Registro de Transintes de Cálcio na Junção Neuromuscular do Rato com Alta Resolução Temporal utilizando Microscopia Confocal

Summary

O protocolo descreve o método de carregar um corante de cálcio fluorescente através do nervo cortado em terminais nervosos motores do rato. Além disso, é apresentado um método único para o registro de transintes rápidos de cálcio nas terminações nervosas periféricas usando microscopia confocal.

Abstract

A estimativa do nível de cálcio pré-sináptico é uma tarefa fundamental no estudo da transmissão sináptica, uma vez que a entrada de cálcio na célula presináptica desencadeia uma cascata de eventos que levam à liberação de neurotransmissores. Além disso, mudanças nos níveis de cálcio pré-sináptico mediam a atividade de muitas proteínas intracelulares e desempenham um papel importante na plasticidade sináptica. Estudar a sinalização de cálcio também é importante para encontrar maneiras de tratar doenças neurodegenerativas. A junção neuromuscular é um modelo adequado para estudar a plasticidade sináptica, pois possui apenas um tipo de neurotransmissor. Este artigo descreve o método para carregar um corante sensível ao cálcio através do feixe de nervo cortado nas terminações nervosas motoras dos camundongos. Este método permite a estimativa de todos os parâmetros relacionados a alterações intracelulares de cálcio, como nível de cálcio basal e transitório de cálcio. Uma vez que o fluxo de cálcio do exterior celular para os terminais nervosos e sua ligação/desvinculação ao corante sensível ao cálcio ocorrem dentro da faixa de alguns milissegundos, um sistema de imagem rápido é necessário para registrar esses eventos. De fato, câmeras de alta velocidade são comumente usadas para o registro de mudanças rápidas de cálcio, mas têm parâmetros de baixa resolução de imagem. O protocolo aqui apresentado para o registro transitório de cálcio permite uma resolução espacial-temporal extremamente boa fornecida pela microscopia confocal.

Introduction

O problema da medição de ondas rápidas de cálcio em células excitáveis é um dos aspectos mais importantes e desafiadores do estudo da transmissão de sinais nos sistemas nervosos central e periférico. Os íons de cálcio desempenham um papel importante no desencadeamento da liberação de neurotransmissores, plasticidade sináptica e modulação da atividade de várias proteínas intracelulares 1,2,3,4,5. Estudar a sinalização de cálcio também é importante para encontrar maneiras de tratar doenças neurodegenerativas<....

Protocol

Os experimentos foram realizados em preparações nervosas-musculares isoladas do levator auris longus (m. LAL) dos Ratos BALB/C (20-23 g, 2-3 meses)⁴¹. Os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com as diretrizes para o uso de animais de laboratório da Universidade Federal de Kazan e da Universidade Médica de Kazan, em conformidade com o Guia do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. O protocolo experimental atendeu aos requisitos da Diretiva 86/609/CEE do Conselho das Comunidades Europeias e foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade Médica de Kazan.

1. Preparação das....

Results

Após o carregamento da preparação com corante de acordo com a técnica apresentada, a maioria das sinapses localizadas perto do toco nervoso apresentava um nível suficiente de fluorescência (ver Figura 2). Após o carregamento da preparação com o corante e aplicação do método descrito de registro e processamento de imagem, foram obtidos transitórios de cálcio com a resolução espacial e temporal desejada (ver Figura 4). O transitório de cálcio foi recuperado pelo m.......

Discussion

O método de carregamento de corante ca²⁺sensível em terminações nervosas do rato através do toco nervoso e para registro de um transitório rápido de cálcio usando um microscópio confocal é apresentado neste artigo. Como resultado da implementação deste método de carregamento, a maioria das sinapses localizadas perto do toco nervoso tinha um nível suficiente de fluorescência para permitir o registro da entrada de cálcio nas terminações nervosas em resposta à estimulação de baixa frequência do nervo motor.

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Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vidro Capilar	Clark Instrumentos eletromédicos, Reino Unido	GC150-10
Sistema de microscópio confocal e multifotônico Leica TCS SP5 MP	Leica Microsystems, Heidelberg, Alemanha
Extrator de micropipeta flamejante/marrom P 97	Sutter Instrument, EUA	P-97
Regulador de fluxo	KD Medical GmbH Hospital Products, Alemanha	KD REG	Conjunto de infusão descartável com regulador de fluxo
HEPES	Sigma-Aldrich, EUA	H0887	100mL
Sistema de iluminação Leica CLS 150X	Leica Microsystems, Alemanha
ImageJ	National Institutes of Health, EUA		http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html
Las AF software	Leica Microsystems, Heidelberg, Alemanha
Software Las X	Leica Microsystems, Heidelberg, Alemanha		https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Suporte magnético com tubo de sucção	FERRAMENTAS DE BIOCIÊNCIA, EUA	MTH-S
Microspin FV 2400	Biosan, Letônia	BS-010201-AAA
Minutien Pins	Ferramentas de ciência fina, Canadá	26002-20
Multi-spin MSC 3000	Biosan, Letônia	BS-010205-AAN
Oregon Green 488 BAPTA-1 sal pentapotássico	Sondas Moleculares, EUA	O6806	500 μ g
Pipeta	Biohit, Rússia	720210	0.5-10 µ L
Ponta de pipeta	Biohit, Rússia	781349	10 µ L
Plasticina	produtor
Agulhas hipodérmicas de uso único	Bbraun	100 Sterican	0.4× Programa
de planilha	Microsoft, EUA	Estereomicroscópio do Microsoft Office Excel
, Leica M80	Leica Microsystems, Alemanha
Eletrodo de sucção	Kazakov A. ELETRODO DE SUCÇÃO SIMPLES PARA ESTIMULAÇÃO ELÉTRICA DE OBJETOS BIOLÓGICOS / A. Kazakov, M. Alexandrov, N. V. Zhilyakov et al. // Revista internacional de pesquisa. - 2015. - No. 9 (40) Parte 3. - P. 13-16.		http://research-journal.org/biology/prostoj-vsasyvayushhij-elektrod-dlya-elektricheskoj-stimulyacii-biologicheskix-obektov/
Sylgard 184 elastômero	Dow Corning, EUA
Seringa	produtor		0,5 mL
Seringa	produtor		60 mL