Investigação espectrométrica de massa multifacetada de neuropeptídeos em Callinectes sapidus

Ashley Phetsanthad; Nhu Q. Vu; Lingjun Li

doi:10.3791/63322

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Artigo de método

Investigação espectrométrica de massa multifacetada de neuropeptídeos em Callinectes sapidus

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DOI:

10.3791/63322

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31 de maio de 2022

Ashley Phetsanthad^*¹ , Nhu Q. Vu^*¹ , Lingjun Li¹^,²

¹Department of Chemistry, University of Wisconsin-Madison, ²School of Pharmacy, University of Wisconsin-Madison

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

A caracterização espectrométrica em massa dos neuropeptídeos fornece informações de sequência, quantitação e localização. Este fluxo de trabalho otimizado não é apenas útil para estudos de neuropeptídeos, mas também para outros peptídeos endógenos. Os protocolos aqui fornecidos descrevem a preparação da amostra, aquisição de MS, análise de MS e geração de neuropeptídeos de banco de dados usando LC-ESI-MS, spotting MALDI-MS e imagens MALDI-MS.

Resumo

Neuropeptídeos são moléculas de sinalização que regulam quase todos os processos fisiológicos e comportamentais, como desenvolvimento, reprodução, ingestão de alimentos e resposta a estressores externos. No entanto, os mecanismos bioquímicos e o complemento completo dos neuropeptídeos e seus papéis funcionais permanecem mal compreendidos. A caracterização desses peptídeos endógenos é dificultada pela imensa diversidade dentro dessa classe de moléculas sinalizadoras. Além disso, neuropeptídeos são bioativos em concentrações 100x - 1000x inferiores aos neurotransmissores e são propensos à degradação enzimática após a liberação sináptica. A espectrometria de massa (MS) é uma ferramenta analítica altamente sensível que pode identificar, quantificar e localizar analitos sem conhecimento a priori abrangente. É adequado para traçar neuropeptídeos globalmente e ajudar na descoberta de novos peptídeos. Devido à baixa abundância e alta diversidade química desta classe de peptídeos, vários métodos de preparação de amostras, parâmetros de aquisição de EM e estratégias de análise de dados foram adaptados a partir de técnicas de proteômica para permitir a caracterização ideal do neuropeptídeo. Aqui, são descritos métodos para isolar neuropeptídeos de tecidos biológicos complexos para caracterização, quantitação e localização de sequências usando cromatografia líquida (LC)-MS e desorpção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI)-MS. Um protocolo para preparar um banco de dados de neuropeptídeo do caranguejo azul, Callinectes sapidus, um organismo sem informações genômicas abrangentes, está incluído. Esses fluxos de trabalho podem ser adaptados para estudar outras classes de peptídeos endógenos em diferentes espécies usando uma variedade de instrumentos.

Introdução

O sistema nervoso é complexo e requer uma rede de neurônios para transmitir sinais através de um organismo. O sistema nervoso coordena informações sensoriais e resposta biológica. As interações complexas e complicadas envolvidas na transmissão de sinais requerem muitas moléculas de sinalização diferentes, como neurotransmissores, esteroides e neuropeptídeos. Como os neuropeptídeos são as mais diversas e potentes moléculas de sinalização que desempenham papéis-chave na ativação de respostas fisiológicas ao estresse e outros estímulos, é de interesse determinar seu papel específico nesses processos fisiológicos. A função neuropeptídeo está relacionada à sua estrutura de....