Summary
Ce protocole décrit les méthodes de sous-culture et de cryoconservation des organoïdes de l’adénocarcinome de l’œsophage avec et sans digestion unicellulaire pour permettre aux chercheurs de choisir des stratégies appropriées en fonction de leur conception expérimentale.
Abstract
Le manque de modèles de recherche translationnelle appropriés reflétant la maladie primaire pour explorer la tumorigenèse et les stratégies thérapeutiques est un obstacle majeur dans l’adénocarcinome de l’œsophage (CAE). Les organoïdes dérivés du patient (AOP) sont récemment apparus comme un modèle préclinique remarquable dans une variété de cancers. Cependant, il existe encore peu de protocoles disponibles pour le développement des AOP EAC. Une fois les AOP établies, la propagation et la cryoconservation sont essentielles pour d’autres analyses en aval. Ici, deux méthodes différentes ont été normalisées pour la sous-culture et la cryoconservation des PDO EAC, c’est-à-dire avec et sans digestion unicellulaire. Les deux méthodes peuvent obtenir de manière fiable la viabilité cellulaire appropriée et sont applicables à une configuration expérimentale diversifiée. L’étude actuelle a démontré que la sous-culture des AOP EAC avec digestion unicellulaire convient à la plupart des expériences nécessitant un contrôle du nombre de cellules, une densité uniforme et une structure creuse qui facilite le suivi de la taille. Cependant, la méthode à base de cellules uniques montre une croissance plus lente en culture ainsi qu’après une nouvelle culture à partir de stocks congelés. En outre, la sous-culture avec digestion unicellulaire se caractérise par la formation de structures creuses avec un noyau creux. En revanche, le traitement des AOP EAC sans digestion unicellulaire est favorable à la cryoconservation, à l’expansion et à la caractérisation histologique. Dans ce protocole, les avantages et les inconvénients de la sous-culture et de la cryoconservation des AOP EAC avec et sans digestion unicellulaire sont décrits pour permettre aux chercheurs de choisir une méthode appropriée pour traiter et étudier leurs organoïdes.
Introduction
Le cancer de l’œsophage (EC) est la dixième cause de décès par cancer dans le monde1. L’adénocarcinome de l’œsophage (CAE) est l’un des principaux sous-types histologiques de la CE et survient principalement dans les pays occidentaux2. Au cours de la dernière décennie, l’incidence de la CAE a considérablement augmenté dans de nombreux pays développés, y compris en Allemagne3. En raison de l’agressivité du cancer et de l’absence de symptômes au stade précoce du développement de la tumeur, le pronostic global chez les patients atteints de CAE est mauvais, montrant un taux de survie à 5 ans d’environ 20%2,4,5.
Depuis la fin du XXe siècle, plusieurs modèles ont été établis pour la recherche biomédicale de l’EAC. Les lignées cellulaires EAC humaines classiques qui ont été établies dans les années 19906, étendent nos connaissances de la biologie tumorale EAC, de la génétique tumorale ainsi que des stratégies anti-tumorales, et sont couramment utilisées dans la recherche EAC. En outre, certains groupes de recherche ont développé avec succès des modèles animaux de l’EAC ou de l’œsophage de Barrett en exposant les animaux à des facteurs de risque connus tels que le reflux gastro-œsophagien par des approches chirurgicales ou inflammatoires 7,8,9. En outre, des modèles de xénogreffe dérivés du patient (PDX) qui greffent des tissus cancéreux primaires EAC par voie sous-cutanée ou orthotopique dans des souris immunodéficientes, ont été développés pour simuler le comportement biologique de la tumeur EAC humaine et l’environnement tumoral 10,11,12. Cependant, malgré l’amélioration des applications cliniques et notre compréhension des mécanismes moléculaires à l’origine de la tumorigenèse et de la progression de l’EAC, il reste un défi majeur à relever pour extrapoler les résultats de ces modèles de recherche à l’homme.
Les organoïdes tumoraux dérivés du patient (PDO) sont cultivés dans un système de culture 3D qui imite le développement humain et la régénération des organes in vitro. Générées à partir du tissu primaire des patients, les PDO récapitulent les caractéristiques moléculaires et phénotypiques de la tumeur humaine et ont montré des applications prometteuses dans le développement de médicaments et le traitement personnalisé du cancer13,14. En comparant dix cas de PDO EAC avec leur tissu tumoral apparié, les PDO EAC partageraient des caractéristiques histopathologiques et un paysage génomique similaires avec la tumeur primaire, conserveraient l’hétérogénéité intra-tumorale et faciliteraient un dépistage efficace des médicaments in vitro15. Les PDO EAC ont également été utilisés dans l’étude de l’interaction des cellules tumorales EAC avec les fibroblastes associés au cancer (CAF) dérivés du patient, indiquant une application puissante dans le domaine de la recherche sur le microenvironnement tumoral16. Malheureusement, il y a eu peu de protocoles disponibles pour développer et propager des AOP EAC. Ici, deux méthodes différentes sont décrites en détail pour la sous-culture et la préservation des AOP EAC: avec et sans digestion unicellulaire. Les méthodes normalisées de maintenance des AOP du CAE et de leurs applications peuvent aider les chercheurs à choisir des méthodes appropriées à différentes fins dans leur recherche sur les AOP du CAE.
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Protocol
Une culture d’AOP établie et en bonne croissance représente la base d’une sous-culture et d’une cryoconservation réussies décrites dans ce protocole. Ici, les PDO EAC ont été générés à partir du tissu tumoral primaire des patients EAC en utilisant le protocole décrit par Karakasheva T. A. et al17. Les tissus EAC ont été prélevés dans une biobanque sous l’approbation de BioMaSOTA (approuvé par le Comité d’éthique de l’Université de Cologne, ID: 13-091).
NOTE : Les AOP EAC ont été cultivés dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % de CO2 à l’aide d’un milieu de culture AOP (tableau 1). Dans les étapes suivantes, deux méthodes de la sous-culture sont décrites en détail. Une plaque de 12 puits est recommandée pour subculquer les PDO avec une densité d’ensemencement de trois dômes de gel à matrice extracellulaire (ECM) par puits, car elle permet une utilisation flexible de chaque puits et une quantité appropriée de PDO à des fins différentes. Une technique aseptique est obligatoire lors de la manipulation des PDO.
1. Préparatifs à l’avance
- Préchauffez une plaque de 12 puits en la plaçant dans un incubateur à CO2 à 37 °C pendant la nuit avant la sous-culture pour assurer un réchauffement complet de la plaque. Si disponible, utilisez des puits vides provenant d’une plaque avec la culture d’AOP actuelle.
REMARQUE: Le stockage continu de 1 à 2 assiettes fraîches à 37 ° C est recommandé pour une planification flexible de la sous-culture. - Prérefroidir des pointes de 1 000 μL et 200 μL avec un large orifice à -20 °C (stockage continu recommandé). Centrifugeuse pré-refroidie à 4 °C.
- Réglez la température de l’incubateur rotatif à 37 °C (si une digestion unicellulaire est effectuée).
- Incuber un volume approprié de gel ECM pendant 1 h sur de la glace pour la liquéfier. Placez la solution de récupération cellulaire sur la glace.
2. Prélèvement d’organoïdes
- Retirez la plaque contenant des PDO en croissance de l’incubateur à CO2.
- Aspirer un vieux milieu à l’aide d’une pompe à vide.
REMARQUE: Évitez de toucher les dômes. - Ajouter un volume approprié de solution de récupération de cellules glacées (500 μL/dôme) dans le puits.
- Désintégrez le gel ECM en pipetant plusieurs fois pour fragmenter les dômes de gel ECM en petits morceaux à l’aide de pointes de 1 000 μL avec un large orifice.
- Combinez le mélange d’AOP, de gel ECM et de solution de récupération cellulaire à partir d’un maximum de deux puits (six dômes) et transférez-le dans un tube à faible liaison de 5 mL (utilisez un deuxième tube au cas où d’autres puits seraient utilisés pour la sous-culture).
REMARQUE: Éventuellement, si le gel ECM n’a pas été complètement dissous, ajouter 1,5 mL supplémentaire de solution de récupération cellulaire au mélange d’AOP, de gel ECM et de solution de récupération cellulaire. - Incuber le tube contenant le mélange à l’étape 2.5 sur de la glace pendant 20 min, mélanger toutes les 5 min en inversant le tube cinq fois pour assurer la liquéfaction du gel ECM.
- Centrifuger à 500 x g pendant 4 min à 4°C.
- S’il y a une pastille visible et stable après centrifugation, passez à l’étape 2.10. Sinon, passez à l’étape 2.9.
- S’il n’y a pas de pastille visible et que les PDO semblent toujours coincés dans une phase de gel, retirez soigneusement le surnageant avec une pompe à vide jusqu’à ce que la phase contenant ecM gel-PDO-Solution soit atteinte et ajoutez 3 mL de solution de récupération de cellules glacées.
- Inverser le tube plusieurs fois et incuber sur de la glace pendant encore 10 minutes. Mélanger en inversant le tube de temps en temps.
- Centrifuger à 500 x g pendant 4 min à 4 °C et continuer avec l’étape 2.10.
- Jetez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pompe à vide ou d’une pipette de 1 000 μL. Essayez d’enlever le surnageant autant que possible.
REMARQUE: En raison de la faible surface de liaison du tube, la pastille ne sera pas aussi stable que d’habitude. - Conservez la pastille d’AOP sur de la glace et passez à l’étape 3 (sans digestion) ou à l’étape 4 (avec digestion unicellulaire) selon les différents objectifs.
3. Subculturation sans digestion
NOTE: Cette méthode vise à augmenter la taille et la densité des PDO. La plus grande taille et la densité plus élevée facilitent le processus d’intégration, la caractérisation histologique et l’expansion de l’AOP. En fonction des rapports de répartition de l’AOP (en fonction de la densité des AOP, un rapport entre 1:3 et 1:6 est recommandé), remettez en suspension la pastille de l’étape 2.8 dans un volume approprié de gel ECM liquide.
- Retirez les pointes pré-refroidies de 200 μL et 1 000 μL avec un large orifice du congélateur à -20 °C et placez-les sur un banc propre.
- Remettez en suspension la pastille de l’étape 2.11 dans un gel ECM à l’aide d’embouts pré-refroidis de 1 000 μL. Mélangez en pipetant de haut en bas environ 10 fois pour vous assurer que les PDO ne s’agglutinent pas et sont répartis uniformément dans le gel ECM.
REMARQUE: Utilisez un gel / dôme ECM de 50 μL. Calculez toujours pour un dôme de plus que nécessaire (p. ex., pour neuf dômes (c.-à-d. trois puits), remettez en suspension la pastille dans 500 μL de gel ECM liquide (450 + 50 μL supplémentaires). Essayez d’éviter de produire des bulles lors de la remise en suspension! - Retirez la plaque préchauffée de 12 puits de l’incubateur juste avant d’ensemencer les dômes.
- Dômes de graines contenant 50 μL de gel ECM dans la plaque chaude (trois dômes / puits). Évitez de pipeter des bulles dans les dômes de gel ECM.
- Remettre la plaque dans l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO2et incuber pendant 20 à 30 min pour solidifier le gel ECM.
- Ajouter soigneusement le milieu AOP préchauffé (tableau 1) sans déranger les dômes.
- Cultivez les AOP pendant 7 à 14 jours jusqu’à ce que la densité et la morphologie requises se produisent.
4. Subculturation avec digestion unicellulaire
REMARQUE: Les étapes suivantes visent à augmenter le nombre de PDO par dôme. La digestion unicellulaire facilite le contrôle du nombre de cellules et l’expansion de l’AOP.
- Préparer le milieu de digestion en mélangeant 2 mL de 0,25 % de trypsine-EDTA et 20 μL de DNase I (pour la digestion de trois dômes).
- Remettre en suspension la pastille de l’étape 2.11 avec un volume approprié de trypsine-EDTA + DNase I préchauffée à 0,25 % et mélanger environ 10 fois en pipetant de haut en bas à l’aide d’une pipette de 1 000 μL (utilisez des embouts normaux de 1 000 μL).
- Incuber pendant 10 min à 37 °C dans un incubateur rotatif avec une vitesse de rotation d’au moins 28 tr/min.
- Préparer un tube de 15 mL contenant 6 mL d’inhibiteur de la trypsine de soja (IST, tableau 2) (par 2 mL de trypsine-EDTA à 0,25 %).
- Après la digestion, mélangez soigneusement les PDO digérés plusieurs fois avec une pipette de 1 000 μL pour perturber les PDO.
- Transférer les AOP digérés dans le tube de 15 mL contenant une solution d’ITS pour arrêter le processus de digestion.
- Centrifuger à 500 x g pendant 4 min à 4 °C. Jetez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pompe à vide ou d’une pipette de 1 000 μL. Remettre en suspension la pastille dans 1 mL de milieu basal (tableau 3).
- Déterminer la concentration et la viabilité des cellules à l’aide d’un compteur cellulaire automatisé ou d’un hémocytomètre.
- Graines digérées AOP dans une plaque de 12 puits avec 2 x 104 cellules par dôme.
- Calculez le nombre de cellules en fonction des dômes prévus pour l’ensemencement et transférez-les dans un tube frais de 1,5 mL à faible liaison.
REMARQUE: Calculez pour un dôme de plus (+ 2 x 104 cellules supplémentaires). Par exemple, pour ensemencer trois dômes dans un puits, prenez 8 x 104 (2 x 104 * 3 + 2 x 104 extra) cellules. - Centrifuger à 500 x g pendant 4 min à 4 °C.
- Dans le cas où il n’y a pas de pastille visible, rappelez-vous l’orientation du tube à l’intérieur de la centrifugeuse pour savoir où se trouve la pastille.
- Jetez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette de 1 000 μL. Retirez le surnageant autant que possible sans déranger la pastille.
- Ajouter un volume approprié de gel ECM à la pastille à l’aide d’une pipette de 1 000 μL avec une pointe d’orifice de 1 000 μL de large pré-refroidie (50 μL / dôme + 50 μL supplémentaires).
- Suivez les étapes 3.3 à 3.7.
- Calculez le nombre de cellules en fonction des dômes prévus pour l’ensemencement et transférez-les dans un tube frais de 1,5 mL à faible liaison.
5. Cryoconservation des AOP digérés et non digérés
REMARQUE: Les AOP digérés et non digérés à cellule unique conviennent à la préparation de stocks de sauvegarde congelés. Notez que les AOP recultivés à partir des stocks congelés unicellulaires nécessitent plus de temps pour se rétablir et atteindre une certaine taille.
- Cryoconservation des PDO non digérés.
- Commencez le processus de cryoconservation avec la pastille à partir de l’étape 2.8. Utilisez 500 μL de milieu de congélation à froid pour remettre en suspension la pastille et la transférer dans un flacon cryogénique.
REMARQUE: Conservez deux dômes par flacon. - Congeler les AOP pendant la nuit dans un congélateur à -80 °C à l’aide d’un récipient de congélation de cellules approprié.
- Commencez le processus de cryoconservation avec la pastille à partir de l’étape 2.8. Utilisez 500 μL de milieu de congélation à froid pour remettre en suspension la pastille et la transférer dans un flacon cryogénique.
- Cryoconservation des PDO digérés à cellule unique
- Après la récolte et la digestion des AOP, commencez la cryoconservation à partir de l’étape 4.8.
- Pour stocker un flacon cryogénique, transférer 4-5 x 105 cellules dans un tube frais de 1,5 mL à faible liaison.
REMARQUE: Conservez trois dômes / flacons. - Centrifuger à 500 x g pendant 4 min à 4 °C. Jetez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette de 1 000 μL. Retirez le surnageant autant que possible sans déranger la pastille.
- Remettre la pastille dans un volume approprié de milieu de congélation (500 μL/flacon) et la transférer dans un flacon cryogénique.
- Congeler les AOP pendant la nuit dans un congélateur à -80 °C à l’aide d’un récipient de congélation cellulaire approprié et les transférer dans un congélateur à -150 °C ou de l’azote liquide pour un stockage à long terme.
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Representative Results
Ce protocole présente les procédures, y compris la sous-culture et la cryoconservation des AOP EAC avec et sans digestion unicellulaire.
La figure 1 montre des images représentatives de contraste de phase des deux stratégies de sous-culture différentes. Les AOP du CAE ont atteint une densité appropriée pour la sous-culture (figure 1, à gauche). La sous-culture sans digestion unicellulaire prend moins de temps pour atteindre une densité comparable et conduit principalement à des structures compactes (Figure 1, rangée du haut). En revanche, les PDO digérés à cellule unique montrent des structures creuses avec un noyau creux (Figure 1, rangée du bas). La figure 2 montre la coloration à l’hématoxyline-éosine (H & E) et la coloration immunohistochimique (IHC) des AOP EAC incorporés à la paraffine avec des structures compactes et creuses. La pan-cytokératine (Pan-CK) permet l’identification des cellules tumorales épithéliales18. La cytokératine 7 (CK7) met en évidence les cellules tumorales différenciées glandulaires19. La structure compacte (rangée du haut) existe principalement dans la culture non digérée, tandis que la structure creuse (rangée du bas) est dominante dans la culture qui a subi une digestion unicellulaire.
La figure 3 montre la coloration par immunofluorescence (IHC) des tissus EAC appariés et des PDO à structure compacte et à structure creuse. Le Ki67 met en évidence les populations cellulaires à prolifération cellulaire plus élevée20. Le Ki67 (rouge) et le Pan-CK (vert) ont été répartis de la même manière entre le tissu primaire EAC, la structure compacte EAC PDO et la structure creuse EAC PDO. La figure 4 montre les caractéristiques morphologiques des AOP EAC le premier jour de récupération à partir de stocks congelés avec cryoconservation à base de cellules uniques (à gauche) et cryoconservation à base d’AOP non digérée (à droite).
La figure 5 résume un organigramme du processus de sous-culture des AOP EAC avec et sans digestion unicellulaire. En bref, une AOP EAC en bonne croissance est prête à être adoptée. Les AOP de l’EAC ont été récoltés et granulés. Pour la digestion unicellulaire, les PDO ont été digérés enzymatiquement pendant 5 à 10 minutes pour obtenir des cellules uniques, qui étaient susceptibles de se développer en structures creuses qui facilitent les expériences nécessitant un contrôle du nombre de cellules, une densité uniforme et un suivi de la taille. Pour la sous-culture non digérée, les PDO ont été divisés pour gagner plus d’espace de croissance sans perturbation enzymatique, qui étaient susceptibles de se développer en structures compactes qui facilitent les analyses histologiques, l’expansion rapide et la récupération plus rapide de la cryoconservation.
Figure 1 : Caractéristiques morphologiques de la sous-culture des AOP EAC avec et sans digestion unicellulaire au microscope à contraste de phase. Les AOP EAC atteignent une certaine densité avant la sous-culture (à gauche). Lors de la sous-culture des AOP EAC sans digestion unicellulaire, les PDO passent progressivement de structures creuses à des structures compactes (droite, rangée supérieure), tandis que les PDO cultivées à partir de cellules individuelles présentent principalement des structures creuses (droite, rangée inférieure). Les photos ont été prises avec un microscope à lumière inversée à l’aide d’un objectif 5x. Barre d’échelle : 100 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Caractéristiques histologiques de la structure compacte et de la structure creuse des AOP de l’EAC. La coloration H&E (à gauche), la coloration Pan-CK (au milieu) et la coloration CK7 (à droite) de la structure compacte (rangée du haut) et de la structure creuse (rangée du bas). Les photos ont été prises au microscope à lumière inversée à l’aide d’un objectif 20x. Barre d’échelle : 50 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Coloration immunohistochimique des tissus EAC appariés et des PDO. La coloration par immunofluorescence (FI) du tissu EAC apparié (rangée du haut), de la structure compacte (rangée du milieu) et de la structure creuse (rangée du bas) avec Pan-CK (vert), Ki67 (rouge) et DAPI (bleu). Les photos ont été prises avec un microscope à fluorescence automatisé inversé à l’aide d’un objectif 20x. Barre d’échelle : 50 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Caractéristiques morphologiques des AOP de la CAE le premier jour de la reconstitution à partir de stocks congelés. Images à contraste de phase de la remise en culture à partir de la cryoconservation à base d’une seule cellule (à gauche) et de la cryoconservation à base d’AOP non digérée (à droite) le premier jour de la récupération. Les photos ont été prises avec un microscope à lumière inversée à l’aide d’un objectif 5x. Barre d’échelle : 100 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.
Figure 5: Organigramme du processus de sous-culture des AOP EAC avec et sans digestion unicellulaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Stock | Concentration finale | 50 mL | |||
| Milieu basal (voir tableau 3) | 24 mL | ||||
| Milieu conditionné Wnt-3A | 12 mL | ||||
| Milieu conditionné R-Spondin1 à partir de cellules Cultrex R-Spondin | 12 mL | ||||
| N-2 | 100x | 1x | 500 μL | ||
| B-27 | 50x | 1x | 1 mL | ||
| N-acétylcystéine | 0,5 M | 1 mM | 100 μL | ||
| CHIR-99021 | 5 mM | 0,5 μM | 5 μL | ||
| Facteur de croissance épidermique humain recombinant (EGF) | 100 μg/mL | 250 ng/mL | 125 μL | ||
| A83-01 | 25 mM | 0,5 μM | 1 μL | ||
| SB202190 | 10 mM | 1 μM | 5 μL | ||
| Gastrine | 100 μM | 0,1 μM | 50 μL | ||
| Nicotinamide | 1 M | 20 μM | 1 mL | ||
| Gentamicine | 50 mg/mL | 10 μM | 5 μL | ||
| Pénicilline/streptomycine | 100x | 1x | 500 μL | ||
| Amphotéricine B | 250 μg/mL | 0.60% | 300 μL | ||
| Ajouter fraîchement dans bien: | |||||
| Noggin | 100 μg/mL | 50 μL | |||
| Y-27632 | 10,5 mM | 50 μL | |||
| Ajouter lors de l’établissement de nouvelles AOP à partir de tissus primaires ou de la récupération à partir de stocks congelés | |||||
| FGF-10a | 100 μg/mL | 100 ng/mL | 50 μL | ||
Tableau 1 : Préparation du milieu de culture AOP EAC.
| Inhibiteur de la trypsine de soja (IST) | 12,5 mg |
| Ajuster à 50 mL avec DPBS | |
| Filtrer à travers un filtre stérile de 0,2 μm |
Tableau 2 : Préparation de la solution d’inhibiteur de la trypsine (IST) de soja.
| Réactif | Volume | Concentration finale |
| DMEM/F-12 avancé | 48,2 mL | |
| HEPES (1 M) | 500 μL | 10 mM |
| L-Glutamine (100X) | 500 μL | 1X |
| Pénicilline-streptomycine (100X) | 500 μL | 1X |
| Amphotéricine B | 300 μL | 0.60% |
| Gentamicine (50 mg/mL) | 5 μL | 5 μg/mL |
Tableau 3 : Préparation du milieu basal.
| Digestion unicellulaire | |
| Avantages | Contre |
| Contrôle du numéro de cellule | Fragile lors de l’intégration |
| Contrôle de viabilité | Temps plus long nécessaire entre les passages |
| Applicable par exemple pour le dépistage de drogues, la cytométrie en flux | Temps de reconstitution plus long des stocks congelés |
| Sans digestion unicellulaire | |
| Avantages | Contre |
| La morphologie est bénéfique pour les analyses histologiques | Expansion des PDO plus en taille qu’en nombre |
| Stabilité accrue dans le processus d’intégration | Ne s’applique pas aux analyses où la suspension d’une seule cellule est obligatoire |
| Reprise rapide des stocks congelés | Manque de contrôle du nombre de cellules et de suivi de la taille |
Tableau 4 : Avantages et inconvénients de la sous-culture des AOP EAC avec et sans digestion unicellulaire.
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Discussion
Dans ce protocole, deux méthodes différentes de sous-culture et de cryoconservation des AOP EAC sont décrites, c’est-à-dire avec et sans digestion unicellulaire. Plusieurs études ont recommandé de passer les PDO EAC avec une digestion unicellulaire15,17, ce qui est bénéfique pour la plupart des expériences qui nécessitent un contrôle du nombre de cellules, une densité uniforme et une structure creuse qui facilite le suivi de la taille. Cependant, la méthode à base de cellules uniques se caractérise par une croissance plus lente après la remise en culture à partir de stocks congelés et une morphologie moins compacte pendant la période de culture. L’expérience indique 2 à 3 semaines pour la remise en culture à base d’une seule cellule afin d’atteindre la densité applicable au processus de sous-culture. En revanche, les AOP EAC congelés sans digestion unicellulaire peuvent atteindre la même taille dans une période plus courte (environ 1 semaine) après la remise en culture. L’une des raisons pourrait être le stress supplémentaire de la digestion de la trypsine pendant une période relativement longue (10 min). Par conséquent, il est recommandé de conserver les AOP EAC non digérés dans un rapport de 1:1,5 (congélation de deux dômes de PDO EAC non digérés et réensemencement en trois dômes pour la remise en culture). En outre, l’utilisation de PDO EAC non digérés est recommandée pour une expansion rapide et une caractérisation histologique par coloration IHC ou IF en raison de la structure compacte. Les avantages et les inconvénients des deux méthodes de sous-culture sont résumés dans le tableau 4.
Plusieurs étapes critiques nécessitent une attention particulière dans ce protocole. Tout d’abord, les plaques de culture AOP doivent être préchauffées pendant la nuit dans un incubateur à 37 °C pour assurer le processus de solidification des dômes de gel ECM fraîchement ensemencés. Il est recommandé d’utiliser une plaque chauffante pour maintenir la plaque à 37 °C tout en traitant une durée d’ensemencement prolongée. Deuxièmement, des tubes à faible liaison sont nécessaires pendant le processus de sous-culture pour éviter une perte importante d’AOP. Pour éviter la perte de gel ECM, les embouts avec une large ouverture d’alésage peuvent être pré-refroidis dans le congélateur à -20 ° C avant utilisation. Ici, la large ouverture des pointes évite d’endommager les structures AOP lors de l’étape de récolte. Ensuite, il est recommandé d’incuber les PDO pendant 20 minutes sur de la glace avant la première étape de centrifugation, afin d’assurer une liquéfaction complète du gel ECM. Notez que la centrifugeuse doit être réglée à 4 °C pendant les étapes de centrifugation pour maintenir le gel ECM résiduel à l’état liquide. De plus, pour la méthode unicellulaire, il est recommandé de bien mélanger les PDO après l’incubation de la trypsine en utilisant une pointe normale de 1 000 μL pour briser les amas cellulaires avant d’ajouter l’IST, plutôt que de filtrer directement la suspension cellulaire avec des passoires cellulaires, pour éviter la perte cellulaire.
Certaines modifications peuvent être apportées à ce protocole. La solution de récupération cellulaire peut être remplacée par du DPBS glacé pour dissoudre le gel ECM à l’étape de la récolte. Cependant, les expériences ont montré une meilleure capacité à dissoudre le gel ECM en utilisant la solution de récupération cellulaire. Par conséquent, le DPBS glacé est plutôt recommandé uniquement comme méthode de sauvegarde alternative. Si le laboratoire n’est pas équipé d’un incubateur rotatif, les AOP EAC peuvent être incubés avec de la trypsine dans un bain-marie à 37 ° C avec mélange en inversant le tube toutes les 2-3 min. 10% de DMSO avec du sérum fœtal bovin (FBS) peut être utilisé comme alternative au milieu de congélation pour préparer des stocks d’AOP congelés. Cependant, un milieu de congélation commercial avec moins ou pas de sérum est préféré en raison d’une meilleure récupération de l’AOP.
Certaines limites doivent être abordées dans ce protocole. Étant donné que ces méthodes n’ont été testées que dans les AOP du CAE, l’application de ce protocole à d’autres types d’AOP n’est pas claire. Bien que les procédures de passage des AOP avec et sans digestion unicellulaire soient normalisées pour la plupart des types d’organoïdes21,22, il est toujours nécessaire d’essayer les protocoles actuels sur d’autres types de cancer pour assurer la reproductibilité. De plus, une incubation de 10 min 0,25% de trypsine peut stresser les cellules pendant la digestion; par conséquent, le temps d’incubation pourrait varier en fonction de l’état de l’AOP d’avant la sous-culture et de la diversité individuelle de l’AOP. Au cours des premières tentatives, il est suggéré de définir différents temps d’incubation de la trypsine pour chaque AOP EAC.
En conclusion, il s’agit du premier protocole décrivant et discutant de la sous-culture et de la cryoconservation des AOP EAC avec et sans digestion unicellulaire. La sous-culture des PDO EAC avec digestion unicellulaire est applicable pour les expériences de comparaison entre groupes, tandis que les PDO EAC non digérés sont bénéfiques pour la caractérisation histologique, la cryoconservation et l’expansion rapide. Ici, l’entretien de routine des AOP EAC est normalisé, fournissant un guide aux chercheurs pour choisir les méthodes appropriées pour la génération d’organoïdes EAC.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts dans cet ouvrage.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le Köln Fortune Program/Faculté de médecine de l’Université de Cologne. Nous remercions l’assistance technique de Susanne Neiss, Michaela Heitmann et Anke Wienand-Dorweiler. Ningbo Fan a été soutenu financièrement par le Guangzhou Elite Scholarship Council (GESC). Les auteurs remercient le Dr Joshua D’Rozario pour son aide dans l’édition linguistique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| -20°C Freezer | Bosch | Economic | |
| -80°C Freezer | Panasonic | MDF DU500VH-PE | |
| Automated Cell counter | Thermo Fisher | AMQAX1000 | Countess II |
| Biological Safety Cabinet Class II | Thermo Scientific | 51022482 | Herasafe KS12 |
| Centrifuge | Heraeus | 75003060 | Megafuge 1.0R |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50116048 | Heracell 150i |
| Inverted automated fluorescence microscope | Olympus | IX83 | |
| Inverted light microscope | Leica | DMIL LED Fluo | |
| Pipette 1000 µL | Eppendorf | 3123000063 | Research Plus |
| Pipette 200 µL | Eppendorf | 3123000039 | Research Plus |
| Rotating Incubator | Scientific Industries, sc. | SI-1200 | Enviro-genie |
| Shaker | Eppendorf | 5355 000.011 | Thermomixer Comfort |
| Vacuum pump | Vacuubrand | 20727200 | BVC control |
| Waterbath | Medingen | p2725 | W22 |
| Material | |||
| 15 mL tube | Sarstedt | 62.554.502 | Inc Screw cap tube PP 15 mL |
| Cryo vial 2 mL | Sarstedt | 72.379 | CryoPure 2.0 mL tube |
| Low bind tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.706.600 | Micro tube 1.5 mL protein LB |
| Low bind tube 5 mL | Eppendorf | 0030 108.302 | Protein LoBind Tube 5.0 mL |
| Pipette tip 200 µL | Starlab | E1011-8000 | 200 µL Graduated tip, wide orifice |
| Pipette tip 1000 µL | Starlab | E1011-9000 | 1000 µL Graduated tip, wide orifice |
| Pipette tip 1000 µL | Sarstedt | 70.3050 | Pipette tip 1000 µL |
| Sterile filter 0.2 µm | Sarstedt | 83.1826.001 | Filtropur 0.2 µm sterile filter |
| Tissue culture plate | Sarstedt | 83.3921 | 12 well-plate |
| Reagent/Chemical | |||
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| B-27 | Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| CHIR-99021 | MedChemExpress | HY-10182/CS-0181 | |
| DNase I grade II, from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
| Extracellular matrix (ECM) gel: Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | |
| FGF-10a | Peprotech | 100-26-100 | |
| Freezing medium: Recovery Cell Freezing Medium | Thermo Fisher Scientific | 12648010 | |
| Gastrin | Sigma | G9020 | |
| Gentamicin-25 (25 mg/ 500 µL) | PromoCell | C-36030 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| L-Glutamine 200 mM (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| N-2 | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100 | |
| Noggin | Peprotech | 120-10C-50 | |
| Penicillin-Streptomycin 10,000 U/ mL (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Recombinant human epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| R-Spondin1 conditioned medium from Cultrex R-Spondin Cells | Biotechne | 3710-001-01 | |
| SB202190 | MedChemExpress | 152121-30-7 | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich | 93620-1G | |
| Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Wnt-3A conditioned medium | Wnt-3A expressing cell line was kindly provided by Prof. Hans Clevers' group | ||
| Y-27632 | Sigma | Y0503 |
References
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