Analisando o modelo de rato da doença de Parkinson induzida por vetores virais associados à Adeno codificando α-sinucleína humana

Após a doença de Alzheimer, a doença de Parkinson é a segunda doença neurodegenerativa mais prevalente em todo o mundo. Os neurônios primários afetados na doença de Parkinson são os da via nigrostriatal, que produzem dopamina e controlam o movimento voluntário. Como consequência, o sintoma mais característico associado a esse transtorno é o comprometimento motor. Essa patologia também envolve a deposição de agregados proteicos no cérebro, que são compostos principalmente de α-sinucleína (αSyn)¹, uma proteína citosolica associada a terminais pré-sinápticos. Evidências mostraram que a geração de inclusões patogênicas de αSyn é desencadeada por erros ou por algumas modificações pós-translacionais desta proteína².

Notavelmente, estabeleceu-se uma relação próxima entre a patologia αSyn e a perda de neurônios dopaminérgicos da via nigrostriatal na doença de Parkinson humano e modelos animais ^3,4. Entender como os agregados αSyn são gerados e como eles induzem a morte neuronal representa um desafio significativo no campo. Um grupo crescente de estudos tem demonstrado que, ao aumentar o estresse oxidativo, a disfunção mitocondrial é uma das principais causas para a geração de αSyn agrega². De fato, vários genes associados à doença de Parkinson codificam proteínas envolvidas na função mitocondrial, morfologia e dinâmica ^5,6. Além disso, a disfunção lysosômica, que resulta no acúmulo de mitocôndrias disfuncionais e αSyn desomída constitui outro grande evento promovendo a geração de αSyn agregados⁷.

Evidências emergentes indicaram que, uma vez que os agregados αSyn são depositados no cérebro, essas proteínas patogênicas estimulam receptores semelhantes a pedágio (TLRs) na microglia, desencadeando assim a ativação microglial e um ambiente inflamatório inicial na substantia nigra (SN)^8,9. Além disso, as evidências indicam que os agregados αSyn são capturados e apresentados por células que apresentam antígenos às células T, induzindo uma resposta imune adaptativa específica para αSyn^10,11. Essas células T específicas da αSyn se infiltram posteriormente no cérebro e são repimuladas por microglia ativada, promovendo assim a secreção de fatores neurotóxicos que evocam a morte neuronal ^9,10. Curiosamente, várias linhas de evidência sugerem que os agregados αSyn são gerados primeiro no sistema nervoso entérico e depois transportados através do nervo vago para o tronco cerebral¹².

Vários modelos animais da doença de Parkinson têm sido usados por muitos anos, incluindo aquelas induzidas pela administração de substâncias neurotóxixicas (ou seja, 6-hidroxydopamina, paraquat, rotenona, 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropyridina) e aquelas que envolvem condições genéticas (ou seja, mutante α-sinucleína, mutante leucina-rica em kinase 2)¹³ . Apesar de modelos envolvendo neurodegeneração induzida por neurotoxina replicando alguns aspectos da doença de Parkinson, nenhum deles recapitula todos os aspectos essenciais da doença ou não são progressivos¹³. Por outro lado, embora modelos genéticos de camundongos envolvendo a expressão de versões mutantes de leucina-rich repeat kinase 2, versões mutantes de α-sinucleína, ou a superexpressão do tipo selvagem humano α-sinucleína resultam em prejuízo motor e, em alguns casos, também o desenvolvimento da sinucleinopatia, eles não reproduzem a neurodegeneração proeminente dos neurônios dopaminérgicos nigral, que é um aspecto essencial da doença de Parkinson^{13, 14 anos}. Um terceiro tipo de modelo animal de neurodegeneração conseguiu atender a maioria dos aspectos essenciais da doença de Parkinson, a entrega estereotaxa de vetores virais associados ao Adeno (AAVs) codificando a α-sinucleína humana (AAV-hαSyn)^14,15. É importante ressaltar que os AAVs permitem a transdução de neurônios com alta eficácia e a longo prazo no cérebro adulto dos mamíferos. Além disso, a entrega estereoxica de AAV-hαSyn no SN tem se mostrado para reproduzir muitos dos aspectos essenciais da doença, incluindo patologia αSyn, ativação microglial, neurodegeneração e comprometimento motor 16,17,18,19,20. Este estudo apresenta uma análise de como a dose de vetor viral e o tempo após o parto do vetor viral afetam a extensão da expressão hαSyn, neurodegeneração e neuroinflamação na via nigrostriatal, bem como o grau de comprometimento motor no modelo de rato de entrega estereotaxa unilateral de hαSyn no SN.

Todos os estudos foram realizados na 8ª edição do Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Os protocolos experimentais foram aprovados pela IACUC na Fundação Ciencia & Vida, incluindo aqueles que envolvem anestesia, dor, angústia e eutanásia (Número de Licença P-035/2022).

1. A cirurgia estereotaxa

1. Preparação para a cirurgia (aproximadamente 1 h)
   1. Para manter um ambiente asséptico, use roupas cirúrgicas apropriadas durante toda a cirurgia, incluindo capas de sapato, uma máscara cirúrgica, uma barreira sanitária, luvas e uma tampa cirúrgica.
   2. Pulverizar 70% de etanol no camundongo e todo o material cirúrgico para manter um ambiente asséptico.
   3. Para induzir analgesia, injete o camundongo com carprofeno 5 mg/kg subcutâneamente (s.c.) a cada 12 h²¹ começando 1h antes da cirurgia e continuando até 3 dias após a cirurgia.
   4. Para anestesiar o rato, coloque o animal em uma câmara de indução. Abra o fluxo isoflurane a uma taxa de 0,5% e, em seguida, lentamente aumente-o até 5% ao longo de aproximadamente 5 min até que o mouse tenha perdido seu reflexo de redomentação²².
   5. Remova o animal da câmara de indução. Transfira imediatamente o animal para um circuito não rebreathing com um cone de nariz apropriadamente dimensionado. Mantenha a anestesia do camundongo com isoflurane 1% durante todo o tempo de cirurgia.
   6. Confirme se o mouse está totalmente anestesiado beliscando sua cauda e patas. Quando o mouse não reage a beliscar a cauda e as patas, significa que o mouse está completamente anestesiado.
   7. Raspe a cabeça do rato usando uma tesoura. Limpe a pele do rato usando um cotonete com clorexidina 2% e remova todo o cabelo.
   8. Conserte a cabeça do mouse no quadro estereotaxic.
   9. Coloque um protetor de córnea em ambos os olhos de rato usando um cotonete. Para evitar a indução de estresse em outros roedores, evite a presença de qualquer outro rato na sala de cirurgia²³.
2. A cirurgia (aproximadamente 30 min)
   1. Limpe a cabeça do rato com três balas de 2% de clorexidina seguidas de 70% de etanol. Exponha o crânio usando material cirúrgico e faça um fino orifício com uma broca nas seguintes coordenadas: anteroposterior −2,8 mm, e mediolateral 1,4 mm em relação à linha medial.
   2. Coloque a agulha de uma seringa de 10 μL no orifício e mova a agulha dentro do cérebro lentamente até chegar a −7,2 mm dorsoventral em relação à dura²⁴.
   3. Deixe a agulha na posição final por 2 minutos para permitir que o tecido se acomode um pouco, e, em seguida, injetar 1 μL de AAV5-CBA-hαSyn (AAV-hαSyn), AAV5-CBA-eGFP (AAV-GFP) ou veículo (PBS em pH 7.4; cirurgia falsa) na substantia nigra direita a uma taxa de 0,2 μL/30 s.
   4. Deixe a agulha na mesma posição por 5 minutos após a entrega de vetores virais e, em seguida, retire-a lentamente.
3. Pós-cirurgia (aproximadamente 5 min)
   1. Feche a ferida usando uma sutura não absorvível trançada de seda estéril.
   2. Coloque o mouse na gaiola de casa pré-armado colocando-o sobre um colchão aquecido elétrico (25 °C).
      NOTA: O rato deve ser mantido sozinho na gaiola doméstica até que ele seja capaz de andar sem dificuldade e a ferida tenha cicatrizado.

2. Determinação do desempenho do motor usando o teste de feixe

1. Treinamento (aproximadamente 15 minutos por mouse)
   1. Doze semanas após a cirurgia estereotaxa, avalie o desempenho do motor usando uma versão simplificada do teste de feixe descrito antes dos²⁵ anos. Para isso, utilize um feixe horizontal de 25 cm de comprimento e 3 cm de largura. A superfície do feixe deve ser coberta com uma grade metálica com quadrados de 1 cm e elevada 1 cm acima do feixe.
   2. Faça um vídeo do mouse atravessando o feixe de superfície da grade de uma extremidade para a extremidade oposta do feixe, onde a gaiola doméstica está localizada. Treine o mouse por 2 dias antes da determinação do desempenho do motor.
   3. No primeiro dia, treine o rato para andar pela viga cinco vezes sem a grade.
   4. No segundo dia, treine o mouse para caminhar pela viga na presença da grade cinco vezes.
2. O teste (aproximadamente 5 minutos por mouse)
   1. No terceiro dia, avalie o desempenho do motor. Para isso, quantifique o número de erros realizados pelas patas esquerdas ou pelas patas direitas separadamente assistindo os vídeos no modo slow-motion.
      NOTA: Um erro é definido como quando uma pata não pisa corretamente na grade e, portanto, torna-se visível na lateral da grade ou entre a grade e a superfície do feixe.

3. Processamento de tecidos

1. Perfusão transcárvia (aproximadamente 15 minutos por rato)
   1. Para anestesiar o camundongo, injete uma mistura de cetamina (80 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) intraperitoneal (i.p.) usando uma seringa de 1 mL e agulha de 27 G²⁶.
   2. Uma vez que o rato esteja completamente anestesiado (confirmado como na etapa 1.1.6.), abra o tórax com material cirúrgico e exponha o coração.
   3. Em seguida, insira uma agulha de 21 G (faça a ponta plana usando uma broca) no ventrículo esquerdo do coração.
   4. Ao acoplar a agulha a um tubo, perfuse 50 mL de PBS (pH 7.4) a uma taxa de 9,5 mL/min usando uma bomba peristáltica.
2. Fixação e crioproteção do cérebro (aproximadamente 10 minutos por cérebro)
   1. Remova o cérebro usando tesouras e pinças e, em seguida, fixe-o por imersão em 5 mL de 4% de paraformaldeído em PBS (pH 7.4) a 4 °C por 24 h.
   2. Depois, coloque o cérebro fixo em 15 mL de 30% de sacarose a 4 °C por 48 h.
   3. Em seguida, coloque o cérebro em 4 mL de solução de crioproteção (20% de glicerina e 2% DMSO em PBS) e salve o cérebro a −80 °C ou use-o imediatamente na etapa seguinte.
3. Obtenção de fatias cerebrais (aproximadamente 20 min por cérebro).
   NOTA: Certifique-se de que o cérebro é colocado em uma criostata em uma posição adequada para fazer cortes coronais.
   1. Para obter fatias de SN, corte o cérebro em seções de 40 μm de espessura, começando em −2,92 mm e terminando em −3,64 mm²⁴.
   2. Colher cada fatia em um poço (contendo 1 mL de solução de crioproteção) de uma placa de 24 poços seguindo uma ordem anteroposterior como descrito antes^de 25,27,28.
   3. Para realizar análises imunohistoquímicas (seção 4.) e imunofluorescência (seção 5.) no SN, escolha seis seções coronais de SN tomadas em intervalos uniformes (120 μm) que cobrem toda a extensão rostrocaudal do núcleo (720 μm no total), conforme descrito antes^de 25,27,28.
   4. Para obter fatias estriais, corte o cérebro em seções de 40 μm de espessura, começando em +1,34 mm e terminando em −0,26 mm²⁴.
   5. Colher cada fatia em um crioboto de 2 mL (contendo 1 mL de solução de crioproteção) seguindo uma ordem anteroposterior.
   6. Para realizar análises imunohistoquímicas (seção 4.) e imunofluorescência (seção 5.) no estriato, escolha cinco seções estriais coronais tomadas em intervalos uniformes (320 μm) que cobrem toda a extensão rostrocaudal do núcleo (1600 μm no total).

4. Análise imunohistoquímica para quantificar neurônios dopaminérgicos e microgliose (aproximadamente 2 dias)

1. Para análise imunohistoquímica de fatias estriárias ou nigrais, coloque o conjunto de cinco (estriato) ou seis (SN) fatias do mesmo cérebro em um poço de uma placa de 24 poços.
2. Lave as seções 3x com 1 mL de PBS e, em seguida, incubar com 0,5 mL de 0,03% H₂O₂ em metanol à temperatura ambiente e com agitação por 30 minutos para inativar atividade peroxidase endógena.
3. Lave as seções 3x com 1 mL de PBS e incuba com 0,5 mL de solução de bloqueio (4% soro de cabra, 0,05% Triton X-100 e 4% BSA em PBS) em temperatura ambiente e com agitação por 40 min.
4. Depois, incubar com 0,5 mL de solução de bloqueio contendo o anticorpo primário (altivexa-trosina de coelho [TH] pAb diluído 1:1000 [ver Tabela 1]; ou anticorpo anti-Iba1 de coelho diluído 1:1000) à temperatura ambiente e com agitação durante a noite.
5. Lave as seções 3x com 1 mL de PBS e incuba com 0,5 mL de solução de bloqueio contendo anti-coelho de cabra biotiningada pAb (1:500, ver Tabela 1) à temperatura ambiente e com agitação por 2h.
6. Em seguida, lave as seções 3x com 1 mL de PBS e incubar com 0,5 mL de avidin conjugado peroxidase (1:5000, ver Tabela 1) em solução de bloqueio à temperatura ambiente e com agitação por 90 min.
7. Lave as seções 3x com 1 mL de PBS e incubar com 0,5 mL de solução de substrato (0,05% diaminobenzidina em 0,03% H₂O₂/Trizma-HCl tampão em pH 7.6). Use luvas e um jaleco para este passo, já que a diaminobenzidina é um potencial cancerígeno.
8. Quando a coloração específica for evidente (tipicamente 30 seg para TH e 5 min para Iba1), pegue a solução do substrato e lave as seções 3x com 1 mL de PBS à temperatura ambiente e com agitação. Sempre realize a imunostaining de fatias de todos os cérebros incluídos no mesmo experimento simultaneamente.
   NOTA: A coloração específica do TH é evidente quando a imunossuagem de TH aparece na área do SN, que exibe uma forma característica no cérebro. A marca específica do Iba1 é determinada quando a imunostaining Iba1 aparece em fatias cerebrais de controle com formas microgliais típicas, que são confirmadas após observação de microscópio. Desta forma, o tempo exato de exposição de substrato para análise de IHC é determinado para cada experimento.
9. Monte as seções cerebrais em lâminas de vidro usando uma solução de 0,2% de gelatina em 0,05 M Tris (pH 7.6). Coloque cada conjunto de cinco (estriato) ou seis (SN) fatias obtidas do mesmo cérebro na ordem rostrocaudal no mesmo slide de vidro.
10. Quantifique o número de neurônios TH⁺ no SN.
    1. Para quantificar os neurônios TH⁺ no SN, adquira fotos das seis fatias a ampliação de 20x usando um microscópio de campo brilhante, como descrito antes^de 25,27,28. Use o seguinte ajuste de cor: temperatura de cor 3200 K, ciano-vermelho 40%, magenta-verde 39%, amarelo-azul 54%, gama 0,5, contraste 37, brilho 13, saturação 5.
    2. Usando o software Image J, selecione o perímetro do SN pars compacta no hemisfério analisado. Evite a seleção de neurônios TH⁺ da área tegmental ventral (VTA).
    3. Depois, peça ao software para calcular a área selecionada (tipicamente 0,04-0,07 mm²/hemisfério, dependendo da posição rostrocaudal). Em seguida, usando a ferramenta de vários pontos, marque cada neurônio TH⁺ com um ponto.
    4. Usando a ferramenta de ponto, peça ao software para contar o número total de pontos. Com o número de pontos totais (neurônios TH⁺ ) e a área do SNpc, calcule a densidade de neurônios TH⁺ /mm².
    5. Repita o mesmo cálculo em ambos os hemisférios nas seis fatias de SN e, em seguida, calcule a média dos neurônios TH⁺ /mm² nos lados ipsilateral e contralateral.
11. Quantifique o número de microglia ativada no estriato
    1. Para quantificar a microglia ativada no estriado, adquira duas fotos em cada hemisfério para todas as cinco fatias estriadas a 20x de ampliação usando um microscópio de campo brilhante e as mesmas configurações indicadas na etapa 4.10.1. Usando o software Image J, em cada foto (exibindo uma área de 660 μm x 877 μm), marque com um ponto cada célula expressando alta intensidade Iba1 e forma de ameboid usando a ferramenta multiponto. Usando a ferramenta de ponto, peça ao software para contar o número total de pontos.
    2. Com o número de pontos totais e a área da foto, calcule a densidade de microglia ativada (Iba1^{células altas} /mm²) como realizada antes^{de 29}.

Tabela 1: Diluições de anticorpos. N/A, não aplicável. *, Só é especificado se houver reatividade com camundongos, ratos e humanos, independentemente da reatividade com outras espécies. **, Uma única diluição ou uma faixa de diluição é especificada.

5. Análise de imunofluorescência para avaliar a infiltração de células T na via nigrostriatal (aproximadamente 2 dias)

1. Para análise de imunofluorescência de hαSyn ou TH/GFP em fatias estriais ou nigrais, monte o conjunto de cinco (estriato) ou seis (SN) fatias do mesmo cérebro em um poço de uma placa de 24 poços.
   1. Lave as seções 3x com 1 mL de PBS e, em seguida, incubar com 0,5 mL de solução de bloqueio (0,3% Triton X-100, 0,05% interpolação20 e 5% BSA em PBS) à temperatura ambiente e com agitação por 40 min.
   2. Depois, incubar com 0,5 mL de solução de bloqueio contendo o anticorpo primário (coelhinho anti-TH pAb diluído 1:500; ou anticorpo anti-hαSyn de coelho diluído 1:150, ver Tabela 1) à temperatura ambiente e com agitação durante a noite.
2. Lave as seções 3x com 1 mL de PBS e incubar com 0,5 mL de solução de bloqueio contendo anticorpo secundário anti-coelho AlexaFluor546 (1:500, ver Tabela 1) e 4′,6-diamidino-2-fenillindole (DAPI; 1:1000) à temperatura ambiente e com agitação para 2 h. Em seguida, lave as seções 3x com 1 mL de PBS.
3. Monte as seções cerebrais em lâminas de vidro como descrito acima (passo 4.9.). As imagens foram adquiridas com um microscópio de fluorescência invertido acoplado a uma unidade de alimentação.
4. Para a análise de imunofluorescência de TH/CD4/GFP (Foxp3) em fatias nigrais, coloque o conjunto de seis (SN) fatias do mesmo cérebro em um poço de uma placa de 24 poços. Lave as seções 3x com 1 mL de PBS e incuba com 0,5 mL de solução de bloqueio (0,5% Triton X-100, 0,5% gelatina de pele de peixe em PBS) à temperatura ambiente e com agitação por 2h.
5. Incubar com 0,5 mL de solução de bloqueio contendo os anticorpos primários coelhinho anti-TH pAb (1:200, ver Tabela 1) e anti-CD4 de rato (1:250) a 4 °C e com agitação durante a noite.
6. Lave as seções 3x com 1 mL de PBS e incubar com 0,5 mL de solução de bloqueio contendo anti-coelho acoplado ao AlexaFluor 647 (1:500, ver Tabela 1) e anti-rato acoplado ao AlexaFluor 546 (1:500) à temperatura ambiente e com agitação por 2h. Em seguida, lave as seções 3x com 1 mL de PBS.
7. Coloque cada conjunto de seis (SN) fatias obtidas do mesmo cérebro na ordem rostrocaudal no mesmo slide de vidro e monte-as usando Fluoromount G. Adquira imagens usando um microscópio Leica DMi8. Use as configurações do microscópio confocal indicada na Tabela 2 para adquirir imagens a partir da análise da imunofluorescência.

Tabela 2: Configurações de microscópio confocal utilizadas para a aquisição de imagens a partir da análise da imunofluorescência.

6. Análise estatística

1. Para comparar os dados obtidos dos lados ipsilateral e contralateral, use um teste t t de duas caudas emparelhado.
2. Para comparar os dados obtidos de camundongos que recebem AAV-hαSyn e de camundongos que recebem AAV-GFP ou cirurgia falsa, use um teste t de um aluno de duas caudas não reparado. Considere diferenças significativas quando os valores P < 0,05.

Validando a correta entrega de vetores AAV nos neurônios dopaminérgicos da via nigrostriatal
Para estudar os processos de neuroinflamação, neurodegeneração e comprometimento motor promovidos pela patologia da sinucleína, foi utilizado um modelo de camundongo da doença de Parkinson induzido pela entrega estereotaxa unilateral da codificação de AAV hαSyn na SN 16,17,30,31 (veja o desenho experimental na Figura Suplementar 1 ). Para validar a correta entrega de vetores AAV nos neurônios dopaminérgicos da via nigrostriatal, a imunorreatividade de codificação AAV (AAV-GFP) foi injetada no SN, e 12 semanas depois, a fluorescência GFP e a imunorreatividade hidroxilase de tyrosina (TH) foram analisadas no SN e estria por imunofluorescência. A fluorescência associada ao GFP foi observada exclusivamente no lado ipsilateral, e houve colocalização significativa com imunoreatividade th tanto no SN quanto no estriado, indicando a entrega correta de vetores AAV nos neurônios dopaminérgicos da via nigrostriatal (Figura 1).

Figura 1: Análise da entrega de AAV-GFP na via nigrostriatal. Os camundongos receberam AAV-GFP (1 x10 10 vg/mouse) e 12 semanas depois foram sacrificados, e o TH foi imunossugado em (A) o SN (barras de escala são de 118 μm) e (B) o estriado (barras de escala são 100 μm). Fluorescência associada ao TH e GFP foram analisadas por microscopia de epifluorescência. Os núcleos estavam manchados com DAPI. Imagens representativas de manchas mescladas ou únicas de TH (vermelho), GFP (verde) e DAPI (azul). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Configuração da dose de vetor viral administrado para induzir neurodegeneração e comprometimento motor no modelo de camundongo da doença de Parkinson induzida por AAV-hαSyn
Para testar a dose de AAV-hαSyn necessária para induzir uma superexpressão significativa de hαSyn que promove a neurodegeneração dos neurônios dopaminérgicos nigral, diferentes doses (1 x 108 genomas virais [vg]/mouse, 1 x 109 vg/mouse, ou 1 x 1010 vg/mouse) de AAV-hαSyn foram injetados, e 12 semanas depois, a imunoreatividade hαSyn e a extensão da imunoreatividade TH foram avaliadas na via nigrostria. Embora a imunoreatividade hαSyn tenha sido evidente com todas as doses testadas no SN (Figura 2), apenas os camundongos que receberam 1 x10 10 vg/rato apresentaram evidente imunorreatividade hαSyn no estriado (Figura 3). Além disso, camundongos que receberam 1 x 1010 vg/mouse de AAV-hαSyn apresentaram uma perda significativa de neurônios dopaminérgicos no SN (Figura 4A,B). Embora os camundongos que receberam 1 x10 10 vg/mouse de AAV-GFP apresentaram um baixo grau (~20%) de perda neuronal (Figura 4A,B), os camundongos que receberam a mesma dose de AAV-hαSyn apresentaram um grau significativamente maior de neurodegeneração de neurônios dopaminérgicos nigral (Figura 4C). Assim, outros experimentos foram realizados utilizando 1 x 1010 vg/mouse de AAV-hαSyn. Além disso, a extensão do comprometimento motor foi determinada em camundongos que receberam diferentes doses de AAV-hαSyn utilizando o teste de feixe (Figura 5A), conforme descrito antesde 25. Uma redução significativa no desempenho do motor foi detectada exclusivamente com 1 x 1010 vg/mouse de AAV-hαSyn no teste de feixe tanto quando comparamos o número de erros cometidos pelas almofadas direita e esquerda (Figura 5B) e ao comparar o número total de erros de ratos que recebem AAV-hαSyn em comparação com os ratos que recebem o vetor de controle AAV-GFP (Figura 5C). Assim, outros experimentos foram realizados utilizando 1 x 1010 vg/mouse de AAV-hαSyn.

Figura 2: Análise da expressão de α-sinucleína humana no SN de camundongos tratados com diferentes doses de AAV-hαSyn. Os camundongos receberam AAV-hαSyn em (A) 1 x 1010 vg/mouse, (B) 1 x 109 vg/mouse, ou (C) 1 x 108 vg/mouse e 12 semanas depois foram sacrificados, e a expressão hαSyn foi analisada pela imunofluorescência no SN usando microscopia de epifluorescência. Os núcleos estavam manchados com DAPI. Imagens representativas de coloração mesclada ou única de hαSyn (vermelho) ou DAPI (azul). As barras de escala são de 118 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Análise da expressão de α-sinucleína humana no estriado de camundongos tratados com diferentes doses de AAV-hαSyn. Os ratos receberam AAV-hαSyn em (A) 1 x 1010 vg/mouse, (B) 1 x 109 vg/mouse, ou (C) 1 x 108 vg/mouse) e 12 semanas depois foram sacrificados, e a expressão hαSyn foi analisada por imunofluorescência na estria usando microscopia de epifluorescência. Os núcleos estavam manchados com DAPI. Imagens representativas de coloração mesclada ou única de hαSyn (vermelho) ou DAPI (azul). Barras de escala são 100 μm. A inserção no canto superior direito das imagens mescladas mostra uma área de interesse em maior ampliação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Perda de neurônios dopaminérgicos do SN em camundongos tratados com diferentes doses de AAV-hαSyn ou vetor de controle. Os ratos receberam AAV-hαSyn (1 x10 10 vg/mouse, 1 x 109 vg/mouse, ou 1 x 108 vg/mouse) ou AAV-GFP (1 x 1010 vg/mouse) e 12 semanas depois foram sacrificados, e o TH foi analisado no SNpc pela imunohistoquímica. (A) Imagens representativas. Barras de escala, 100 μm. (B,C) A densidade dos neurônios foi quantificada como o número de neurônios TH+ /mm2. Os dados representam ± sem. n = 3 a 8 camundongos por grupo. (B) Foi realizada uma comparação do ipsilateral com os lados contralaterais utilizando-se o teste t do aluno emparelhado de duas caudas. (C) Foi realizada uma comparação dos lados ipsilaterais dos camundongos que recebem 1 x10 10 vg/mouse de AAV-hαSyn ou AAV-GFP. (B,C) Considerando que as barras brancas indicam a quantificação de neurônios TH+ no lado ipsilateral dos camundongos que recebem AAV-hαSyn, as barras verdes indicam a quantificação de neurônios TH+ no lado ipsilateral dos camundongos que recebem AAV-GFP. As barras cinzentas indicam a quantificação dos neurônios TH+ no lado contralateral do grupo correspondente. As comparações foram realizadas por um teste t-t de um aluno não-acompanhado de duas caudas. *p < 0,05; **p < 0,01. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Análise do desempenho motor em camundongos tratados com diferentes doses de AAV-hαSyn. Os camundongos receberam doses diferentes (1 x 1010 vg/mouse, 1 x 109 vg/mouse, ou 1 x 108 vg/mouse) de AAV-hαSyn ou AAV-GFP, e 12 semanas depois, o desempenho do motor foi avaliado pelo teste do feixe. (A) Imagem de um rato andando na viga. (B) O número de erros realizados pelos membros esquerdos (contralateral) versus membros direito (ipsilateral) foi quantificado nos grupos de camundongos que recebem AAV-hαSyn. (C) O número total de erros foi comparado entre diferentes grupos experimentais que receberam a mesma dose de AAV-hαSyn ou AAV-GFP. Os dados representam ± SEM. n = 3-5 ratos por grupo. As comparações foram realizadas por (B) um teste t-t de duas caudas emparelhado ou por (C) um teste t de um aluno de duas caudas não remunerado. *p < 0,05; **p < 0,01. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Configuração da cinética do modelo da doença de Parkinson induzida por AAV-αSyn
Após determinar a dose adequada de AAV-hαSyn usada para induzir um nível significativo de neurodegeneração e comprometimento motor, foram realizados experimentos para definir o início da superexpressão hαSyn. Para isso, os camundongos foram tratados com 1 x 1010 vg/mouse de AAV-hαSyn ou cirurgia falsa. A extensão da expressão hαSyn foi analisada no SN uma vez por semana durante as semanas 2-5 após a cirurgia estereotaxa (ver o desenho experimental em Figura Suplementar 2). Os resultados mostram que, apesar da expressão hαSyn ter sido detectada em níveis baixos até 2 semanas após a cirurgia, os clusters hαSyn apareceram na semana 5 após a cirurgia estereotaxa (Figura 6).

Figura 6: Análise do curso temporal da expressão de α-sinucleína humana no SN de camundongos tratados com AAV-hαSyn. Os camundongos receberam AAV-hαSyn (1 x10 10 vg/mouse) ou apenas a falsa cirurgia estereotaxa, e a expressão de hαSyn no SN foi analisada (A) 2 semanas, (B) 3 semanas, (C) 4 semanas, ou (D) 5 semanas depois por imunoorescência usando microscopia de epifluorescência. Os núcleos estavam manchados com DAPI. Imagens representativas de coloração mesclada ou única de hαSyn (vermelho) ou DAPI (azul). Barras de escala, 100 μm. A inserção no canto superior direito das imagens mescladas mostra uma área de interesse em maior ampliação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Posteriormente, foram realizados experimentos para determinar os pontos de tempo adequados para analisar a neuroinflamação e infiltração de células T no sistema nervoso central (SNC) após a entrega estereotipada de AAV-hαSyn. Para determinar o pico de ativação microglial após o tratamento de camundongos com AAV-hαSyn, a extensão das células expressando altos níveis de Iba1 no estriato foi avaliada uma vez por semana durante as semanas 2-15 após a cirurgia estereotaxa. Os resultados mostram um aumento significativo na ativação microglial do lado ipsilateral em comparação com o lado contralateral dos camundongos 15 semanas após o tratamento AAV-hαSyn (Figura 7). O número de células Treg (CD4+ Foxp3+) infiltradas no SNpc também foi avaliado em diferentes momentos após a entrega estereotipada de AAV-hαSyn por imunofluorescência seguida de observação de microscopia confocal. Os resultados mostram que o pico de infiltração de Treg no SNpc foi de 11 semanas após a cirurgia, enquanto a extensão do Treg infiltrando-se nesta área do cérebro foi menor na semana 8 ou semana 13 após a cirurgia (Figura 8). Não foram detectadas células T CD4+ infiltrando-se no estriato (dados não mostrados). Ao todo, esses resultados indicam que, usando 1 x 1010 vg/mouse de AAV-hαSyn, o ponto de tempo mais adequado para analisar a neuroinflamção é a semana 15 após a cirurgia estereotaxa, enquanto um ponto de tempo adequado para analisar a infiltração de células T no CNS parece ser a semana 11 após o tratamento AAV-hαSyn.

Figura 7: Análise do curso temporal de ativação microglial em camundongos inoculados com AAV-hαSyn. Os camundongos receberam AAV-hαSyn (1 x 1010 vg/mouse), e a ativação microglial foi avaliada pela análise imunohistoquímica de Iba1 no estriado em diferentes momentos após a cirurgia. (A) Imagens de visão geral representativas da análise imunohistoquímica de Iba1 de camundongos sacrificados 5 semanas, 10 semanas ou 15 semanas após a inoculação com AAV-hαSyn são mostradas. Barras de escala, 110 μm. (B) A densidade de microglia ativada foi quantificada à medida que o número de células expressando altos níveis de Iba1 e forma de ameboide por área. Os dados representam ± médias SEM. n = 3 camundongos por grupo. Um teste t de duas caudas emparelhado do student foi usado para determinar diferenças estatísticas entre ipsilateral e Iba1 contralateral em cada grupo. *p < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: Análise do curso temporal da infiltração de células T CD4+ no SN de camundongos inoculados com AAV-hαSyn. Os ratos repórteresfoxp3 gfp receberam AAV-hαSyn (1 x 1010 vg/mouse). A presença de células T CD4+ expressando Foxp3 e a presença de neurônios TH+ foram analisadas em diferentes pontos de tempo (semana 8, semana 11 e semana 13 após a cirurgia) no SN por imunofluorescência. (A) Imagens representativas para imunossuperamento único ou a fusão são mostradas. Barras de escala, 100 μm. (B) O número de células CD4+ Foxp3+ T por área no SN foi quantificado. Os dados representam ± SEM média de 3 camundongos por grupo. *p<0,05, células IPSilateral versus Contralateral CD4+ Foxp3+ T por teste t do aluno de duas caudas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Desenho experimental para avaliação do efeito de diferentes doses de vetores de AAV sobre patologia da sinucleína, neurodegeneração e comprometimento motor. Os camundongos C57BL/6 machos do tipo selvagem foram anestesiados e receberam inoculação estereotaxica de diferentes doses (1 x 1010 vg/mouse, 1 x 109 vg/mouse, ou 1 x 108 vg/mouse) de AAV codificando α-sinucleína humana (AAV-hαSyn) ou eGFP (AAV-GFP) sob o controle do promotor CBA na substantia nigra direita (SN). Após 12 semanas, a expressão de GFP e hαSyn no SN e estriatum (Str) foi avaliada por imunofluorescência (IF), células de hidroxilase tyrosina positiva (TH+) foram quantificadas pela imunohistoquímica (IHC) no SN, e o desempenho motor foi avaliado pelo teste de feixe. O número de camundongos em cada grupo experimental é indicado entre parênteses. * indica grupos onde um rato morreu antes das análises. Cada análise indica entre parênteses o número da figura do corpo do papel onde os resultados correspondentes são mostrados. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar 2: Desenho experimental para determinar a cinética da infiltração de células T, neuroinflamação e expressão hαSyn. Os ratos repórteres foxp3gfp foram anestesiados e receberam inoculação estereotaxa de AAV (1 x 1010 vg/mouse) codificando α-sinucleína (AAV-hαSyn) sob o controle do promotor cba na substantia nigra (SN) ou cirurgia falsa (PBS). Os camundongos foram sacrificados em diferentes pontos de tempo, e a expressão de hαSyn no SN e estriatum foi avaliada por imunofluorescência (IF), GFP (Foxp3), CD4 e células hidroxilase positivas de tyrosina (TH+) foram quantificadas pelo IF no SN, e a expressão Iba1 foi analisada pela imunohistoquímica (IHC) no estriatum (Str). O número de ratos em cada grupo experimental é indicado. A faixa de pontos de tempo incluídos em cada análise é indicada. Cada análise indica entre parênteses o número da figura do corpo do papel onde os resultados correspondentes são mostrados. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Os autores declaram que a pesquisa foi realizada na ausência de quaisquer interesses financeiros ou não financeiros concorrentes.