Isolamento e Caracterização de Ficobilisome intacto em cianobactérias

Resumo

O protocolo atual detalha o isolamento de ficobilísomees de cianobactérias por centrifugação através de um gradiente de densidade de sacarose descontínua. As frações de ficobilismos intactos são confirmadas pelo espectro de emissão fluorescente de 77K e pela análise de SDS-PAGE. As frações ficobilínicas resultantes são adequadas para coloração negativa da TEM e análise de espectrometria de massa.

Resumo

Em cianobactérias, o ficobiliso é um complexo proteico de antena vital que colhe luz e transfere energia para fotossistema I e II para fotoquímica. Estudar a estrutura e a composição do ficobilisome é de grande interesse para os cientistas porque revela a evolução e divergência da fotossíntese nas cianobactérias. Este protocolo fornece um método detalhado e otimizado para quebrar células cianobacterianas a baixo custo por um batedor de contas de forma eficiente. O ficobiliso intacto pode então ser isolado do extrato celular por ultracentrifugação gradiente de sacarose. Este método demonstrou ser adequado tanto para cianobactérias modelo quanto não modelo com diferentes tipos de células. Um procedimento passo a passo também é fornecido para confirmar a integridade e propriedade de ficobiliproteínas por espectroscopia de fluorescência de 77K e SDS-PAGE manchada por sulfato de zinco e Coomassie Blue. O ficobiliso isolado também pode ser submetido a novas análises estruturais e composicionais. No geral, este protocolo fornece um guia de partida útil que permite aos pesquisadores não familiarizados com cianobactérias isolar e caracterizar ficobilisma intacta.

Introdução

Ficobilisome (PBS) é um enorme complexo de proteína pigmento solúvel em água que se liga ao lado citoplasmático dos fotossistemas nas membranas thylakoidas de cianobactérias1. A PBS é composta principalmente de ficobiliproteínas coloridas e proteínas de linker ^incolor1,2. As ficobiliproteínas podem ser divididas em quatro grandes grupos: ficoerthrina, ficoerytrocyanina, ficocitanina e ^{alofilianina3}. Os quatro principais grupos absorvem diferentes comprimentos de onda de energia leve na faixa de 490-650 nm, que clorofilas absorviam ineficientemente3.

Protocolo

O Synechocystis sp. PCC 6803, o modelo de cepa tolerante à glicose, foi obtido do Dr. Chu, Hsiu-An na Academia Sinica, Taiwan. Leptolyngbya sp. JSC-1, o não-modelo filamentous, foi obtido do Dr. Donald A. Bryant na Universidade Estadual da Pensilvânia, EUA.

1. Cultura celular e colheita

1. Inoculação Células Syn6803 ou JSC-1 usando um laço de inoculação metálica em um frasco cônico de 100 mL contendo 50 mL de B-HEPES ^médio28. Cultume as células a 30 °C sob 50 μmol fótons ^{m-2 s-1} (LED de luz branca) em 1% (v/v) _CO2 com agitação constante por um....

Resultados

As células Syn6803 e JSC-1 foram cultivadas em frascos cônicos com agitação constante em meio B-HEPES a 30 °C, sob uma luz branca led (50 fótons de μmol ^m-2s-1) em uma câmara de crescimento preenchida com 1% (v/v) _CO2. Na fase de crescimento exponencial (_OD750 = ~0,5), as células foram subculturadas em meio fresco com densidade óptica final _OD750 = ~0,2. Após atingir a fase de crescimento exponencial tardio (_OD750 = 0,6-0,8), as culturas foram coletadas e .......

Discussão

Este protocolo descreve um método simples e padrão para isolar PBS intacto em dois tipos de cianobactérias, modelo unicelular Syn6803 e não-modelo filamentous JSC-1. As etapas críticas do protocolo são a homogeneização celular e a ultracentrifugação em um gradiente de densidade descontínua de sacarose. Geralmente, a interrupção das células filamentosas é mais complicada do que as unicelulares. O aumento da quantidade do material inicial (o peso úmido da pelota celular) e a repetição da batida de contas foram úteis para a.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Contas de vidro de 0,1 mm	BioSpec	11079101	para extração PBS
Tubo de centrifugação de 13 mL	Ultracentrifugação	Hitachi	13PA
Tubo de centrifugação de 40 mL	Ultracentrifugação	Hitachi	40PA
Ácido acético	Merck	8.1875.2500	para coloração azul de Coomassie
Meio			B-HEPESUm meio cianobacteriano modificado do meio BG-11
Azul brilhante R-250	Sigma	B-0149	para coloração azul de Coomassie
Azul de bromofenol	Wako indústrias químicas puras	2-291	tampão de carga de proteínas
Balança eletrônica	Radwag	WLC 2/A2/C/2	para a medição do peso úmido de pellets de células
Espectrofotômetro de fluorescência	Hitachi	F-7000	Espectrofotômetro
Glicerol	BioShop	Gly001.500	tampão de carga de proteínas
Centrífuga refrigerada de alta velocidade	Hitachi	CR22N	para troca de tampão
Leptolyngbya sp. JSC-1			do Dr. Donald A. Bryant na Universidade Estadual da Pensilvânia, EUA.
Acessório de medição de baixa temperatura	Hitachi	5J0-0112	O acessório inclui um recipiente Dewar transparente para espectroscopia de fluorescência de 77K.
Metanol	Merck	1.07018,2511	para microcentrífuga de coloração Coomassie Blue
	Thermo Fisher	Pico 21	para extração PBS
Mini-Beadbeater-16		BioSpec Modelo 607	para extração PBS
Fosfato de potássio dibásico	PanReac AppliChem	121512.121	para extração PBS
Fosfato de potássio monobásico	PanReac AppliChem	141509.121	para extração de PBS
Frasco com tampa de rosca	BioSpec	10832	para extração de PBS
SmartView Pro Imager	Major Science	UVCI-2300	para detecção de sinal de coloração Znic
Dodecil sulfato de sódio	Zymeset	BSD101	tampão de carregamento de proteína
Sacarose	Zymeset	BSU101	para isolamento
de PBSSynechocystis sp. Cepa tolerante à glicose PCC 6803			do Dr. Chu, Hsiu-An na Academia Sinica, Taiwan
Tris	BioShop	TRS 011.1	tampão de carregamento de proteínas
Triton X-100	BioShop	TRX 506.500	para extração de PBS
Filtro centrífugo de membrana Ultra 10 K	Millipore	UFC901024	para troca
de tampãoFiltro centrífugo de membrana Ultra 3 K	Millipore	UFC500324	para troca de tampão
Ultracentrífuga	Hitachi	CP80WX	ultracentrifugação
Espectrofotômetro UV/Vis	Agilent	Cary 60	Sulfato
zinco	PanReac AppliChem	131787.121	para coloração Znic
β-Mercaptoetanol	BioBasic	Tampão de carga de proteína	MB0338