A cirurgia estereotaxa para atingir locais cerebrais em camundongos geralmente envolve acesso através dos ossos do crânio e é guiada por marcos do crânio. Aqui descrevemos uma abordagem estereotaxa alternativa para atingir o tronco cerebral caudal e a medula espinhal cervical superior através da cisterna magna que se baseia na visualização direta de marcos do tronco cerebral.
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Artigo de método
Abordagem Cirúrgica Estereotaxic para Microinpor o Tronco Cerebral Caudal e Medula Espinhal Cervical Superior através da Cisterna Magna em Camundongos
Neste artigo
Resumo
Resumo
A cirurgia estereotaxa para atingir locais cerebrais em camundongos é comumente guiada por marcos do crânio. O acesso é então obtido através de orifícios de rebarba perfurados através do crânio. Esta abordagem padrão pode ser desafiadora para alvos no tronco cerebral caudal e cordão cervical superior devido a desafios anatômicos específicos, pois esses locais são distantes de marcos do crânio, levando à imprecisão. Aqui descrevemos uma abordagem estereutílica alternativa através da cisterna magna que tem sido usada para atingir regiões discretas de interesse no tronco cerebral caudal e cordão cervical superior. A cisterna magna estende-se do osso occipital até o atlas (ou seja, o segundo osso vertebral), é preenchida com fluido cefalorraquidiano, e é coberta por dura mater. Esta abordagem fornece uma rota reprodutível de acesso a estruturas selecionadas do sistema nervoso central (CNS) que são de outra forma difíceis de alcançar devido a barreiras anatômicas. Além disso, permite a visualização direta de marcos do tronco cerebral nas proximidades dos locais alvo, aumentando a precisão ao fornecer pequenos volumes de injeção para regiões restritas de interesse no tronco cerebral caudal e cordão cervical superior. Por fim, essa abordagem oferece uma oportunidade de evitar o cerebelo, que pode ser importante para estudos motores e sensoriais.
Introdução
Cirurgia estereotaxa padrão para atingir locais cerebrais em camundongos1 geralmente envolve fixação do crânio usando um conjunto de barras de ouvido e uma barra de boca. As coordenadas são então estimadas com base em atlas de referência 2,3, e marcos do crânio, ou seja, bregma (o ponto onde as suturas dos ossos frontais e parietal se unem) ou lambda (o ponto onde as suturas dos ossos parietal e occipital se unem; Figura 1A,B). Através de um orifício de rebarba no crânio acima do alvo estimado, a região alvo pode então ser alcançada, seja p....
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Protocolo
O autor declara que o protocolo segue as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Beth Israel Deaconess Medical Center.
1. Preparação de instrumentos cirúrgicos e quadro estereotaxic
NOTA: A cirurgia é realizada em condições assépticas. A esterilidade é mantida usando a técnica de ponta estéril.
- Instale o braço estereotaxic com uma micropipette ou seringa preenchida com uma opção injetável (vírus associado ao Adeno (AAV) ou rastreador convencional) no quadro estereotaxico e prepare o adaptador do mouse (Figura 2A).
- Prepar....
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Resultados
A abordagem cisterna magna torna possível atingir estruturas cerebrais caudais e cordões cervicais superiores que são de outra forma difíceis de alcançar através de abordagens estereotaxas padrão ou são propensas a alvos inconsistentes. A cirurgia para chegar à cisterna magna requer incisões da pele, uma fina camada de músculo trapézio, e abertura da dura mater e, portanto, bem tolerada por camundongos. É especialmente eficiente e menos invasivo ao atingir múltiplos locais (longitudinalmente dispersos ou bilater.......
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Discussão
A cirurgia estereóxica padrão geralmente depende de marcos do crânio para calcular as coordenadas dos locais alvo no CNS1. Os locais alvo são então acessados através de orifícios de rebarba que são perfurados através do crânio1. Este método não é ideal para o tronco cerebral caudal, pois os locais alvo estão localizados distantes dos marcos do crânio nos planos anteroposterior e dorsoventral2 e como a anatomia do crânio e músculos sobreposto.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por R01 NS079623, P01 HL149630 e P01 HL095491.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Almofada de álcool | Med-Vet International | SKU: MDS090735Z | preparação da pele para a prevenção da infecção do sítio cirúrgico |
| Fórceps angular, Dumont #5/45 | FST | 11251-35 | apenas para agarrar dura |
| Almofada Betadine | Med-Vet International | SKU: PVP-Pad | preparação da pele para a prevenção da infecção do sítio cirúrgico |
| Subunidade de toxina cólera-b, conjugado Alexa Fluor 488/594 | Thermo Fisher Scientific | 488: C34775, 594: C22842 | Rastreador fluorescente |
| Clippers | Wahl | Modelo MC3, 28915-10 | para raspar pêlos no local cirúrgico |
| Suporte de eletrodo com grampo de canto | Kopf | 1770 | para segurar pipeta de vidro |
| Medidor de vazão | Instrumentos Gilmont | modelo # 65 MM | para regular o fluxo de isoflurano e oxigênio para o camundongo no plano cirúrgico |
| Microesferas fluorescentes, poliestireno | Thermo Fisher Scientific | F13080 | Rastreador fluorescente |
| Almofada de aquecimento | Stoelting | 53800M | termorregulação |
| Câmara de indução com kit de conexão de porta | Midmark Inc | 93805107 92800131 | câmara fornecendo anestesia inicial |
| Seringa de Insulina | Exelint International | 26028 | para administrar solução salina e analgésico |
| Isoflurano | Med-Vet International | SKU:RXISO-250 | anestésico inalante |
| Isoflurane Matrix VIP 3000 vaporizador | Midmark Inc | 91305430 | aparelho para administração de anestésico inalante |
| Pinça de laminectomia, Dumont # | FST | 11223-20 | apenas para limpar dura |
| Ar medicinal, comprimido | Linde | UN 1002 | usado com estimulador & PicoPump para fornecer ar para injeção de solução de precisão |
| Meloxicam SR | Zoo Pharm LLC | Lote # MSR2-211201 | analgésico |
| Microhematócrito tubo capilar pré-calibrado de vidro borosilicato | Globe Scientific Inc | 51628 | para transfecção de material para coordenadas designadas |
| Adaptador de mouse | Stoelting | 0051625 | adaptação de estrutura estereotáxica de rato para cirurgia de camundongo |
| Porta-agulha, Estudante Halsted- Mosquito Hemostáticos | FST | 91308-12 | para sutura |
| Regulador de oxigênio | Produtos de suporte à vida | S/N 909328, lote 092109 | regular os níveis de oxigênio do tanque de oxigênio |
| Tanque de oxigênio, comprimido | Linde | USP UN 1072 | fornecido junto com a anestesia de isoflurano |
| Cartão de plástico | não aplicável | não aplicável | a qualquer cartão de plástico firme, cortado para caber na estrutura estereotáxica (por exemplo, cartão de identificação) |
| PicoPump pneumático (ou similar) | World Precision Instruments (WPI) | SYS-PV820 | Para injeção de solução de precisão |
| Solução salina, estéril | Equipamento médico de montanha | H04888-10 | para substituir fluidos corporais perdidos durante a cirurgia |
| Cabo de bisturi, # 3 | FST | 10003-12 | para segure bisturi |
| Tesoura, Wagner | FST | 14070-12 | para cortar sutura de polipropileno |
| Tesoura de mola, Vannas 2,5 mm com caixa de acompanhamento | FST | 15002-08 | tesoura apenas para abrir dura-máter, caixa para elevar o corpo |
| Micromanipulador estereotáxico | Kopf | 1760-61 | anexado ao suporte do eletrodo para ajustar a posição com base nas coordenadas |
| Conjunto de estrutura estereotáxica em 'U' e placa de base intracelular | Kopf | 1730-B, 1711 | estrutura para cirurgia |
| Aplicadores estéreis com ponta de algodão | Puritan | 25-806 10WC | absorvendo sangue do campo cirúrgico |
| Cortinas estéreis não fenestradas | Henry Schein | 9004686 | para campo cirúrgico estéril |
| Pomada oftálmica estéril | Puralube | P1490 | ocular lubrificante |
| Estimulador & Tubing | Grass Medical Instruments | S44 | para fornecer ar pré-endurecido controlado para injeção de solução de precisão |
| Lâmina Cirúrgica #10 | Med-Vet International | SKU: 10SS | para incisão na pele |
| Pinça cirúrgica, Graefe extra fina | FST | 11153-10 | para segurar a pele |
| Luvas cirúrgicas | Med-Vet International | MSG2280Z | para cirurgia |
| aséticaMicroscópio cirúrgico | Leica | Modelo M320/ F12 | para ampliação de 5X-40X do sítio cirúrgico |
| Sutura 5-0 polipropileno | Oasis | MV-8661 | para fechar a pele |
| Tegaderm | 3M | 3M ID 70200749250 | fornece barreira estéril |
| Grampo universal e poste de suporte | Kopf | 1725 | preso à estrutura estereotáxica em U e à placa de base intracelular |
| Gancho de ferida com hemostáticos hartman | FST | 18200-09, 13003-10 | para separar os músculos e fornecer janela cirúrgica |
Referências
- JoVE. Rodent Stereotaxic Surgery. JoVE Science Education Database. , Neuroscience (2021).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (2001).
- Lein, E. S., et al.
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Reimpressões e permissões
