Summary
Protokollen beskriver isolasjon, kultur og profilering av endotelceller fra human mesenterisk arterie. I tillegg er det gitt en metode for å forberede menneskelig arterie for romlig transkripsjon. Proteomikk, transkripsjon og funksjonelle analyser kan utføres på isolerte celler. Denne protokollen kan gjenbrukes for alle middels eller store arteri.
Abstract
Endotelceller (ECer) er avgjørende for vaskulær og helkroppsfunksjon gjennom deres dynamiske respons på miljøsignaler. Å belyse transkripsjonen og epigenomet til ECs er avgjørende for å forstå deres roller i utvikling, helse og sykdom, men er begrenset i tilgjengeligheten av isolerte primærceller. Nyere teknologier har gjort det mulig med høy gjennomstrømningsprofilering av EC-transkripsjon og epigenom, noe som har ført til identifisering av tidligere ukjente EC-celleunderbefolkninger og utviklingsbaner. Mens EF-kulturer er et nyttig verktøy i utforskningen av EC-funksjon og dysfunksjon, kan kulturforholdene og flere passasjer introdusere eksterne variabler som endrer egenskapene til innfødt EC, inkludert morfologi, epigenetisk tilstand og genuttrykksprogram. For å overvinne denne begrensningen demonstrerer det nåværende papiret en metode for å isolere menneskelige primære ECer fra donormesenteriske arterier som tar sikte på å fange sin opprinnelige tilstand. ECs i det organisatoriske laget er dissosiert mekanisk og biokjemisk ved bruk av bestemte enzymer. De resulterende cellene kan brukes direkte til bulk RNA eller encellet RNA-sekvensering eller belagt for kultur. I tillegg er en arbeidsflyt beskrevet for fremstilling av humant arterielt vev for romlig transkripsjon, spesielt for en kommersielt tilgjengelig plattform, selv om denne metoden også er egnet for andre romlige transkripsjonsprofileringsteknikker. Denne metodikken kan anvendes på ulike fartøy samlet inn fra en rekke givere i helse- eller sykdomstilstander for å få innsikt i EF-transkripsjonell og epigenetisk regulering, et sentralt aspekt ved endotelcellebiologi.
Introduction
Fôr lumen i blodårene, endotelceller (ECs) er avgjørende regulatorer for vaskulær tone og vevsperfusjon. ECs er bemerkelsesverdige i deres evne til å reagere på det ekstracellulære miljøet og tilpasse seg endringer i dynamikken og sammensetningen av blodstrømmen. Disse dynamiske svarene formidles gjennom et nettverk av intracellulære signalhendelser, inkludert transkripsjonelle og posttranskripsjonelle moduler med romlig-temporal oppløsning. Dysreguleringen av disse svarene er involvert i mange patologier, inkludert, men ikke begrenset til kardiovaskulær sykdom, diabetes og kreft 1,2.
En stor andel av studiene benytter seg av cellelinjer eller dyremodeller for å forhøre EC-transkripsjon. Førstnevnte er et nyttig verktøy, gitt den relative brukervennligheten og billigheten. Imidlertid kan seriell culturing introdusere fenotypiske endringer på ECs, for eksempel fibroblastiske funksjoner og mangel på polarisering, og koble dem fra in vivo-tilstand 3. Primærcellene, for eksempel, human navlestreng EC (HUVEC) har vært et populært valg siden 1980-tallet, men er avledet fra en utviklingsmessig vaskulær seng som ikke eksisterer hos voksne, og dermed usannsynlig å representere modne ECer fullt ut. Dyr, spesielt musemodeller, representerer bedre det fysiologiske eller patofysiologiske miljøet i ECs og tillater forhør av transkripsjoner som følge av genetisk perturbasjon. Murine ECs kan isoleres fra ulike vev, inkludert aorta, lunger og fettvev ved hjelp av enzymbaserte prosedyrer 4,5,6,7. De isolerte cellene kan imidlertid ikke brukes til flere passasjer med mindre de er forvandlet6 og ofte er begrenset i antall, noe som krever sammenslåing fra flere dyr 5,8,9.
Fremveksten av ny teknologi som utforsker fartøyarkitekturen på et trans transcriptomisk nivå, spesielt med encellet oppløsning, har gjort det mulig for en ny æra av endotelbiologi ved å avsløre nye funksjoner og egenskaper til ECs 5,10,11,12,13,14. En rik ressurs bygget av Tabula Muris-etterforskere samlet inn encellede transkripsjonsprofiler på 100 000 celler, inkludert ECer over 20 forskjellige murinorganer15, som avslørte både vanlige EC-markørgener og unike transkripsjonssignaturer med inter- og intravevsforskjeller 5,13. Likevel er det klare forskjeller mellom mus og menneske i genom, epigenom og transkripsjon, spesielt i ikke-kodingsregionene 16,17,18. Disse nevnte ulempene understreker viktigheten av analyse av ECs ved hjelp av menneskelige prøver for å få en trofast profil av ECs i sin opprinnelige tilstand i helse og sykdom.
De fleste EC-isolasjonsmetoder er avhengige av fysisk dissosiasjon gjennom homogenisering, finskjæring og gruvedrift av vevet før inkubasjon med proteolytiske enzymer i forskjellige tider. Enzymene og forholdene varierer også betydelig mellom vevstyper, fra trypsin til kollagenase, brukt alene eller i kombinasjon 19,20,21. Ytterligere antistoffbasert berikelse eller rensing er ofte inkludert for å øke renheten til ECs. Vanligvis er antistoffer mot EC-membranmarkører, for eksempel CD144 og CD31, konjugert til magnetiske perler og lagt til celleopphenget22,23. En slik strategi kan generelt tilpasses for EC-isolasjon fra flere menneske- og musevev, inkludert teknikkene som er introdusert i denne protokollen.
I sin opprinnelige tilstand samhandler ECs med flere celletyper og kan eksistere i vaskulære nisjer der celle nærhet er avgjørende for funksjon. Mens single-cell og single-nuclear RNA-sekvensering (scRNA og snRNA-seq) studier har vært avgjørende for de siste gjennombruddene i å beskrive EC heterogeneity, forstyrrer dissosiasjonsprosessen vevskontekst og cellecellekontakt, som også er viktig for å forstå EC-biologi. Utviklet i 2012 og kalt Årets metode i 202024, har romlig transkripsjonsprofilering blitt brukt til å profilere globalt genuttrykk samtidig som de beholder de romlige egenskapene i ulike vev, inkludert hjerne25,tumor 26 og fettvev27. Teknologiene kan målrettes ved hjelp av spesialiserte sonder som er spesifikke for bestemte RNA-sekvenser festet til affinitetsreagenser eller fluorescerende koder, og dermed oppdage utvalgte gener ved subcellulær oppløsning 28,29,30,31. De kan også være umålte32,33, vanligvis ved hjelp av romlig strekkodede oligonukleotider for å fange RNA, som sammen blir konvertert til cDNA for etterfølgende seq bibliotek forberedelse og dermed har fordelen av å utlede hele vev genuttrykk på en objektiv måte. Romlig oppløsning oppnås imidlertid for øyeblikket ikke på et enkelt mobilnivå med kommersielt tilgjengelige teknologier. Dette kan til en viss grad overvinnes med dataintegrasjon med scRNA-seq-data, slik at kartleggingen av encellet transkripsjon i en kompleks vevskontekst samtidig som den beholder sin opprinnelige romlige informasjon34.
Her er en arbeidsflyt beskrevet for å profilere EC-transkripsjon ved hjelp av human overlegen mesenterisk arterie, en perifer arterie som har blitt brukt til å studere vasodilatasjon, vaskulær ombygging, oksidativt stress og betennelse 35,36,37. To teknikker er beskrevet: 1) å isolere og berike ECs fra intima av blodkar som kombinerer mekanisk dissosiasjon og enzymatisk fordøyelse egnet for encellet transkripsjon sekvensering eller påfølgende in vitro kultur; 2) å forberede arterielle seksjoner for romlig transkripsjonsprofilering (figur 1). Disse to teknikkene kan utføres uavhengig eller komplementært for å profilere ECs og deres omkringliggende celler. Videre kan denne arbeidsflyten tilpasses for bruk på et hvilket som helst medium eller stor arterie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Humane vevsstudier ble utført på deidentifiserte prøver hentet fra Southern California Islet Cell Resource Center ved City of Hope. Forskningssamtykket for bruk av postmortem humant vev ble innhentet fra givernes pårørende, og etisk godkjenning for denne studien ble gitt av Institutional Review Board of City of Hope (IRB Nr. 01046).
1. Fysisk dissosiasjon (estimert tid: 1-2 t)
- Legg en fersk arterie på en 10 cm tallerken og vask med steril Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (D-PBS).
- Med sterile tang og disseksjonssaks fjerner du fettet og det ytre bindevevet til karet er rent. Mål lengden på fartøyet med en linjal plassert utenfor fatet og ta bilder for poster (figur 1A).
- Pre-varm passende fordøyelsesbuffer til 37 °C: for scRNA-seq bruk celle-dissosiasjonsenzym; for cellekulturanalyser, bruk 1-6 mg/ml kollagenase D, 3 mg/ml bakterieavledede protease, 100 mM HEPES, 120 mM NaCl, 50 mM KCl, 5 mM glukose, med 1 mM CaCl2 6,38 (pH 7,0, krever ikke justering) lagt til 5 min før bruk.
- Ta den mesenteriske arterien (vanligvis med en diameter på 6-8 mm) og kutt på langs med saks for å åpne fartøyet lumen vertikalt.
- Bruk nåler til å feste fartøyet på svart voks på alle fire hjørner, slik at intimaen blir eksponert (figur 1B).
- Tilsett 1 ml forvarmet fordøyelsesbuffer til intima. Ta en steril skalpell og skrap lumen på fartøyet forsiktig to ganger.
MERK: Hensikten med denne prosedyren er å fjerne intimallaget, som kan trenge praksis. Nok kraft må utøves for å fjerne endotel, men ikke så mye at de dypere lagene av vev også fjernes, noe som vil redusere EC-representasjonen. - Overfør fordøyelsesbufferen til et 5 ml rør. Tilsett 1 ml fordøyelsesbuffer til intima og pipette opp og ned forsiktig for å samle de resterende cellene og legge til 5 ml-røret. Inkuber celler ved 37 °C, roterer ved 150 o/min i 5 minutter.
- Tilsett 2 ml M199 medium (eller D-PBS hvis du fortsetter med scRNA-seq) i celleopphenget for å slukke den enzymatiske reaksjonen. Bland forsiktig og sentrifuger ved 4 °C, 600 x g i 5 minutter.
- Fjern supernatanten og lagre supernatanten separat i kulturen som en kontroll for å observere om alle cellene er fanget i pelletsen i trinn 1.8. Resuspend cellepellet i 1 ml M199 medium (eller D-PBS hvis du fortsetter med scRNA-seq).
- Vurder cellens levedyktighet ved å blande 10 μL trypan blå med 10 μL cellepapir. Vær oppmerksom på cellemorfologien og tell cellene ved hjelp av et hemocytometer.
MERK: På dette tidspunktet kan celler brukes til protein- eller RNA-kvantifisering eller dyrket in vitro ved hjelp av EC-kulturmedier etter standardprotokoller39. Alternativt kan de være forberedt på sekvensering som beskrevet i neste avsnitt. - For kulturen, belegge to brønner av en 6-brønns plate ved pipettering 500 μL festereagens i brønner i 30 min ved romtemperatur. Etter fjerning av festereagens og vasking med steril D-PBS, dispenser hele cellelageret i en brønn, og supernatanten holdt seg som en kontroll inn i den andre brønnen.
2. Forberedelse for scRNA-seq studier (estimert tid: 3-4 h)
- Sentrifuger cellemassen fra trinn 1,11 ved 4 °C, 600 x g i 5 minutter. Fjern den supernatante og resuspend pellet forsiktig med en P1000 pipette og bredboret spiss i 1 ml 0,04% bovint serumalbumin (BSA) i D-PBS. Bland godt for å sikre en encellet suspensjon.
- Før løsningen gjennom en 40 μm sil for å fjerne celleavfall. Hvis rusk forblir, passerer du gjennom en annen sil til 4 ml 0,04% BSA i D-PBS.
- Sentrifuge ved 4 °C, 600 x g i 5 minutter. Fjern den supernatante og resuspend pellet i 500 μL av 0,04% BSA i D-PBS ved hjelp av en P1000 pipette med en bredboret pipettespiss. Bland godt for å sikre en encellet suspensjon.
- Vurder cellens levedyktighet ved å blande 10 μL cellelager med 10 μL trypanblå. Bruk et hemocytometer, observere morfologien, avgjøre om det er en encellet suspensjon uten klynger, se etter vevsrester og beregne antall levende og døde celler.
- Hvis celler er gruppert eller rusk gjenstår, gjenta vask med 0,04% BSA i D-PBS eller passere gjennom 40 μm sil igjen.
MERK: Selv om dette vil redusere utbyttet, er det viktig at celler finnes i en ren encellet suspensjon for optimal sekvensering. - Encellet suspensjon kan brukes til scRNA-seq.
3. Romlig transkripsjonsprofilering (estimert tid: 3-4 t)
- Tilsett isopentan (2-metylbutan) til en metallbeholder og slapp av i flytende nitrogen (LN2) eller tørris (LN2 foretrekkes da det vil bringe temperaturen lavere enn tørris). Hell optimal skjæretemperaturforbindelse (OCT) i brønner av merkede plastkryomolder, pass på at du ikke lager bobler og fjerner de som vises. La kryomold være på tørris for å kjøle seg ned.
- Klipp minst to koronal seksjoner, 1 cm i lengden på fartøyet. Bruk lange (12") tang, senk vevet i isopentan til det er frosset. Senk raskt vevet i OCT ved orientering med lumen synlig i midten. Pass på å fjerne eventuelle bobler, spesielt de ved siden av vevet.
- Bruk lange (12") tang, ta tak i kryooldene og hold dem i metallbeholderen. Mens bunnen av formene skal være i væsken, bør den ikke være for dyp til at isopentan kan løpe over vevet. Vær oppmerksom på frysingen, OKT blir hvit gradvis fra utsiden i 1-2 min.
- Oppbevar disse seksjonene i en forseglet beholder ved -80 °C i opptil 6 måneder.
MERK: Oppbevar prøver på tørris til enhver tid og ikke la mer enn én fryse-tine syklus. Dette vevet kan brukes til histologisk analyse, RNA/DNA fluorescens in situ hybridisering (FISH), eller romlig transkripsjon, som vil bli beskrevet nå. - Sett opp kryostattemperaturen til -20 °C for kammeret og -10 °C for prøvehodet. Likevekt OCT innebygde fartøy seksjoner, kniver, børster, og glir til -20 °C i kryostaten i ca. 30 min. Rengjør maskinen og alt utstyr som kan berøre seksjonene, inkludert bladet, med 70 % etanol etterfulgt av RNase-dekontamineringsløsning mens du likevekter.
- Fest prøven ved å dispensere en liten mengde OKT på den sirkulære kryostatblokken og plasser prøven på toppen før den fryser. Plasser blokken i midten av prøvehodet og skru blokken på plass med et høyt svart håndtak til venstre. Skjær bort overflødig OCT rundt fartøyet.
- Sett skjæretykkelsen til 10 μm på kryostaten, kutt ca. 60 seksjoner og legg dem i et forhåndskjølt 1,5 ml rør. Disse seksjonene vil bli brukt til å vurdere RNA-kvaliteten. Ved fjerning fra kryostat, tilsett umiddelbart 1 ml RNA ekstraksjonsreagens og virvel til seksjonene er helt oppløst.
- Tilsett 200 μL kloroform og bland til løsningen ligner en jordbær milkshake. Sentrifuge ved 11 200 x g i 10 min ved 4 °C.
- Samle den vandige fasen (klar fase på toppen av hvite og rosa lag) og tilsett 500 μL isopropanol til den. Bland ved å invertere rørene over 10 ganger og plasser ved -80 °C i minst 20 minutter.
- Sentrifuge ved 11 200 x g i 10 min ved 4 °C. Løs opp den rensede RNA-pelletsen i 5 μL RNase-fritt vann. Undersøk RNA Integrity Number (RIN).
MERK: Prøver med RIN ≥ 7 foretrekkes, men RIN ≥ 6 er akseptabelt. Antall vevsseksjoner og oppløsningsvolum for RNA-oppløsning kan kreve optimalisering avhengig av systemet som brukes for å sikre at den endelige RNA-konsentrasjonen er innenfor RIN-funksjonsområdet for å muliggjøre nøyaktig RIN-evaluering. - Øv deg på å kutte og plassere seksjoner riktig innenfor de fiducial rammene ved hjelp av vanlige glasssklier før du fortsetter til kommersielt tilgjengelige vevsoptimaliserings- eller genuttrykkslysbilder. Dette kan oppnås ved å tegne 6,5 mm x 6,5 mm firkanter på en vanlig glasssklie, kjøle til -20 °C i kryostaten og plassere seksjoner i dette fangstområdet.
- Klipp 10 μm seksjoner med anti-roll plate på plass, snu og forsiktig flate ved å berøre delen forsiktig gjennom den omkringliggende OCT.
- Bruk RNase-frie cryostat-børster til å plassere vevsdelen innenfor firkanten, bare ved hjelp av den omkringliggende OKT. Plasser straks en finger (i hansker) på baksiden av fangstområdet for å smelte delen til lysbildet.
- Når delen har festet seg, plasserer du lysbildet på kryobaren slik at delen kan fryse. Det må utvises forsiktighet for å unngå vevsfolding og vev som overlegger de avgrensede kantene på den fiduciale rammen. Om nødvendig, kutt vevet i halvdeler eller kvartaler langs lumen ved hjelp av et blad for å sikre at karseksjonen passer innenfor rammen på 6,5 mm x 6,5 mm.
- Klipp 10 μm deler av vev i henhold til 3,12-3,14 på vevsoptimalisering eller genuttrykkssklier. Overfør skredet til en lysbildepost som er plassert på tørris. Oppbevar lysbildene ved -80 °C i opptil 4 uker før du fortsetter med publiserte romlige protokoller33,34.
4. Sekvensering av dataanalyse (estimert tid: opptil 1 uke avhengig av kjennskap til programvare)
MERK: Bare for romlig transkripsjonsanalyse, hopp til trinn 4.8. scRNA-seq-data behandles ved hjelp av den standardiserte rørledningen justert etter humant hg38 referansetranskripsjonsom. R-pakken Seurat (v3.2.2) brukes til å analysere scRNA-seq-data etter publiserte retningslinjer40.
- Filtrer ved hjelp av veletablerte kvalitetskontrollmålinger: sjeldne celler med svært høyt antall gener (potensielt multiplets) og celler med høye mitokondrieprosenter (lavkvalitetsceller eller døende celler som ofte presenterer mitokondrieforurensning) fjernes.
- Normaliser data ved hjelp av "sctransform", en metode for å forbedre prøveintegrasjon sammenlignet med log-normalisering. Disse normaliserte dataene brukes til dimensjonalitetsreduksjon og klynging, mens logg-normaliserte uttrykksnivåer brukes til analyse basert på genuttrykksnivåer, for eksempel celletypeklassifisering41.
- Velg markørgener per celletype, for eksempel platelet endotelcelleadhesjonsmolekyl-1 (PECAM1) og von Willebrand faktor (VWF) for ECs, lumican (LUM) og procollagen C-Endopeptidase Enhancer (PCOLCE) for fibroblaster, B-celle translokasjonsgen 1 (BTG1) og CD52 for makrofager, C1QA og C1QB for monocytter, og myosin tungt kjede 11 (MYH11) og transgelin (TAGLN) for vaskulære glatte muskelceller36.
- Beregn det gjennomsnittlige uttrykksnivået på tvers av enkeltceller mellom hvert indikatorpar for å ha én enkelt indikator med et gjennomsnittlig uttrykksnivå knyttet til hver celletype42.
- Bruk en gaussisk blandingsmodell (GMM) med to komponenter på uttrykksdataene for hver markør på tvers av enkeltceller for å dele celler i to sett, nemlig å uttrykke markøren høyt og uttrykke markøren lavt. På denne måten tilordnes hver enkelt celle til én av de to komponentene42 for hver indikator.
- Bruk statistisk berikelse for settet med markørgener, en Fishers eksakte test, for å tilordne en celletype til hver klynge. Ved å gjøre dette oppnås et sett med p-verdier per klynge, som hver tilsvarer en celletype. Celletypen med lavest p-verdi tilordnes denne sektorgruppen.
- Behandle de romlige transkripsjonsdataene ved hjelp av Space Ranger-rørledningene, noe som resulterer i romlig de-barkoding og generering av kvalitetskontrollmålinger (QC), inkludert totaljusterte lesninger til hg38 menneskelig transkripsjon, mediantallet for Unique Molecular Identifier (UMI) eller gener per punkt35.
MERK: R-pakken Seurat (v3.2.2) brukes til å analysere Space Ranger-behandlede data i følge publiserte retningslinjer40. - Normaliser data ved hjelp av "sctransform", en metode som er demonstrert for å forbedre nedstrømsanalysen sammenlignet med log-normalisering gitt heterogeniteten til vevet og den svært høye variansen i antall på tvers av flekkene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Analysen av ECs fra mesenterisk arterie ved hjelp av en kombinasjon av mekanisk og enzymatisk dissosiasjon eller kryopreservering for bruk i ulike nedstrømsanalyser er avbildet her (figur 1). ECs kan profileres i mesenteriske arterier ved hjelp av følgende trinn: A) mekanisk dissosiasjon fra intima kombinert med kollagenalisse fordøyelse til kulturceller; B) generering av encellet suspensjon for scRNA-seq; eller C) tverrsnitt av arterien kan bygges inn i OCT for å bli kryoseksjonert for å profilere romlig transkripsjon (figur 1 og figur 2).
Figur 1: Arteriell vevsbehandling og romlig profilering. (A) En opprenset mesenterisk arterie. (B) Fartøyet er kuttet opp for å eksponere intima. (C) Hematoksylin og Eosin (H&E) farging av mesenterisk arterie tverrsnitt i fiducial ramme. Bilde tatt med en 5x linse under widefield fluorescens invertert mikroskop. (D) Representativ Space Ranger utdatafil av totalt genuttrykk. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Oversikt over EC-isolasjons- og profileringsteknikker. Strømningsskjema som viser ulike metoder for behandling av mesenterisk arterie. Behandlingsteknikker resulterer i celle suspensjoner egnet for encellet (sc) RNA-seq, endotelial celle (EC) kultur, eller hele vev er innebygd i optimal skjæretemperatur sammensatt (OCT) for romlig transkripsjonom profilering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Isolerte ECer som dyrkes ved hjelp av den beskrevne protokollen, viser en distinkt brosteinlignende morfologi med minimale forurensende celler (figur 3A). Uttrykk for EC-markørvaskulær endotel (VE)-Cadherin ble bekreftet ved hjelp av immunfluorescens som visualiserer cellecellekryss (figur 3B). Isolerte ECer ble utsatt for strømningscytometrianalyse for CD31. Som negative kontroller produserte unstained HUVECs (uten antistoff) et 1,1% signal og HUVEC inkubert med IgG ga et 0,8% signal. Som en positiv kontroll viste HUVECer farget med CD31 antistoff 99% renhet og ble brukt til å gate kanalene for humane mesenteriske arterielle endotelceller (HMAECs). Omtrent 80 % av cellene var CD31-positive, noe som indikerer at HMAECer utgjorde mesteparten av den nyisolerte cellepopulasjonen (figur 3C). Mislykkede isolasjoner, enten ved å skrape for hardt/dypt, så cellene med for lav tetthet, eller opprettholde kulturen utover passasje 3 resulterer i celler med forstyrret morfologi, som potensielt uttrykker mesenchymale markører (αSMA) eller forlengelse som ligner en fibroblastisk tilstand (figur 3D).
Figur 3: Validering av isolerte mesenteriske arterielle ECs. (A) Brightfield bilde av isolerte ECs, 10x linse, skala bar = 50 μm. (B) Immunofluorescence av VE-Cadherin uttrykk med 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) som en kjernefysisk markør. Bilde tatt med en 10x linse under widefield fluorescens invertert mikroskop. Representativt bilde viser ve-cadherin lokalisering. Skalastang = 50 μm. (C) FACS-plott av unstained HUVEC (øverst til venstre), HUVEC farget med IgG-kontroll (øverst til høyre), HUVEC farget med CD31 (nederst til venstre), og den isolerte menneskelige mesenteriske arterielle endotelceller (HMAEC) farget med CD31 (nederst til høyre) (D) Immunofluorescence bilder av HMAECs med DAPI (kjernefysisk markør), alfa-glatt muskel actin (αSMA) og CD31. 40x linse, skala bar = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
ECs isolert ved hjelp av celle-dissosiasjon enzym gjennomgikk scRNA-seq. Figur 4A viser en representativ ensartet manifold-tilnærming og projeksjon (UMAP) isolert fra mesenterisk arterie ved hjelp av dagens protokoll for scRNA-seq på isolerte HMAECer, med 34 % celler gruppert som ECer ved hjelp av henholdsvis PECAM1 og VWF (figur 4B, C ) som markører.
Figur 4: scRNA-seq av mesenteriske arterielle ECs. (A) Uniform Manifold Tilnærming og projeksjon (UMAP) plott av scRNA-seq data fra mesenterisk arterie. En 2-dimensjonal projeksjon av manifolden i et høydimensjonalt rom, hvor hvert punkt representerer en enkelt celle og nærheten til andre punkter indikerer hvor lik transkripsjonen er med hverandre. Celler fargekodes etter celletypene. (B) PECAM1-uttrykk projisert på UMAP. (C) VWF-uttrykk projisert på UMAP. Fargestenger representerer uttrykket av nivåer av gener der RNA-nivåene er avbildet av log-normaliserte unike molekylære identifikatortall. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
For romlig transkripsjonsarbeidsflyt ble ekstrahert RNA fra vevsseksjoner elektroforert på en gel for å visualisere RNA-kvalitet. Et svakt signal eller fravær av 18S og 28S ribosomale RNA-bånd, og tilstedeværelsen av nedbrytningsprodukter observert i figur 5A, bane A1, er et eksempel på dårlig kvalitet RNA og bør ikke behandles videre. Prøver med en konsentrasjon utenfor området kan føre til lavere RIN (figur 5A, bane B1). Fortynning av RNA med to ganger økt RIN som er tilstrekkelig for å fortsette (figur 5A, bane C1). Før genuttrykk ble bestemt, ble det utført en vevsoptimalisering for å bestemme den optimale permeabiliseringstiden for å frigjøre RNA som skal fanges av oligonukleotidene på genuttrykksskredet (figur 5B). Basert på fluorescensavbildningen av komplementært DNA-fotavtrykk (cDNA), produserte 18 min permeabilisering den laveste bakgrunnen, men sterkeste signalet, og ble derfor valgt ut til å være den optimale varigheten. Hematoksylin og eosin (H&E) farging visualiserte morfologien til fartøyet slik at interesseområder kunne identifiseres (figur 5C). Bibliotekkvaliteten ble vurdert (figur 5D) og fastslått å være egnet for sekvensering. UMI teller per punkt, antall avlesninger per punkt, og totale gener er kvalitetsmålinger produsert av Space Ranger-rørledningen, variasjonen av hver som vises i figur 5E. Til slutt ble genuttrykk (ved hjelp av Actin alfa-2 (ACTA2) som eksempel figur 5F) visualisert med romlig forankring på H&E-farget kar.
Figur 5: Romlig transkripsjonsarbeidsflyt og representative resultater (A) Kvalitetsvurdering av RNA ekstrahert fra to prøver av mesenterisk arterie, A1 fra en prøve, B1 fra den andre prøven, C1 fortynnet 2x fra B1. Røde piler indikerer ribosomale 28S- og 18S-bånd. (B) Arbeidsflyt for optimalisering av romlig vev (TO). (C) Genuttrykk (GEX) lysbilder som viser vevsdelene (venstre panel); H&E-bilder av vevsseksjonene lastet på GEX-lysbildet før permeabilisering i 18 minutter, omvendt transkripsjon og bibliotekkonstruksjon (høyre panel), skalalinje = 1 cm. (D) Kvalitetsvurdering av bibliotekene som er utarbeidet. (E) Utgangsmålinger fra Space Ranger viser områder mellom gjennomsnittlig lesing, UMIer og gener per sted for forskjellige biblioteker. Feilfelt angir minimums- og maksimumsuttrykket (F) ACTA2 på tvers av fartøyseksjonen. Alle mikroskopibilder ble tatt ved hjelp av et widefield invertert mikroskop, fra en 5x linse, flisemaskinmodul. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den presenterte arbeidsflyten beskriver et sett med teknikker for å profilere ECer fra et enkelt stykke menneskelig arterie med encellet og romlig oppløsning. Det er flere kritiske trinn og begrensende faktorer i protokollen. En nøkkel til transkripsjonsprofilering er friskheten i vevet og RNA-integriteten. Det er viktig å opprettholde vev på is så mye som mulig før behandling for å minimere RNA-nedbrytning. Vanligvis behandles post-mortem vev mellom 8-14 timer etter dødstidspunktet. Men å begynne isolasjonen eller kryopreserveringen så snart som mulig etter utvinning fra giverne anbefales. Spesielt for romlig transkripsjonskartlegging bør vevet holdes på tørris og ikke mer enn en fryse-tine syklus bør tillates. Mer enn ett fartøy tverrsnitt bør bygges inn i OCT, for å tillate repetisjoner om nødvendig. Det bør også arbeides for å fremme et RNase-fritt miljø under vevsbehandling og celleisolasjon. For det andre kan størrelsen på fartøyene være en begrensende faktor. For romlig transkripsjon kan protokollen utføres på 1 mm av fartøyet totalt, uavhengig av diameteren. For dissosiasjonsprotokollen for cellekultur og scRNA-seq vil den nedre grensen være hvis fartøyet er for smalt (dvs. under 1 mm i diameter) for å muliggjøre innsetting av disseksjonssaks. Basert på disse prinsippene kan dissosiasjonsprotokollen tilpasses enhver middels eller større størrelse arterie eller vene så lenge størrelsen på fartøyene tillater åpningen, og den romlige transkripsjonsprosedyren kan brukes på alle fartøy som kan passe helt eller delvis inn i den fiduciale rammen.
For å behandle vev for encellet transkripsjonsanalyse har flere grupper beskrevet bruken av liberase og elastase for å oppnå alle cellepopulasjoner innenfor karveggen 9,43,44. De resulterende datasettene inneholder imidlertid i gjennomsnitt bare 3-7% av den totale cellepopulasjonen som er kommentert som ECer 9,45. En måte å forbedre den begrensede EC-representasjonen i scRNA-seq-dataene er ved å berike EC-fraksjonen ved å utnytte EC-overflatemarkørene via FACS44,46. Dette krever imidlertid vanligvis store mengder startvev og dyrt utstyr som kanskje ikke er rutinemessig tilgjengelig for alle laboratorier. Denne protokollen utnytter den unike anatomiske posisjonen til ECs, viz. først og fremst i intimallaget, noe som gir berikelse av ECs uten behov for hard vevs fordøyelse og forbedrer celle levedyktigheten for scRNA-seq eller påfølgende kultur. Prosentandelen av ECer i den endelige celleblandingen for scRNA-seq kan økes ved å legge til et trinn ved hjelp av VE-Cadherin / CD144 antistoffkonjuged magnetiske perler. Dette trinnet utelukker imidlertid kanskje ikke alle andre celler som samhandler med ECer på grunn av den opprinnelige cellecelleinteraksjonen. Likevel, selv om de andre celletypene (f.eks. makrofager, glatte muskelceller og fibroblaster) tradisjonelt vil bli ansett som "forurensning" i EC-isolasjon, kan de gi nyttig informasjon for cellecelleinteraksjoner i vevskonteksten. I scRNA-seq-dataanalysen kan ECer effektivt kommenteres ved hjelp av EC-markørene, og cellecelleinteraksjonene kan utledes bioinformatisk ved hjelp av flere populære bioinformatikkmetoder (f.eks. CellChat47, CellphoneDB48, CytoTalk49 blant andre). Videre kan inkludering av disse dataene muliggjøre mer effektiv integrasjon og dekonvolusjon av de romlige transkripsjonsprofileringsdataene, som ikke har encellede oppløsning (se nedenfor)34.
For romlig transkripsjon er det for tiden ingen gullstandard for å forberede noe vev for denne teknikken og begrenset forskning på å forberede vaskulatur, med det meste av den publiserte forskningen ved hjelp av dyrevev 50,51. Teknikken krever kommersielt tilgjengelige lysbilder med spesialiserte fudikialrammer med et fangstområde som inneholder omtrent 5000 strekkodede flekker med en diameter på 55 μm. Flekkene er plassert 100 μm bortsett fra midten av stedet til tilstøtende flekker som etterlater ca 45 μm hull mellom flekker som ikke vil bli profilert, noe som begrenser oppløsningen. Videre vil et enkelt sted inneholde flere celler, da flertallet av cellene er under 55 μm i området. Dermed, som nevnte, er dette ikke en encellet sekvenseringsteknikk. Ved å integrere dataene med scRNA-seq kan imidlertid oppløsningen forbedres, og heterogeniteten på et sted kan avsløres34. Selv om den nåværende protokollen fokuserer på en romlig transkripsjonsanalyse, kan denne teknikken tilpasses andre nye romlige profileringsmetoder52,53 ettersom protein- og RNA-kvaliteten opprettholdes i denne prosedyren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
S.Z. er grunnlegger og styremedlem i Genemo, Inc.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIH-tilskudd R01HL108735, R01HL145170, R01HL106089 (til Z.B.C.); DP1DK126138 og DP1HD087990 (til S.Z.); et Ella Fitzgerald Foundation-stipend og et Wanek-familieprosjekt (til Z.B.C.); og et Human Cell Atlas frønettverksstipend (til Z.B.C. og S.Z.). Forskning rapportert i denne publikasjonen inkluderte arbeid utført i Integrative Genomics Core ved City of Hope støttet av National Cancer Institute of the National Institutes of Health under tildelingsnummer P30CA033572. Forfatterne vil takke Dr. Ismail Al-Abdullah og Dr. Meirigeng Qi fra holmetransplantasjonsteamet i City of Hope for isolering av humant vev, Dr. Dongqiang Yuan ved City of Hope for hans hjelp med scRNA-seq analyse, og Dr. Marc Halushka ved Divisjon for kardiovaskulær patologi, Johns Hopkins University School of Medicine for sin uvurderlige innsikt i vaskulær histologi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL micro-centrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 10 cm dish | Genesee Scientific | 25-202 | |
| 23G needles | BD | 305145 | |
| 2-methylbutane | Thermo Fisher | AC327270010 | |
| 40 µm strainer | Fisher | 14100150 | |
| 4200 TapeStation System | Agilent Technologies | G2991BA | |
| 5 mL tube | Thermo Fisher | 14282300 | |
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 07-000-208 | |
| Attachment factor | Cell Applications | 123-500 | Attachment reagent in the protocol |
| Black wax | Any commercial black wax can be used | ||
| Bovine serum albumin heat shock treated | Fisher | BP1600-100 | |
| CaCl2 | Fisher | BP510 | |
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| Chloroform | Fisher | C607 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Cryostat | Leica | ||
| Cryostat brushes | |||
| D-Glucose | Fisher | D16-1 | |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher | MT25950CQC | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | Bacteria-derived protease in the protocol |
| Disposable Safety Scalpels | Myco Instrumentation | 6008TR-10 | |
| D-PBS | Thermo Fisher | 14080055 | |
| Ethanol | Fisher | BP2818-4 | |
| Fetal bovine serum | Fisher | 10437028 | |
| Hemocytometer | Fisher | 267110 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-100g | |
| High sensitivity D1000 sample buffer | Agilent Technologies | 5067-5603 | |
| High sensitivity D1000 screen tape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| Incubator | Kept at 37 °C 5% CO2 | ||
| Isopropanol | Fisher | BP26324 | |
| KCl | Fisher | P217-3 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Medium 199 | Sigma Aldrich | M2520-10X | |
| Metal cannister | |||
| Microscope | Leica | To assess cell morphology | |
| Microvascular endothelial culture medium | Cell Applications | 111-500 | |
| NaCl | Fisher | S271-1 | |
| New Brunswick Innova 44/44R Orbital shaker | Eppendorf | ||
| Optimal Cutting Temperature compound | Fisher | 4585 | |
| Plastic cryomolds | Fisher | 22363553 | |
| RNA screen tape | Agilent Technologies | 5067-5576 | |
| RNA screen Tape sample buffer | Agilent Technologies | 5067-5577 | |
| RNase ZAP | Thermo Fisher | AM9780 | |
| RNase-free water | Takara | RR036B | RNase-free water (2) in kit |
| Sterile 12" long forceps | F.S.T | 91100-16 | |
| Sterile fine forceps | F.S.T | 11050-10 | |
| Sterile fine scissors | F.S.T | 14061-11 | |
| Superfrost PLUS Gold Slides | Fisher | 1518848 | |
| TRIzol reagent | Fisher | 15596018 | |
| Trypan Blue | Corning | MT25900CI | |
| TrypLE Express Enzyme (1X) phenol red | Thermo Fisher | 12605010 | Cell-dissociation enzyme in the protocol |
| Visium Accessory Kit | 10X Genomics | PN-1000215 | |
| Visium Gateway Package, 2rxns | 10X Genomics | PN-1000316 | |
| Visium Spatial Gene Expression Slide & Reagent Kit, 4 rxns | 10X Genomics | PN-1000184 |
References
- Thorin, E., Shreeve, S. M. Heterogeneity of vascular endothelial cells in normal and disease states. Pharmacology & Therapeutics. 78 (3), 155-166 (1998).
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
- Hillen, H. F., Melotte, V., van Beijnum, J. R., Griffioen, A. W. Endothelial cell biology. Angiogenesis Assays: A Critical Appraisal of Current Techniques. , John Wiley & Sons. Chichester, West Sussex, UK. 1-38 (2007).
- Nam, D., et al. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 297 (4), 1535-1543 (2009).
- Kalucka, J., et al. Single-cell transcriptome atlas of murine endothelial cells. Cell. 180 (4), 764-779 (2020).
- Tang, X., et al. Suppression of endothelial AGO1 promotes adipose tissue browning and improves metabolic dysfunction. Circulation. 142 (4), 365-379 (2020).
- Ni, C. W., Kumar, S., Ankeny, C. J., Jo, H. Development of immortalized mouse aortic endothelial cell lines. Vascular Cell. 6 (1), 7 (2014).
- Kalluri, A. S., et al. Single-cell analysis of the normal mouse aorta reveals functionally distinct endothelial cell populations. Circulation. 140 (2), 147-163 (2019).
- Wirka, R. C., et al. Atheroprotective roles of smooth muscle cell phenotypic modulation and the TCF21 disease gene as revealed by single-cell analysis. Nature Medicine. 25, 1280-1289 (2019).
- Widyantoro, B., et al. Endothelial cell-derived endothelin-1 promotes cardiac fibrosis in diabetic hearts through stimulation of endothelial-to-mesenchymal transition. Circulation. 121 (22), 2407-2418 (2010).
- Zeisberg, E. M., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis. Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).
- Stuart, T., Satija, R.
- Paik, D. T., et al. Single-cell RNA sequencing unveils unique transcriptomic signatures of organ-specific endothelial cells. Circulation. 142 (19), 1848-1862 (2020).
- Palikuqi, B., et al. Adaptable haemodynamic endothelial cells for organogenesis and tumorigenesis. Nature. 585 (7825), 426-432 (2020).
- The Tabula Muris Consortium. et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
- Hezroni, H., et al. Principles of long noncoding RNA evolution derived from direct comparison of transcriptomes in 17 species. Cell Reports. 11 (7), 1110-1122 (2015).
- Washietl, S., Kellis, M., Garber, M. Evolutionary dynamics and tissue specificity of human long noncoding RNAs in six mammals. Genome Research. 24 (4), 616-628 (2014).
- Chen, J., et al. Evolutionary analysis across mammals reveals distinct classes of long non-coding RNAs. Genome Biology. 17 (19), 19 (2016).
- Drake, B. L., Loke, Y. W. Isolation of endothelial cells from first trimester decidua using immunomagnetic beads. Human Reproduction. 6, 1156-1159 (1991).
- McDouall, R. M., Yacoub, M., Rose, M. L. Isolation, culture and characterization of MHC class II-positive microvascular endothelial cells from the human heart. Microvascular Research. 51, 137-152 (1996).
- Sokol, L., et al. Protocols for endothelial cell isolation from mouse tissues: small intestine, colon, heart, and liver. STAR Protocols. 2 (2), 100489 (2021).
- Springhorn, J. P., Madri, J. A., Squinto, S. P. Human capillary endothelial cells from abdominal wall adipose tissue: isolation using an anti-pecam antibody. In Vitro Cellular Developmental Biology Animal. 31 (6), 473-481 (1995).
- Hewett, P. W., Murray, J. C. Immunomagnetic purification of human microvessel endothelial cells using Dynabeads coated with monoclonal antibodies to PECAM-1. European Journal of Cell Biology. 62 (2), 451-454 (1993).
- Marx, V. Method of the Year: spatially resolved transcriptomics. Nature Methods. 18 (1), 9-14 (2021).
- Maynard, K. R., et al. Transcriptome-scale spatial gene expression in the human dorsolateral prefrontal cortex. Nature Neuroscience. 24 (3), 425-436 (2021).
- Ji, A. L., et al. Multimodal analysis of composition and spatial architecture in human squamous cell carcinoma. Cell. 182 (2), 497-514 (2020).
- Bäckdahl, J., et al. Spatial mapping reveals human adipocyte subpopulations with distinct sensitivities to insulin. Cell Metabolism. 33 (9), 1869-1882 (2021).
- Wang, J., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
- Codeluppi, S., et al. Spatial organization of the somatosensory cortex revealed by osmFISH. Nature Methods. 15, 932-935 (2018).
- Eng, C. H. L., et al. Transcriptome-scale super-resolved imaging in tissues by RNA seqFISH. Nature. 568, 235-239 (2019).
- Eng, C. H. L., Shah, S., Thomassie, J., Cai, L. Profiling the transcriptome with RNA SPOTs. Nature Methods. 14, 1153-1155 (2017).
- Rodriques, S. G., et al. Slide-seq: a scalable technology for measuring genome-wide expression at high spatial resolution. Science. 363 (6434), 1463-1467 (2019).
- Ståhl, P. L., et al. Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics. Science. 353 (6294), 78-82 (2016).
- Rao, A., et al. Exploring tissue architecture using spatial transcriptomics. Nature. 596 (7871), 211-220 (2021).
- Sachidanandam, K., et al. Differential effects of diet-induced dyslipidemia and hyperglycemia on mesenteric resistance artery structure and function in type 2 diabetes. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 328 (1), 123-130 (2009).
- Calandrelli, R., et al. Stress-induced RNA-chromatin interactions promote endothelial dysfunction. Nature Communications. 11 (1), 5211 (2020).
- Souza-Smith, F. M., et al. Mesenteric resistance arteries in Type 2 diabetic db/db mice undergo outward remodeling. PLoS One. 6 (8), 23337 (2011).
- Asterholm, I., et al. Adipocyte inflammation is essential for healthy adipose tissue expansion and remodeling. Cell Metabolism. 20 (1), 103-118 (2014).
- Marin, V., et al. Endothelial cell culture: protocol to obtain and cultivate human umbilical endothelial cells. Journal of Immunological Methods. 254 (1-2), 183-190 (2001).
- Stuart, T., et al.
- Hafemeister, C., Satija, R. Normalization and variance stabilization of single-cell RNA-seq data using regularized negative binomial regression. Genome Biology. 20 (1), 296 (2019).
- Bonnycastle, L. L., et al. Single-cell transcriptomics from human pancreatic islets: sample preparation matters. Biology Methods Protocols. 5 (1), (2020).
- Espitia, O., et al. Implication of molecular vascular smooth muscle cell heterogeneity among arterial beds in arterial calcification. PLoS One. 13 (1), 0191976 (2018).
- Engelbrecht, E., et al. Sphingosine 1-phosphate-regulated transcriptomes in heterogenous arterial and lymphatic endothelium of the aorta. eLife. 9, 52690 (2020).
- Hu, H., et al. Single-cell transcriptomic atlas of different human cardiac arteries identifies cell types associated with vascular physiology. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (4), 1408-1427 (2021).
- van Beijnum, J., et al. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nature Protocols. 3 (6), 1085-1091 (2008).
- Jin, S., et al. Inference and analysis of cell-cell communication using CellChat. Nature Communications. 12 (1), 1088 (2021).
- Efremova, M., Vento-Tormo, M., Teichmann, S. A., Vento-Tormo, R. CellPhoneDB: inferring cell-cell communication from combined expression of multi-subunit ligand-receptor complexes. Nature Protocols. 15 (4), 1484-1506 (2020).
- Hu, Y., Peng, T., Gao, L., Tan, K. CytoTalk: de novo construction of signal transduction networks using single-cell RNA-Seq data. Science Advances. 7 (16), (2020).
- Sanchez-Ferras, O., et al. A coordinated progression of progenitor cell states initiates urinary tract development. Nature Communications. 12 (1), 2627 (2021).
- Mantri, M., et al. Spatiotemporal single-cell RNA sequencing of developing chicken hearts identifies interplay between cellular differentiation and morphogenesis. Nature Communications. 12 (1), 1771 (2021).
- Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).
- Moffit, J. R., et al.
