Artigo de método

Isolamento e Caracterização de Ficobilisome intacto em cianobactérias

DOI:

10.3791/63272

⸱

10 de novembro de 2021

 , 
1Department of Life Science, National Taiwan University, 2Institute of Plant Biology, National Taiwan University

Neste artigo

Resumo

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O protocolo atual detalha o isolamento de ficobilísomees de cianobactérias por centrifugação através de um gradiente de densidade de sacarose descontínua. As frações de ficobilismos intactos são confirmadas pelo espectro de emissão fluorescente de 77K e pela análise de SDS-PAGE. As frações ficobilínicas resultantes são adequadas para coloração negativa da TEM e análise de espectrometria de massa.

Resumo

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Em cianobactérias, o ficobiliso é um complexo proteico de antena vital que colhe luz e transfere energia para fotossistema I e II para fotoquímica. Estudar a estrutura e a composição do ficobilisome é de grande interesse para os cientistas porque revela a evolução e divergência da fotossíntese nas cianobactérias. Este protocolo fornece um método detalhado e otimizado para quebrar células cianobacterianas a baixo custo por um batedor de contas de forma eficiente. O ficobiliso intacto pode então ser isolado do extrato celular por ultracentrifugação gradiente de sacarose. Este método demonstrou ser adequado tanto para cianobactérias modelo quanto não modelo com diferentes tipos de células. Um procedimento passo a passo também é fornecido para confirmar a integridade e propriedade de ficobiliproteínas por espectroscopia de fluorescência de 77K e SDS-PAGE manchada por sulfato de zinco e Coomassie Blue. O ficobiliso isolado também pode ser submetido a novas análises estruturais e composicionais. No geral, este protocolo fornece um guia de partida útil que permite aos pesquisadores não familiarizados com cianobactérias isolar e caracterizar ficobilisma intacta.

Introdução

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Ficobilisome (PBS) é um enorme complexo de proteína pigmento solúvel em água que se liga ao lado citoplasmático dos fotossistemas nas membranas thylakoidas de cianobactérias1. A PBS é composta principalmente de ficobiliproteínas coloridas e proteínas de linker incolor1,2. As ficobiliproteínas podem ser divididas em quatro grandes grupos: ficoerthrina, ficoerytrocyanina, ficocitanina e alofilianina3. Os quatro principais grupos absorvem diferentes comprimentos de onda de energia leve na faixa de 490-650 nm, que clorofilas absorviam ineficientemente3. O PBS pode servir como uma antena de captação de luz para coletar energia leve e entregá-la ao Photosystem II e I4.

A estrutura e a composição da PBS variam de espécie para espécie. Coletivamente, três formas de ficobiliso (hemidiscodial, em forma de feixe e em forma de vara) foram identificadas em diferentes espécies cianobacterianas5. Mesmo na mesma espécie, a composição da PBS muda em resposta ao meio ambiente, como qualidade da luz e esgotamento de nutrientes6,7,8,9,10,11. Portanto, o procedimento experimental para isolar a PBS das cianobactérias tem sido fundamental no estudo do PBS12. Ao longo de várias décadas, diversos protocolos isolaram a PBS e analisaram sua estrutura, composição e função6,7,8,12,13,14,15,16,17. A grande variedade de métodos para o isolamento da PBS de fato proporciona flexibilidade na isolação do complexo em diferentes espécies com diferentes reagentes e instrumentos. No entanto, também torna a escolha de um protocolo adequado mais difícil para cientistas que não estão familiarizados com cianobactérias e PBS. Portanto, um protocolo generalizado e direto é desenvolvido neste trabalho para os interessados em iniciar o isolamento da PBS a partir de cianobactérias.

Os métodos para isolar a PBS de publicações anteriores são resumidos aqui. Uma vez que o PBS é um complexo proteico solúvel em água e é prontamente dissociado, um tampão de fosfato de alta resistência iônica é necessário para estabilizar a PBS durante a extração18. Vários artigos de pesquisa que descrevem métodos para o isolamento da PBS de cianobacterium foram publicados no passado. A maioria dos métodos requer uma alta concentração de tampão fosfato8,14,15,18,19. No entanto, os procedimentos para interrupção mecânica das células variam, como extração assistida por contas de vidro, sonicação20 e prensa francesa6,8,14. Diferentes ficobiliproteínas podem ser obtidas por precipitação com sulfato de amônio20 e purificadas por HPLC21 ou uma coluna cromatográfica22. Por outro lado, a PBS intacta pode ser facilmente isolada por ultracentrifugação gradiente de densidade de sacarose6,8,15.

Neste protocolo, um modelo de cianobacterium e um cianobacterium não modelo foram utilizados como materiais para o isolamento da PBS. São eles modelo unicelular tolerante à glicose Synechocystis sp. PCC 6803 (doravante Syn6803) e não-modelo filamentous Leptolyngbya sp. JSC-1 (doravante JSC-1), respectivamente7,23,24. O protocolo começa pela interrupção das cianobactérias unicelulares e filamentosas em um tampão fosfato de alta resistência iônica. Após a lise, os supernacantes são coletados por centrifugação e, em seguida, tratados com um detergente noniônico (Triton X-100) para solubilizar as proteínas solúveis em água das membranas thylakoid. As proteínas solúveis em água totais são aplicadas a um gradiente de densidade de sacarose descontínua para fracionar o PBS. O gradiente de sacarose descontínuo neste protocolo consiste em quatro soluções de sacarose e partições o PBS intacto nas frações mais baixas da camada de sacarose25. A integridade do PBS pode ser analisada por SDS-PAGE, manchas de zinco e espectroscopia de fluorescência de 77K6,7,8,26. Este método é adequado para cientistas que visam isolar o PBS intacto das cianobactérias e estudar suas propriedades espectrais, estruturais e composicionais.

Há várias vantagens deste protocolo. (1) Este método é padronizado e pode ser usado para isolar PBS intacto tanto de cianobactérias unicelulares quanto filamentosas. A maioria dos artigos descreve o método aplicado em qualquer um tipo de cianobactéria4,7,8,12,13,14,16,18. (2) Este método é realizado à temperatura ambiente, uma vez que o PBS se dissocia a baixa temperatura19,27. (3) Este método descreve o uso de um batedor de contas para interromper as células; portanto, é mais barato e mais seguro do que a imprensa francesa de alta pressão e possíveis danos auditivos do sonicator em outros métodos8,13,14,20. (4) Este método isola a PBS intacta por ultra centrifugação gradiente de sacarose. Desta forma, pbs intacto com diferentes tamanhos e PBS parcialmente dissociado pode ser separado com base na concentração de sacarose.

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Protocolo

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O Synechocystis sp. PCC 6803, o modelo de cepa tolerante à glicose, foi obtido do Dr. Chu, Hsiu-An na Academia Sinica, Taiwan. Leptolyngbya sp. JSC-1, o não-modelo filamentous, foi obtido do Dr. Donald A. Bryant na Universidade Estadual da Pensilvânia, EUA.

1. Cultura celular e colheita

  1. Inoculação Células Syn6803 ou JSC-1 usando um laço de inoculação metálica em um frasco cônico de 100 mL contendo 50 mL de B-HEPES médio28. Cultume as células a 30 °C sob 50 μmol fótons m-2 s-1 (LED de luz branca) em 1% (v/v) CO2 com agitação constante por um agitador magnético (120 rpm) até que a cultura atinja a fase de crescimento médio-exponencial (OD750 = 0,6-0,8).
    NOTA: Colher a cultura celular quando a densidade óptica da cultura a 750 nm (OD750) atingir 0,6-0,8 transferindo-se para um novo frasco. A densidade óptica foi usada rotineiramente para estimar a densidade celular microbiana em culturas líquidas29. Os comprimentos de onda de 720-750 nm foram utilizados em vários estudos para medir o crescimento cianobacteriano30,31,32. Neste protocolo, OD750 é usado porque o JSC-1 pode produzir pigmentos que absorvem a luz vermelha distante7. Alternativamente, a concentração de clorofila também foi utilizada para medir o crescimento de cianobactérias33.
  2. Transfira a cultura celular (OD750 ~0,8) em um frasco cônico 1L e dilua-a para OD750 = 0,2 em 500 mL de meio B-HEPES. Cresça a cultura até a fase final de crescimento exponencial (OD750 = 0,8-1,0) na mesma condição mencionada acima (passo 1.1) e depois colher a cultura por centrifugação.
  3. Centrifugar a cultura a 10.000 x g por 20 minutos à temperatura ambiente e descartar completamente o supernatante.
    NOTA: As pelotas das células podem ser armazenadas a -80 °C por até 6 meses.

2. Lise celular

  1. Suspenda as pelotas celulares e lave duas vezes com tampão de fosfato K de 0,75 M, pH 7.
    NOTA: Para fazer 0,75 M K-fosfato tampão no pH 7, prepare 1,5 M de K2HPO4 e 1,5 M de KH2PO4 separadamente. Misture 615 mL de 1,5 M K2HPO4 e 385 ml de 1,5M KH2PO4 para obter tampão de 1,5 M K-fosfato no pH 7. Basta diluí-lo com a mesma quantidade de ddH2O para fazer 0,75 M K-fosfato tampão em pH 7.
  2. Pellet as células em tubos de centrífugas de 50 mL por centrifugação a 10.000 x g por 20 minutos em temperatura ambiente. Descarte o supernasciente e resuspenque as células com 0,75 M K-fosfato tampão. Meça o peso úmido da pelota por um equilíbrio eletrônico e ressuspend 1 g de peso molhado da pelota em 5 mL do tampão.
    NOTA: O peso úmido de uma pelota foi medido subtraindo o peso de um tubo de centrífuga vazio do peso do tubo centrífuga contendo a pelota celular.
  3. Adicione 1 mL de suspensão celular e 0,4-0,6 g de contas de vidro de 0,1 mm (ver Tabela de Materiais) em um frasco de tampa de parafuso de 2 mL.
  4. Quebre as células por 30 s por um batedor de contas (ver Tabela de Materiais). Deixe os tubos esfriarem em um banho de água de temperatura ambiente por 2 minutos e repita o ciclo de ruptura 5 vezes.
  5. Após a lise, centrifugar os frascos a 500 x g para 10 s em temperatura ambiente. Colete o supernatante com uma pipeta em um tubo de centrífuga de 15 mL. Lave as contas com 0,5 mL de 0,75 M K-fosfato tampão uma vez, depois transfira para o mesmo tubo de centrífugas.
  6. Adicione Triton X-100 (2% c/v, concentração final) à suspensão celular líseda e incubar em um agitador de balanço (40 rpm) à temperatura ambiente até que a solução se torne homogênea (~20 min).
  7. Centrifugar os tubos a 17.210 g por 20 minutos para remover as células intactas e detritos celulares grandes. Armazene o supernatante sem a camada de micelle Triton superior à temperatura ambiente por até 1 h.
    NOTA: O supernatante contém duas camadas separadas. A camada triton x hidrofóbica superior contém proteínas de ligação de clorofila e ficobilisos em forma de vara hidrofóbica6. A camada aquosa inferior contém PBS solúvel em água.

3. Preparação dos tampões de gradiente de sacarose e isolamento da PBS

  1. Faça quatro concentrações de sacarose (2,0 M, 1,0 M, 0,75 M e 0,5 M) em 0,75 M K-fosfato tampão no pH 7.
    NOTA: Sugere-se usar tampão de fosfato de 1,5 M K no pH 7 para preparar o gradiente de sacarose, pois a adição de sacarose dilui a concentração do tampão de fosfato K. Depois que a sacarose estiver totalmente dissolvida, adicione ddH2O para ajustar a concentração a 0,75 M, pH 7.
  2. Coloque 2,8 mL de tampão de sacarose de 2,0 M na parte inferior do tubo centrífuga de 40 mL e sobreposição com três camadas de soluções de sacarose (8 mL de 1,0 M; 12 mL de 0,75 M e 11 mL de 0,5 M para tubo centrífugo de 40 mL), e finalmente PBS contendo a fração sobrenante (3,0 mL) (Figura 1A).
    NOTA: Adicione cuidadosamente a solução de sacarose e deixe a sacarose cair muito lentamente dentro do tubo. Segure a ponta da pipeta logo acima da superfície da solução no tubo enquanto carrega a solução. As camadas de sacarose podem ser observadas quando são colocadas lentamente em camadas.
  3. Centrifugar os gradientes resultantes a 125.800 x g para ~16h-20 h a 25 °C.NOTA: É necessário um ultracentrifuge (ver Tabela de Materiais) para esta etapa.
  4. Após a ultra-centrifugação, condensar as PBS fracionadas e as ficobiliproteínas entre as camadas. Bandas azuis em Syn6803 (bandas roxas mostradas em JSC-1) foram observadas nas interfaces (Figura 1D).
  5. Colete lentamente as frações com uma pipeta do topo dos gradientes de sacarose. Remova a sacarose concentrando-se repetidamente (3.500 x g por 20 min) e diluindo as frações com tampão de fosfato K de 0,75 M em unidades de filtro centrífugo de membrana (corte de peso molecular de 10 K, ver Tabela de Materiais).

4. Medição da fluorescência pbs em 77K

NOTA: Um fluorímetro equipado com um recipiente de nitrogênio líquido (ver Tabela de Materiais) é usado para medir espectros de fluorescência a 77K.

  1. Diluir a amostra concentrada de PBS com tampão de fosfato K de 0,75 M para obter pelo menos 500 μL.
    NOTA: As concentrações de ficocitanina das amostras foram ~4,2 μg mL-1 com base na fórmula: (OD615 0,474 x OD652)/5,34 [mg/mL]34.
  2. Adicione 500 μL da amostra pbs a um tubo de vidro transparente e congele o tubo em nitrogênio líquido até que esteja completamente congelado. Mova o tubo congelado para um recipiente Dewar transparente (ver Tabela de Materiais) pré-preenchido com nitrogênio líquido.
    NOTA: O diâmetro interno do tubo de vidro é de 3 mm neste protocolo. Tubos de vidro fino foram utilizados para minimizar a reabsorção da emissão de comprimento de onda curta na amostra.
  3. Escolha os comprimentos de onda de excitação para ficoerythrina e ficocyanina de 550 nm e 580 nm, respectivamente.
    NOTA: As emissões de fluorescência foram registradas de 560-800 nm (para excitação de 550 nm) ou 600-800 nm (para excitação de 580 nm).

5. Análise SDS-PAGE do PBS

  1. O buffer troca as amostras concentradas de PBS em 0,75 M de fosfato K com 50 mM de tampão Tris (pH 8.0) em unidades de filtro centrífugo de membrana (corte de peso molecular de 3K, ver Tabela de Materiais).
  2. Misture 50 μL de solução PBS com 10 μL de tampão de carregamento SDS 6x [300 mM Tris pH 6.8, 12% (p/v) Sulfato de dodecil de sódio, 0,06% (w/v) azul bromfenol, 50% (v/v) Glicerol, 6% (v/v) β-Mercaptoethanol] (ver Tabela de Materiais) em um tubo de microcentrifusagem e incubar a 95 °C por 10 minutos em um bloco de calor.
  3. Separe as amostras de proteínas por SDS-PAGE (8%-20% (w/v) gel de poliacrilamida) e continue com a coloração de zinco e Coomassie. O procedimento detalhado foi descrito em Reference8.
  4. Para coloração de zinco, incubar o gel em solução ZnSO4 de 50 mM por 10 min a temperatura ambiente, lavar o gel com água destilada e visualizar fluorescência induzida por zinco sob irradiação UV (312 nm).
  5. Para a coloração azul Coomassie, incubar o gel em coomassie blue tampão de coloração [0,25% (w/v) de Coomassie R-250, 10% (v/v) de ácido acético, 50% (v/v) de Metanol, ver Tabela de Materiais] por 1 h à temperatura ambiente. Lave o gel com água destilada duas vezes para remover o tampão de coloração residual e incubar o gel com tampão de desestabilização [10% (v/v) ácido acético, 30% (v/v) metanol] em um agitador de balanço (40 rpm) à temperatura ambiente durante a noite. Visualize o gel totalmente detido com uma câmera digital ou um scanner.

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Resultados

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As células Syn6803 e JSC-1 foram cultivadas em frascos cônicos com agitação constante em meio B-HEPES a 30 °C, sob uma luz branca led (50 fótons de μmol m-2s-1) em uma câmara de crescimento preenchida com 1% (v/v) CO2. Na fase de crescimento exponencial (OD750 = ~0,5), as células foram subculturadas em meio fresco com densidade óptica final OD750 = ~0,2. Após atingir a fase de crescimento exponencial tardio (OD750 = 0,6-0,8), as culturas foram coletadas e ...

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Discussão

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Este protocolo descreve um método simples e padrão para isolar PBS intacto em dois tipos de cianobactérias, modelo unicelular Syn6803 e não-modelo filamentous JSC-1. As etapas críticas do protocolo são a homogeneização celular e a ultracentrifugação em um gradiente de densidade descontínua de sacarose. Geralmente, a interrupção das células filamentosas é mais complicada do que as unicelulares. O aumento da quantidade do material inicial (o peso úmido da pelota celular) e a repetição da batida de contas foram úteis para a...

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Divulgações

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Os autores declaram não haver interesse concorrente.

Agradecimentos

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Os autores agradecem à Technology Commons, College of Life Science, National Taiwan University pelo uso conveniente da ultracentrifuge. As cepas cianobacterianas Synechocystis sp. PCC 6803 e Leptolyngbya sp. JSC-1 foram doadas pelo Dr. Chu, Hsiu-An na Academia Sinica, Taiwan, e pelo Dr. Donald A. Bryant da Universidade Estadual da Pensilvânia, EUA, respectivamente. Este trabalho foi financiado pelo Ministério da Ciência e Tecnologia (Taiwan) (109-2636-B-002-013- e 110-2628-B-002-065-) e pelo Programa Acadêmico Jovem do Ministério da Educação (Taiwan) Yushan Young Scholar (109V1102 e 110V1102).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Contas de vidro de 0,1 mmBioSpec11079101para extração PBS
Tubo de centrifugação de 13 mLUltracentrifugaçãoHitachi13PA
Tubo de centrifugação de 40 mLUltracentrifugaçãoHitachi40PA
Ácido acéticoMerck8.1875.2500para coloração azul de Coomassie
MeioB-HEPESUm meio cianobacteriano modificado do meio BG-11
Azul brilhante R-250SigmaB-0149para coloração azul de Coomassie
Azul de bromofenolWako indústrias químicas puras2-291tampão de carga de proteínas
Balança eletrônicaRadwagWLC 2/A2/C/2para a medição do peso úmido de pellets de células
Espectrofotômetro de fluorescênciaHitachiF-7000Espectrofotômetro
GlicerolBioShopGly001.500tampão de carga de proteínas
Centrífuga refrigerada de alta velocidadeHitachiCR22Npara troca de tampão
Leptolyngbya sp. JSC-1do Dr. Donald A. Bryant na Universidade Estadual da Pensilvânia, EUA.
Acessório de medição de baixa temperaturaHitachi5J0-0112O acessório inclui um recipiente Dewar transparente para espectroscopia de fluorescência de 77K.
MetanolMerck1.07018,2511para microcentrífuga de coloração Coomassie Blue
Thermo FisherPico 21para extração PBS
Mini-Beadbeater-16BioSpec Modelo 607para extração PBS
Fosfato de potássio dibásicoPanReac AppliChem121512.121para extração PBS
Fosfato de potássio monobásicoPanReac AppliChem141509.121para extração de PBS
Frasco com tampa de roscaBioSpec10832para extração de PBS
SmartView Pro ImagerMajor ScienceUVCI-2300para detecção de sinal de coloração Znic
Dodecil sulfato de sódioZymesetBSD101tampão de carregamento de proteína
SacaroseZymesetBSU101para isolamento
de PBSSynechocystis sp. Cepa tolerante à glicose PCC 6803do Dr. Chu, Hsiu-An na Academia Sinica, Taiwan
TrisBioShopTRS 011.1tampão de carregamento de proteínas
Triton X-100BioShopTRX 506.500para extração de PBS
Filtro centrífugo de membrana Ultra 10 KMilliporeUFC901024para troca
de tampãoFiltro centrífugo de membrana Ultra 3 KMilliporeUFC500324para troca de tampão
UltracentrífugaHitachiCP80WXultracentrifugação
Espectrofotômetro UV/VisAgilentCary 60Sulfato
zincoPanReac AppliChem131787.121para coloração Znic
β-MercaptoetanolBioBasicTampão de carga de proteínaMB0338
de

Referências

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