Métodos in vitro e in vivo para explorar a megacariopoiese

François Lanza; Christian Gachet; Anita Eckly

doi:10.3791/63286

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Métodos in vitro e in vivo para explorar a megacariopoiese

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DOI:

10.3791/63286

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17 de novembro de 2021

François Lanza¹ , Christian Gachet¹ , Anita Eckly¹

¹Université de Strasbourg, INSERM, EFS Grand Est, BPPS UMR-S 1255, FMTS, F-67065 Strasbourg, France

Neste artigo

Resumo

ARTIGOS DISCUTIDOS:

1. Pongerard, A., Mallo, L., Gachet, C., Lanza, F., Strassel, C. Células CD34+ derivadas de filtros de leucodepleção como fonte celular para estudar a diferenciação de megacariócitos e a formação de plaquetas. Jornal de Experimentos Visualizados: JoVE. (171), e62499 (2021).

2. Kimmerlin, Q., Tavian, M., Gachet, C., Lanza, F., Brouard, N. Isolamento de progenitores de megacariócitos de camundongos. Jornal de Experimentos Visualizados: JoVE. (171), e62498 (2021).

3. Boscher, J., Gachet, C., Lanza, F., Léon, C. Cultura de megacariócitos em hidrogel à base de metilcelulose 3D para melhorar a maturação celular e estudar o impacto da rigidez e confinamento. Jornal de Experimentos Visualizados: JoVE. (171), e62511 (2021).

4. Scandola, C., Lanza, F., Gachet, C., Eckly, A. Exploração in situ de megacariopoiese murina usando microscopia eletrônica de transmissão. Jornal de Experimentos Visualizados: JoVE. (171) E62494 (2021).

5. Guinard, I., Gachet, C., Lanza, F., Léon, C., Eckly, A. Dinâmica de formação de plaquetas de explantes de medula óssea fresca de camundongos. Jornal de Experimentos Visualizados: JoVE. (171), e62501 (2021).

6. Bornert, A., Pertuy, F., Gachet, C., Lanza, F., Léon, C. Imagem in vivo de dois fótons de megacariócitos e pró-plaquetas na medula óssea do crânio de camundongo. Jornal de Experimentos Visualizados: JoVE. (171), e62515 (2021)

Editorial

As plaquetas são pequenas células sanguíneas anucleadas, essenciais para a hemostasia, que derivam dos megacariócitos (MKs) na medula óssea (MO). Durante sua diferenciação das células-tronco hematopoiéticas, os MKs se desenvolvem em células gigantes em um complexo processo de diferenciação e maturação que inclui poliploidização e maturação citoplasmática. No estágio final de desenvolvimento, quando os MKs estão em contato com as células endoteliais, eles atingem seu estágio maduro e estendem longas extensões citoplasmáticas, chamadas pró-plaquetas, para os vasos sanguíneos, que então se fragmentam para dar origem a plaquetas na corrente sanguínea ^1,2. Os mecanismos que regulam a maturação do MK e a formação de plaquetas transendoteliais ainda não são completamente compreendidos. O objetivo desta coleção é reunir métodos complementares que contribuam para uma melhor compreensão da biologia dos MKs in vitro e in vivo.

A expansão e diferenciação in vitro de MKs é amplamente utilizada para estudar os mecanismos subjacentes à biogênese plaquetária. No protocolo de Pongerard et al., os autores descrevem um protocolo de cultura padronizado para a diferenciação de MKs de progenitores hematopoiéticos CD34⁺ humanos. Eles enfatizam especialmente que os filtros de leucócitos disponíveis nos hemocentros são uma fonte excepcional para a coleta de células CD34⁺. Seu artigo contém várias diretrizes essenciais sobre como extrair células CD34⁺, como avaliar sua pureza e a importância de sua densidade de semeadura. Os autores também propõem um método de pipetagem calibrado, cinco vezes seguidas, para liberar plaquetas funcionais com eficiência. Aplicações interessantes desse método são a possibilidade de avaliar compostos farmacológicos ou manipular geneticamente células CD34⁺ usando um método de edição do genoma CRISPR-Cas9 ^3,4. Para estudos com camundongos, Kimmerlin et al. apresentam uma estratégia de classificação de células para purificar progenitores MK em número suficiente compatível com ensaios moleculares e celulares. Os autores discutem os méritos de usar a crista ilíaca como fonte de medula óssea contendo um grande número de progenitores hematopoiéticos e de realizar uma depleção magnética em duas etapas de células indesejadas antes da classificação celular usando uma combinação de marcadores de superfície celular. Uma grande vantagem deste método é a redução do número de animais necessários para obter progenitores MK altamente purificados que, por exemplo, podem ser de interesse para pesquisadores que estudam a hierarquia dos progenitores hematopoiéticos e sua diferenciação. Nesse contexto, Boscher et al. descrevem um método para cultivar progenitores em meio 3D composto por 2% de metilcelulose para melhor imitar o ambiente in vivo. De fato, esses autores demonstraram anteriormente que os MKs cultivados em um hidrogel 3D atingem um maior estado de maturação e uma maior capacidade de formar progenitores em comparação com aqueles cultivados em meio líquido⁵. Etapas críticas são destacadas neste protocolo, como o volume apropriado de metilcelulose para obter a rigidez média ideal, o número de células que devem ser equivalentes em cada condição experimental e o risco de contaminação. Para verificação funcional do nível de maturação, os autores explicam como ressuspender as células cultivadas em gel em meio líquido no terceiro dia de cultivo e como fixar as células para análise futura por imunocoloração, citometria de fluxo ou microscopia eletrônica. A microscopia eletrônica de transmissão (TEM) é a abordagem de imagem de escolha para fornecer ultraestrutura de alta resolução de MKs. Aqui, Scandola et al. compartilham um protocolo para analisar a ultraestrutura dos MKs em seu ambiente natural de BM e quantificar sua densidade celular e pontuar os diferentes estágios de maturação. Os autores usam o MET para analisar os eventos celulares que ocorrem quando os MKs interagem com a parede sinusoidal, como suas protrusões curtas e invasivas semelhantes a podossomos que penetram no endotélio⁶. Uma limitação do método é que a fase inicial do envolvimento do MK não pode ser analisada devido à falta de características ultraestruturais específicas dessas células imaturas. Como observado, essa abordagem de imagem tem a vantagem de usar pequenas amostras de BM, permitindo realizar vários estudos com um único camundongo. Como exemplo, as outras amostras de medula óssea podem ser usadas para a técnica de explante de medula óssea que é apresentada nesta coleção por Guinard et al. para estudar a extensão dinâmica das proplaquetas de MKs. A força deste método reside no uso de MKs que se desenvolveram no MO, evitando assim qualquer potencial interpretação errônea resultante de artefatos de diferenciação celular em cultura. De fato, isso foi documentado anteriormente em camundongos com inativação de MYH9 restrita a MK, onde resultados divergentes foram encontrados in vitro e ex vivo⁷. Os autores também destacam a natureza simples, reprodutível e rápida dessa abordagem. Uma nota interessante de seu protocolo é a capacidade de usar microscópios equipados com software de navegação para facilitar o rastreamento / quantificação de MKs que estendem as plaquetas. Um método complementar do modelo de explante é a imagem de dois fótons de MKs no crânio de camundongos. A singularidade desta técnica é a capacidade de estudar in vivo o comportamento dinâmico de MKs marcados com fluorescência na medula óssea e visualizar a extensão das plaquetas. Este protocolo tem a vantagem de ser minimamente invasivo, com intervenções cirúrgicas limitadas, evitando assim reações inflamatórias que foram relatadas como impactando a formação de plaquetas. Como Bornert et al. observam, uma limitação desse método é a profundidade estreita que pode ser visualizada devido à densidade do osso, que também impõe o uso de camundongos mais jovens. Esta técnica pode ser aplicada a camundongos geneticamente modificados para estudar o papel de genes de interesse na formação de plaquetas in vivo. Por exemplo, os autores usaram essa técnica para demonstrar que o papel dos microtúbulos no alongamento das plaquetas difere entre as condições in vitro e in vivo ⁸.

O desenvolvimento anormal de MK e a produção de plaquetas podem levar a trombocitopenia ou trombocitemia, aumentando o risco de sangramento ou trombose, respectivamente. Esforços contínuos para dissecar os mecanismos moleculares que governam a biogênese plaquetária aumentarão nossa capacidade de desenvolver novas estratégias para o tratamento de trombocitopenia e trombocitemia. No campo da pesquisa transfusional, esses esforços estabelecerão as bases para a produção de plaquetas cultivadas como alternativa transfusional em situações selecionadas⁹.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), pela União Europeia através do Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) e pela subvenção ANR-17-CE14-Megaplatprod à H.d.S e ANR-18-CE14-PlatForMechanics à C.L.

Referências

Boscher, J., et al. Blood platelet formation at a glance. Journal of Cell Science. 133 (20), 244731(2020).
Machlus, K. R., Italiano, J. E. The incredible journey: From megakaryocyte development to platelet formation. The Journal of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).
Strassel, C., et al. Aryl hydrocarbon receptor-dependent enrichment of a megakaryocytic precursor with a high potential to produce proplatelets. Blood. 127 (18), 2231-2240 (2016).
Montenont, E., et al. CRISPR-edited megakaryocytes for rapid screening of platelet gene functions. Blood Advances. 5 (9), 2362-2374 (2021).
Aguilar, A., et al. Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation. Blood. 128 (16), 2022-2032 (2016).
Eckly, A., et al. Megakaryocytes use in vivo podosome-like structures working collectively to penetrate the endothelial barrier of bone marrow sinusoids. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (11), 2987-3001 (2020).
Eckly, A., et al. Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).
Bornert, A., et al. Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation. Haematologica. 106 (5), 1368-1380 (2021).
Strassel, C., Gachet, C., Lanza, F. On the way to in vitro platelet production. Transfusion Clinique et Biologique. 25 (3), 220-227 (2018).

Reimpressões e permissões

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