O presente trabalho descreve as etapas para a produção de qPCR pronta para uso para detecção de DNA de T. cruzi que pode ser pré-carregada no vaso de reação e armazenada na geladeira por vários meses.
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Artigo de método
QPCR pronto para uso para detecção de DNA de Trypanosoma cruzi ou outros organismos patogênicos
Neste artigo
Resumo
Resumo
A PCR em tempo real (qPCR) é uma técnica notavelmente sensível e precisa que permite amplificar quantidades minúsculas de alvos de ácido nucleico a partir de uma infinidade de amostras. Tem sido amplamente utilizado em muitas áreas de pesquisa e alcançou aplicação industrial em campos como diagnóstico humano e seleção de características em culturas de culturas de culturas de organismos geneticamente modificados (OGM). No entanto, a qPCR não é uma técnica à prova de erros. A mistura de todos os reagentes em uma única mistura mestra subsequentemente distribuída em 96 poços de uma placa qPCR regular pode levar a erros do operador, como mistura incorreta de reagentes ou dispensação imprecisa nos poços. Aqui, é apresentada uma técnica chamada gelificação, em que a maior parte da água presente na mistura mestre é substituída por reagentes que formam uma mistura sol-gel quando submetida a vácuo. Como resultado, os reagentes de qPCR são efetivamente preservados por algumas semanas à temperatura ambiente ou alguns meses a 2-8 o C. Os detalhes da preparação de cada solução são mostrados aqui, juntamente com o aspecto esperado de uma reação gelificada projetada para detectar oDNA satélite de T. cruzi (satDNA). Um procedimento semelhante pode ser aplicado para detectar outros organismos. Iniciar uma corrida de qPCR gelificada é tão simples quanto remover a placa da geladeira, adicionar as amostras aos seus respectivos poços e iniciar a corrida, diminuindo assim o tempo de configuração de uma reação de placa cheia para o tempo que leva para carregar as amostras. Além disso, as reações de PCR gelificadas podem ser produzidas e controladas quanto à qualidade em lotes, economizando tempo e evitando erros comuns do operador durante a execução de reações de PCR de rotina.
Introdução
A doença de Chagas foi descoberta no início doséculo 20 em regiões rurais do Brasil, onde a pobreza era generalizada 1,2. Ainda hoje, a doença continua ligada aos determinantes sociais e econômicos da saúde nas Américas. A doença de Chagas é bifásica, compreendendo uma fase aguda e uma crônica. É causada pela infecção pelo parasita Trypanosoma cruzi, sendo transmitida por insetos vetores, transfusões de sangue por via congênita ou ingestão oral de alimentos contaminados 3,4.
O diagnóstico da doença de Cha....
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Protocolo
1. Preparação de soluções-mãe e mistura de gelificação
NOTA: Quatro soluções-estoque serão preparadas (400 mg/mL de melezitose, 400 mg/mL de trealose, 0,75 mg/mL de lisina e 200 mg/mL de glicogênio) e misturadas de acordo com a proporção mostrada na Tabela 1 para produzir a mistura de gelificação. Embora o protocolo descreva 10 mL de produção de soluções de estoque, ele pode ser adaptado para volumes menores ou maiores.
- Solução de Melezitose
- Pesar 4 g de melezitose em um tubo de plástico de 15 mL, adicionar 6 mL de água livre de nuclease e vórtice na velocidade máxima do instrumento até que....
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Resultados
Três dos reagentes que formam a mistura de gelificação são facilmente solubilizados após vórtices vigorosos. No entanto, o glicogênio requer vórtice cuidadoso para garantir que o pó tenha sido completamente solubilizado. Infelizmente, o vórtice vigoroso produz muitas bolhas, o que dificulta a determinação do volume real da solução (Figura 1A-B). Portanto, é essencial deixar a solução de glicogênio descansar na geladeira até que a maior parte da solução presa.......
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Discussão
Os últimos anos têm destacado a necessidade de encontrar tecnologias mais sensíveis e específicas para ajudar a diagnosticar doenças tropicais e negligenciadas. Embora importantes para o controle epidemiológico, os testes parasitológicos (microscopia óptica) e sorológicos apresentam limitações, principalmente no que se refere à sensibilidade e aplicabilidade no local de atendimento. Técnicas de amplificação de DNA, como PCR, amplificação isotérmica e respectivas variações, têm sido usadas há muito tempo em ambientes de l.......
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Agradecimentos
Os autores agradecem a Aline Burda Farias pela assistência técnica com o forno a vácuo, bem como à administração do Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP, Curitiba, Brasil) por permitir o acesso aos referidos equipamentos. Este trabalho foi parcialmente financiado pela bolsa CNPq 445954/2020-5.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Sacos de argila bentonita (ativados) | Embamat Global Packaging Solutions (Barcelona, Espanha) | 026157/STD | Não deve ser confundido com pacotes de sílica gel |
| Glicogênio | Amersham Bioscience | Cat# US16445 | |
| Lisina | Acros Organic | Cat# 365650250 | |
| Melezitoze | Sigma-Aldrich | Cat# 63620 | |
| Água | sem nucleasefornecedor | ||
| Oligonucleotídeos | fornecedor | ||
| PCR mastermix | fornecedor preferencial ou Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP, Curitiba, Brasil) | NAT Chagas | |
| PCR termociclador | preferido | ||
| software para forno a vácuo | Memmert Gmbh | Celsius v10.0 | |
| Trealose | Sigma-Aldrich | Cat# T9531 | |
| DNA de Trypanosoma cruzi | de parasitas cultivados internamente, ou comprado de fornecedores credenciados, como ATCC | ||
| Forno a vácuo | Memmert Gmbh | VO-400 |
Referências
- Lewinsohn, R. Carlos Chagas (1879-1934): the discovery of Trypanosoma cruzi and of American trypanosomiasis (foot-notes to the history of Chagas's disease). Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (5), 513-523 (1979).
- Bern, C., et al.
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Reimpressões e permissões
