreviaturas: miRNA = microRNA; SAMP1 = propenso a camundongos com senescência; SAMR1 = resistência acelerada do rato senescência 1; qRT-PCR = reação quantitativa de cadeia de transcrição reversa-polimerase. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: MiRNAs expressos diferencialmente no soro de ratos SAMP1. qRT-PCR análise da expressão de miRNA-223-3p, miRNA-7218-5p, e miRNA-7219-5p em camundongos SAMR1 (controle, n = 4) e camundongos SAMP1 (n = 4). Os dados são médios ± SE (barras de erro); os t-testes foram utilizados para investigar diferenças significativas entre os grupos. *p < 0,05 por t-test. Abreviaturas: miRNA = microRNA; SAMP1 = propenso a camundongos com senescência; SAMR1 = resistência acelerada do rato senescência 1; qRT-PCR = reação quantitativa de cadeia de transcrição reversa-polimerase Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os níveis de expressão dos miRNAs alvo foram determinados com sucesso pelo protocolo acima descrito usando qRT-PCR. A avaliação dos miRNAs extraídos é um passo importante na obtenção de dados significativos de qRT-PCR. Para confirmar a qualidade adequada dos miRNAs antes de realizar o qRT-PCR, a espectrofotometria deve ser usada para determinar a razão de absorvância em 260 nm para a de 280 nm. A contaminação do DNA pode ocorrer, e/ou os dimers de primer em cada poço da placa de reação podem estar presentes se o qRT-PCR não fornecer uma única amplificação pcr do comprimento esperado e temperatura de fusão, ou se fornece uma curva de fusão monomodal.

Os níveis de expressão do MiRNA podem ser avaliados por vários métodos que não o qRT-PCR, incluindo manchas do norte, uma microarray e ensaios de proteção à ribonuclease. No entanto, o método qRT-PCR é um procedimento sensível, preciso, simples e reprodutível que requer um volume amostral menor do que os necessários para os ensaios de proteção de manchas do norte e ribonuclease19. Uma vez que as microarrays podem medir a expressão de dezenas de milhares de miRNAs simultaneamente, elas podem ser usadas para identificar marcadores miRNA candidatos. Os dados da microarray também mostram uma alta correlação global com os dados obtidos pelo qRT-PCR20. No entanto, não foi alcançado consenso quanto à metodologia ideal para comparação de dados de microarray obtidos em diferentes estudos21.

A avaliação do soro miRNAs tem as seguintes características. Primeiro, é fácil coletar soro, e como os miRNAs soro são estáveis contra congelamento e descongelamento, temperatura e ácido, os miRNAs podem ser bons biomarcadores. Em segundo lugar, há alta homologia de miRNAs entre as espécies, e os resultados de experimentos em animais são facilmente extrapolados para os seres humanos. Em terceiro lugar, os miRNAs soro têm mostrado potencial de uso como drogas terapêuticas3. Vários estudos também demonstraram que o nível de expressão do miRNA nos órgãos está correlacionado com o miRNA no soro 22,23,24. No presente estudo, o miRNA-223-3p, dos quais os níveis renais não apresentaram diferença significativa entre os camundongos SAMR1 e SAMP1, também não mostrou diferença significativa entre a cepa no soro. Em contraste, miRNA-7218-5p e miRNA-7219-5p, dos quais os níveis renais mostraram uma diferença significativa entre os camundongos SAMR1 e SAMP1, mostraram diferenças consideráveis entre as cepas no soro.

Este protocolo tem as seguintes limitações. Primeiro, sua utilidade não foi verificada em outros órgãos, como fígado e pulmão, e segundo, não foi testada em outros animais de laboratório, como ratos, cães e suínos. Vários grupos de pesquisa utilizaram este protocolo para a purificação e detecção de miRNAs por qRT-PCR e relataram que este protocolo permitiu a purificação de RNA de alta qualidade de tecidos e soro 13,14,22,23,24. Este método demonstrou ter alta precisão e sensibilidade para detectar a expressão de miRNAs 13,14,22,23,24. Os resultados do presente estudo demonstram que este protocolo pode detectar com sucesso a expressão miRNA no soro e rim de camundongos. Portanto, o protocolo pode ser usado para determinar os perfis de expressão de miRNA sérico e renal em camundongos com uma variedade de patologias. Devido à simplicidade do protocolo, um grande número de amostras pode ser processado simultaneamente. Análises da expressão de muitos miRNAs em várias condições patológicas do rim podem, assim, usar o protocolo aqui descrito.

Há certos aspectos do protocolo a ter em mente. Para evitar a degradação dos miRNAs purificados que ocorreriam à temperatura ambiente, as miRNAs devem ser mantidas no gelo. As amostras de rim devem ser homogeneizadas até que estejam completamente dissolvidas no reagente da lise. O rim do rato contém uma quantidade substancial de tecido conjuntivo insolúvel no reagente de lise, e assim é necessário um triturador de coluna para maior homogeneização. Além disso, o miRNA de controle endógeno apropriado (com expressão estável entre as amostras) deve ser validado durante toda a configuração de um experimento qRT-PCR. Isso ocorre porque a interferência de várias substâncias durante o desempenho deste protocolo pode alterar os níveis de expressão de miRNAs de controle endógeno, possivelmente comprometendo os resultados. Em conclusão, este artigo descreve um protocolo qRT-PCR para detecção, purificação e avaliação da expressão miRNA no soro e rim de camundongos com comprometimento renal dependente da idade.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram que não têm conflitos de interesse.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1,0 mL de spitz com heparinaGreiner-bio-one450534
Buffer RPE (tampão de lavagem #2 contendo guanidina e etanol na proporção de 1:4)Qiagen79216Tampão de lavagem 2
Buffer RWT (tampão de lavagem #1 contendo guanidina e etanol na proporção de 1:2)Tampão Qiagen1067933Wash 1
MicroAmp Placa de reação óptica de 96 poços para qRT-PCRThermo Fisher Scientific4316813placa de reação de 96 poços
Filme adesivo óptico MicroAmpThermo Fisher Scientific4311971Filme adesivo para placa de reação de 96 poços
primer miRNA-223-3pQiagenMS000038715'-CGUGUAUUUGACAAGCUGAGUU
G-3'miRNA-423-5p
primerQiagenMS000120055'-UGAGGGGCAGAGAGCGAGACU
UU-3'
miRNA-7218-5p primerQiagenMS000680675'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG
-
primerQiagenMS000680815'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGA
GA-3'miRNeasy
Mini kitQiagen217004Coluna giratória ancorada por membrana em um tubo de coleta de 2,0 mL
miRNeasy Kit de soro/plasmaQiagen217184Coluna de rotação ancorada por membrana em um tubo de coleta de 2,0 mL
kit miScript II RT (tampão de transcrição reversa)Qiagen218161Kit de transcriptase reversa
kit de PCR verdeQiagen218073Kit de PCR à base de corante verde
QIA trituradorQiagen79654Colunas de rotação de biopolímero em um tubo de coleta de 2,0 mL
Reagente de lise QIAzol (lise à base de fenol/guanidina reagente)Qiagen79306Reagente de lise à base de fenol/guanidina
QuantStudio 12K Flex Flex Sistema de PCR em tempo realThermo Fisher Scientific4472380Instrumento de PCR em tempo real
QuantStudio 12K Flex Software versão 1.2.1.Thermo Fisher Scientific4472380Software de instrumento de PCR em tempo real
Água sem RNaseQiagen129112
RNU6-2 primerQiagenMS00033740Não divulgado devido à confidencialidade
Camundongos machos SAMP1Nippon SLC CorporationNão atribuído
SAMR1 camundongos machosNippon SLC CorporationNão atribuído
Homogeneizador de silícioTakara9790Bpadrão de biomasher Takara
3'miRNA-7219-5p Bio Bio

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huang, Y. The novel regulatory role of lncRNA-miRNA-mRNA axis in cardiovascular diseases. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (12), 5768-5775 (2018).
  2. Yang, C., Dou, R., Yin, T., Ding, J. MiRNA-106b-5p in human cancers: diverse functions and promising biomarker. Biomedicine and Pharmacotherapy. 127, 110211(2020).
  3. Lu, T. X., Rothenberg, M. E. MicroRNA. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (4), 1202-1207 (2018).
  4. McGuire, A., Brown, J. A., Kerin, M. J. Metastatic breast cancer: the potential of miRNA for diagnosis and treatment monitoring. Cancer and Metastasis Reviews. 34 (1), 145-155 (2015).
  5. Bjorkman, S., Taylor, H. S. MicroRNAs in endometriosis: biological function and emerging biomarker candidates. Biology of Reproduction. 100 (5), 1135-1146 (2019).
  6. Zhou, C. X., et al. miRNA and circRNA expression patterns in mouse brain during toxoplasmosis development. BMC Genomics. 21 (1), 46(2020).
  7. Jing, R., Zhong, Q. Q., Long, T. Y., Pan, W., Qian, Z. X. Downregulated miRNA-26a-5p induces the apoptosis of endothelial cells in coronary heart disease by inhibiting PI3K/AKT pathway. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 23 (11), 4940-4947 (2019).
  8. Xie, W., et al. miR-34b-5p inhibition attenuates lung inflammation and apoptosis in an LPS-induced acute lung injury mouse model by targeting progranulin. Journal of Cellular Physiology. 233 (9), 6615-6631 (2018).
  9. Bala, S., et al. Circulating microRNAs in exosomes indicate hepatocyte injury and inflammation in alcoholic, drug-induced, and inflammatory liver diseases. Hepatology. 56 (5), 1946-1957 (2012).
  10. Ishii, H., et al. MicroRNA expression profiling in diabetic kidney disease. Translational Research. 237, 31-52 (2021).
  11. Latorre Luque, J. Relevance of the epigenetic regulation exercised by hepatic microRNAs in the fatty liver arena: from the bedside to the bench. , Available from: http://hdl.handle.net/10803/671499 (2019).
  12. Mastropasqua, R., et al. Serum microRNA levels in diabetes mellitus. Diagnostics (Basel). 11 (2), 284(2021).
  13. Gordanpour, A., Nam, R. K., Sugar, L., Bacopulos, S., Seth, A. MicroRNA detection in prostate tumors by quantitative real-time PCR (qPCR). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e3874(2012).
  14. Ahn, J. H., Kwak, J., Lee, J. H., Lee, S. S. Efficient and accurate analysis of microRNA using a specific extension sequence. Molecular Biology Reports. 45 (4), 611-619 (2018).
  15. Denic, A., Glassock, R. J., Rule, A. D. Structural and functional changes With the aging kidney. Advances in Chronic Kidney Disease. 23 (1), 19-28 (2016).
  16. Weinstein, J. R., Anderson, S. The aging kidney: physiological changes. Advances in Chronic Kidney Disease. 17 (4), 302-307 (2010).
  17. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
  18. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  19. Rajeevan, M. S., Vernon, S. D., Taysavang, N., Unger, E. R. Validation of array-based gene expression profiles by real-time (kinetic) RT-PCR. The Journal of Molecular Diagnostics. 3 (1), 26-31 (2001).
  20. Chen, Y., Gelfond, J. A., McManus, L. M., Shireman, P. K. Reproducibility of quantitative RT-PCR array in miRNA expression profiling and comparison with microarray analysis. BMC Genomics. 10, 407(2009).
  21. Dallas, P. B., et al. Gene expression levels assessed by oligonucleotide microarray analysis and quantitative real-time RT-PCR -- how well do they correlate. BMC Genomics. 6, 59(2005).
  22. Petriella, D., et al. miRNA profiling in serum and tissue samples to assess noninvasive biomarkers for NSCLC clinical outcome. Tumour Biology. 37 (4), 5503-5513 (2016).
  23. Skrzypa, M., et al. miRNA-146a-5p is upregulated in serum and cartilage samples of patients with osteoarthritis. Polski Przeglad Chirurgiczny. 91 (3), 1-5 (2019).
  24. Farzanehpour, M., et al. Serum and tissue miRNAs: potential biomarkers for the diagnosis of cervical cancer. Journal of Virology Journal. 16 (1), 116(2019).

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

PCR Quantitativo em Tempo RealMicroRNA do Soro RenalExtra o de RNATranscri o ReversaDetec o por SYBR GreenM todo CT ComparativoRim de CamundongoPrepara o de Amostras de Soro

Artigos relacionados