Visualizando mudanças no Circuito Neuron-Glia com a Técnica de Imagem de Cálcio

Resumo

A imagem celular de cálcio é uma metodologia versátil para estudar a sinalização dinâmica de células individuais, em populações mistas na cultura ou mesmo em animais despertados, com base na expressão de canais/receptores permeáveis de cálcio que dão assinaturas funcionais únicas.

Resumo

Aqui, relatamos modelos in vitro seletivos de circuitos baseados em glia (astrócitos, oligodendrócitos e microglia) e/ou neurônios de tecidos periféricos (gânglios raiz dorsal) e centrais (córtex, zona subventricular, organoide) que são estudados dinamicamente em termos de mudanças de cálcio. O modelo escolhido para ilustrar os resultados é a retina, um tecido simples com interações celulares complexas. O cálcio é um mensageiro universal envolvido na maioria dos papéis celulares importantes. Explicamos em um protocolo passo-a-passo como as células neuron-glial da retina na cultura podem ser preparadas e avaliadas, imaginando mudanças de cálcio. Neste modelo, diferenciamos neurônios da glia com base em sua resposta seletiva ao KCl e ATP. Receptores e canais permeáveis de cálcio são expressos seletivamente em diferentes compartimentos. Para analisar as respostas de cálcio, usamos mortes fluorescentes racionmétricas como fura-2. Esta sonda quantifica a concentração gratuita de ^Ca2+ com base em formas ligadas a ^Ca2+e ^Ca2+, apresentando dois picos diferentes, fundadas na intensidade de fluorescência percebida em dois comprimentos de onda.

Introdução

Devido às propriedades universais do cálcio como segundo mensageiro, este íon está envolvido em um grande número de atividades de sinalização: transcrição genética, nascimento e morte, proliferação, migração e diferenciação, transmissão sináptica e plasticidade. Assim, um método capaz de rastrear a dinâmica de ativação de cálcio com fidelidade e agilidade forneceria uma maneira de observar respostas espaciais-temporais únicas. Tal método é a técnica de imagem de cálcio celular, que correlaciona dados funcionais de cálcio com fenótipos celulares específicos com base em suas respostas distintas.

As sondas ^Ca2+ foram desenvolvidas p....

Protocolo

Todos os experimentos envolvendo animais foram aprovados e realizados seguindo as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais da Universidade Federal do Rio de Janeiro, seguindo os "Princípios do Cuidado Animal Laboratorial" (NIH, Bethesda, EUA); permitir o número IBCCF-035 para ovos de galinha leghorn branco fertilizados.

1. Preparação de soluções

1. Prepare a solução Krebs: (132 mM NaCl, 4 mM KCl, 1,4 mM _MgCl2, 2,5 mM _CaCl2, 6 mM de glicose, 10 mM HEPES, pH 7.4, 373 mOsm).
2. Prepare o tampão salino (solução livre ^Ca2+ e ^Mg2+ - CMF): 76,55 g/L Na....

Resultados

Aqui, usamos células de retina na cultura a partir de filhotes embrionários do dia 8 para investigar como neurônios e glia sinal em termos de mudanças de cálcio. As culturas foram preparadas essencialmente como ^{descritas15,19} como células neurônio-glial mistas (a uma densidade de ≥ 1 x ¹⁰⁶ célula/prato) em um estágio de 7 dias in vitro (Figura 1A). Alternativamente, células neuronais enriquecidas preparadas em baixa densid.......

Discussão

Usamos o tecido da retina para mostrar que as respostas de cálcio mediadas por KCl ou ATP são claramente compartimentadas em respostas neuronais e gliais, respectivamente (Figura 1). Embora alguns dados na literatura impliquem que os receptores P2X7 sejam expressos em neurônios, que regulam a atividade neuronal e a liberação de neurotransmissores sinápticos20, outros autores questionam a existência de receptores P2X7 neuronais. De fato, os resultados atuais sustentam .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
lamínula de 15 mm	Paul Marienfeld GmbH & Co. KG	111550	Suporte de célula
Filtro passa-longo de 510 nm	Carl Zeiss
ATP	Sigma	A1852
B-27 Suplemento	Gibco	17504044	Suplement
CaCl2	Sigma-Aldrich	C8106
CoolSNAP digital câmera	Roper Scientific, Trenton, NJ
D-(+)-Glucose	Neon	1466
DMEM/ F-12	Gibco	12400-24	Meio de cultura de células
Excel Software	Microsoft
Fetal Calf Serum	Sigma-Aldrich	F9665	Suplement
Fluorescence Microscope	Axiovert 200; Carl Zeiss	B 40-080
Fura-2 AM	Sondas Moleculares	F1221	Indicador Raciométrico Ca2+
Sulfato de Gentamicina	Calbiochem	1405-41-0	antibióticos
HEPES	Sigma	H4034
KCl	Sigma	P5405
KH2PO4	Sigma	P5655
Lambda Aparelho DG-4	Sutter Instrument, Novato, CA	DG-4PLUS/OF30
Laminin	Gibco	23017-015	Ajuda à adesão celular
Software Metafluor	Universal Imaging Corp. West Chester, PA
MgCl2	Sigma	M4880
Na2HPO4	Vetec	129
NaCl	Isofar	310
NaHCO3	Vetec	306
Plataforma PH3	Warner Intruments, Hamden, CT	64-0286
Sondas Moleculares Plurônicas F-127		P6866	não iônicas, surfactante
Poli-L-lisina	Sigma-Aldrich	P8920	Ajuda na adesão celular
Tripsina-EDTA 0,25%	Gibco	25200056	enzima de dissociação