O presente protocolo descreve a injeção intracerebroventricular (ICV) de zebrafish adulto com neurotóxifo 6-hidroxydopamina (6-OHDA) no diencephalon ventral (Dn) e a avaliação do prejuízo e posterior recuperação da pós-colisão do comportamento de natação usando o teste do tanque aberto, que é acompanhado pela análise usando um software de rastreamento de vídeo.
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Artigo de método
Avaliação locomotor de 6-Hidroxidopamina-induzido Modelo de Doença de Parkinson baseado em Zebrafish
Neste artigo
Resumo
Resumo
As limitações dos tratamentos atuais para retardar a perda neuronal dopaminérgica na doença de Parkinson (DP) aumentam a necessidade de terapias alternativas que possam restaurar esses neurônios. Atualmente, muito esforço é direcionado para uma melhor compreensão da neuroregeneração usando modelos in vivo pré-clínicos. Esta capacidade regenerativa para auto-reparação é, no entanto, ineficiente em mamíferos. Animais não mamíferos como o zebrafish emergiram como um excelente modelo neuroregenerativo devido à sua capacidade de se auto-renovar continuamente e ter uma homologia cerebral próxima aos humanos. Como parte do esforço para elucidar eventos celulares envolvidos na neuroregeneração in vivo, estabelecemos o modelo de DP baseado em zebrafish adulto induzido por 6-OHDA (6-OHDA). Isso foi conseguido através da microinjeção intracerebroventricular otimizada (ICV) de 99,96 mM 6-OHDA para especificamente ablate neurônios dopaminérgicos (DpN) no diencephalon ventral (Dn) do cérebro de zebrafish. A imunofluorescência indicou mais de 85% da ablação da DPN no terceiro dia de pós-seção e restauração total da DPN no local lesionado 30 dias de pós-estação. O presente estudo determinou o comprometimento e posterior recuperação do comportamento de natação de zebrafish após a lesão, utilizando-se o teste de campo aberto através do qual foram quantificados dois parâmetros, distância percorrida (cm) e velocidade média (cm/s). A locomoção foi avaliada pela análise das gravações de peixes individuais de cada grupo (n = 6) utilizando software de rastreamento de vídeo. Os achados mostraram uma redução significativa (p < 0,0001) na velocidade (cm/s) e distância percorrida (cm) de zebrafish lesionado 3 dias após a pós-lesão quando comparado com sham. O zebrafish lesionado apresentou recuperação completa do comportamento de natação 30 dias após a pós-seção. Os presentes achados sugerem que o zebrafish adulto lesado 6-OHDA é um excelente modelo com qualidade reprodutível para facilitar o estudo da neuroregeneração em PD. Estudos futuros sobre os mecanismos subjacentes à neuroregeneração, bem como fatores intrínsecos e extrínsecos que modulam o processo podem fornecer informações importantes sobre novas estratégias de tratamento de substituição celular contra a DP.
Introdução
A doença de Parkinson (DP), doença caracterizada pela rigidez muscular, tremor de repouso e bradiquinia, é a doença neurológica que mais cresce no mundo1,2. O risco e a prevalência da DP aumentam rapidamente com a idade, especialmente em indivíduos com 50 anos ou mais de 3 anos. A etiologia e a patogênese da DP até agora permanecem mal compreendidas. Isso muitas vezes deixou o início precoce do PD sem diagnóstico. Atualmente, a falta de dopamina e a perda de neurônios dopaminérgicos (DP) em pacientes com DP estão fortemente ligados à manifestação dos sintomas motores4<....
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Protocolo
O presente estudo foi aprovado pela Comissão de Pesquisa e Ética Animal (CARE), Universidade Technologi MARA (UiTM) [Referência nº: UiTM CARE 346/2021, com data de 7 de maio de 2021].
NOTA: Foram utilizados os protocolos publicados22,25,26 para a criação padrão e a manutenção do modelo de PD de zebrafish adulto de 6-OHDA. Foram realizados experimentos com zebrafish macho adulto (Danio rerio) com mais de cinco meses de idade com comprimento padronizado de 3,2-3,7 cm.
1. Manutenção de zebrafish e preparações....
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Resultados
O presente experimento avaliou as mudanças no comportamento adulto de natação de zebrafish após a microinjeção do ICV com 6-OHDA. A razão para o uso do 6-OHDA como a neurotoxina escolhida foi devido à sua incapacidade de atravessar a barreira hematoencefálica, que produziu ablação específica e direcionada de DPN na área de diencephalon de interesse-ventral (Dn)16. A subpopulação do DPN aqui tem semelhança anatômica com a subpopulação dpn na substantia nigra pars compacta31 .......
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Discussão
O presente trabalho demonstrou com sucesso a avaliação locomotor do modelo de DP baseado em zebrafish adulto induzido por 6 OHDA. Todo o experimento envolveu três passos principais: preparações de microinjeção pré-ICV, microinjeção de ICV de zebrafish e avaliação locomotor. Para garantir a recuperação saudável dos zebrafish adultos após o procedimento de microinjeção do ICV e o bom resultado experimental, algumas boas práticas para cada etapa foram recomendadas no presente estudo.
Preparação p.......
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Divulgações
Os autores não declaram conflitos de interesse.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Ministério da Educação Superior da Malásia no âmbito do Regime de Bolsas de Pesquisa Fundamental [600-IRMI/FRGS 5/3 (033/2019)].
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Materiais | |||
| 6-Hidroxidopamina (6-OHDA) | Sigma-Aldrich, Missouri, EUA | 162957 | |
| Ácido ascórbico | Thermo Fisher Scientific, Califórnia, EUA | FKC#A/8882/53 | |
| Pipeta pasteur descartável, 3 mL | Thermo Fisher Scientific, Califórnia, EUA | FB55348 | |
| Tubo de microcentrífuga, 0,2 mL | Eppendorf, Hamburgo, Alemanha | 30124332 | |
| Nice frasco cônico, 100 mL | Evergreen Engineering & Resources, Semenyih, Malásia | SumYau0200 | |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS) | Sigma-Aldrich, Missouri, EUA | P4417 | |
| Bicarbonato de sódio | Sigma-Aldrich, Missouri, EUA | S5761 | |
| Cloreto de sódio | Merck, Darmstadt, Alemanha | 106404 | |
| Stereomicroscope | Nikon, Tóquio, Japão | SMZ745 | |
| Tricaine metanossulfonato (MS-222) | Sigma-Aldrich, Missouri, EUA | E10521 | |
| Equipment | |||
| ANY-maze software | Stoelting Co., Illinois, | USA-versão | 7.0; software de rastreamento de vídeo |
| Cubis II Micro Lab Balance | Sartorius, Gö ttingen, Alemanha | SE 2 | |
| FemtoJet IV microinjetor | Eppendorf, Hamburgo, Alemanha | 5192000035 | |
| Femtotip II, capilar de injeção estéril | Eppendorf, Hamburgo, Alemanha | 5242957000 | |
| InjectMan 4 micromanipulador | Eppendorf, Hamburgo, Alemanha | 5192000027 | |
| Lâmpada portátil LED | MR. DIY, Selangor, Malásia | 9023251 | 20 mAh |
| PELCO Pro Superalloy, offset, pontas finas | Ted Pella, Califórnia, EUA | 5367-12NM | |
| Aquecedor de aquário Shanda | Yek Fong Aquarium, Selangor, Malásia | SDH-228 | |
| Termômetro | Sera Precision, Heinsberg, Alemanha | 52525 | |
| Câmera de vídeo | Nikon, Tóquio, Japão | D3100 |
Referências
- Dorsey, E. R., et al. regional, and national burden of Parkinson's disease, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Neurology. 17 (11), 939-953 (2018).
- Maserejian, N., Vinikoor-Imler, L., Dilley, L.
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Reimpressões e permissões
