Um protocolo é descrito para isolar clones de células de melanoma transfectadas de forma estável usando cilindros de vidro. Focamo-nos em conselhos práticos que podem ser decisivos para o sucesso de todo o procedimento.
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Artigo de método
Isolamento de clones de células de melanoma transfectadas de forma estável
Neste artigo
Resumo
Resumo
Populações de células que apresentam mudanças estáveis em suas informações genômicas são amplamente utilizadas pelos cientistas como modelo de pesquisa. Eles não requerem transfecção celular repetida, pois podem levar a uma população celular heterogênea e eficiência de transfecção variável, afetando a reprodutibilidade. Além disso, eles são preferíveis para análises em larga escala. A geração de clones celulares estáveis é útil para uma ampla gama de aplicações, como pesquisa sobre funções gênicas e produção de proteínas recombinantes. Existem alguns métodos para obter uma população de células homogênea após a transfecção transitória inicial. Aqui, descrevemos o isolamento de clones de células únicas com cilindros de vidro. Embora esse método seja conhecido há algum tempo, existem algumas etapas cruciais e negligenciá-las pode levar ao fracasso. Usamos com sucesso este método para obter clones superexpressando de forma estável uma proteína de interesse (POI) ou com nocaute de um gene de interesse (GOI). Descrevemos etapas de preparação, como a otimização da seleção de concentrações de drogas, preparação de cilindros de vidro e validação se os clones obtidos têm a mudança desejada na expressão do GOI por PCR, análise de western blot, imunocoloração ou sequenciamento de gDNA (dependendo do tipo de clones derivados). Também discutimos a heterogeneidade fenotípica de linhagens celulares bem estabelecidas, pois isso pode ser um problema na obtenção de clones celulares estáveis.
Introdução
A transfecção estável de células de mamíferos é um método usado rotineiramente em várias aplicações de cultura de células, incluindo a pesquisa do câncer. Sua vantagem sobre a transfecção transitória é que o material genético estranho introduzido não pode ser perdido devido a fatores ambientais (por exemplo, confluência celular ou estágio de replicação) e divisão celular porque está integrado ao genoma do hospedeiro1. O desenvolvimento de linhagens celulares que expressam de forma estável pode ser trabalhoso e desafiador, mas se uma expressão sustentada de genes for necessária por um longo....
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Protocolo
1. Subcultura e semeadura de células para otimização da concentração de fármacos
- Aqueça o meio de cultura celular (neste caso, o meio de Eagle modificado de Dulbecco com uma concentração reduzida (1,5 g / L) de NaHCO3, 10% (v / v) de soro fetal bovino (FBS), 1% (v / v) de L-glutamina e 1% (v / v) antibiótico-antimicótico) e solução de tripsina em banho-maria a 37 ° C.
- Aspirar e rejeitar o meio de cultura das células A735 que crescem num balão de cultura de células T25. A linhagem celular é obtida de fontes comerciais.
- Lave qualquer meio de cultura celular restante das células....
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Resultados
Usando o protocolo apresentado, fornecemos uma demonstração detalhada do isolamento de clones de células de melanoma transfectadas de forma estável com o método do cilindro de vidro (Figura 1A). Nossos estudos estão relacionados à biologia celular do melanoma, e o modelo de pesquisa mais comum que usamos é a linha de melanoma A375 aderente e altamente invasiva. Como nossa pesquisa mostrou que as células de melanoma produzem gelsolina (GSN) em alto nível em comparação com outros tipos de cânc.......
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Discussão
Fornecemos uma descrição detalhada do isolamento de clones de células de melanoma transfectadas de forma estável com cilindros de vidro. É importante obter clones de controle ao derivar clones com expressão alterada de genes, pois os resultados obtidos para os clones de modificação direcionados devem sempre ser comparados com os resultados obtidos para os controles. Desta forma, podemos verificar se a transfecção em si ou a cultura com um antibiótico seletivo não afeta os resultados dos .......
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Divulgações
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Centro Nacional de Ciência, Polônia (projeto # 2016 / 22 / E / NZ3 / 00654, concedido ao AJM).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubo de centrífuga de 15 ml | GoogleLab Scientific | G66010522 | |
| Placa de cultura de células de 150 mm com grelha de 20 mm | Placa | Falcon 353025 | |
| de 24 poços | VWR International | 10062-896 | |
| Placa de cultura de 35 mm | Eppendorf | EP0030700112 | |
| placa de 6 poços | Eppendorf | EP0030700113 | |
| de 96 poços placa | VWR International | 10062-900 | |
| Solução de ácido acético, 80% | Chempur | 115687330 | |
| Agarose | Prona-Abo | BLE500 | |
| Antibiótico-Antimicótico | Gibco | 15240062 | |
| anticorpos anti-GAPDH | Santa Cruz Biotechnology Inc., | sc-47724 | |
| anticorpos anti-GSN - clone C20 | Santa Cruz Biotechnology Inc., | sc-6405 | |
| anticorpos anti-GSN - clone GS-2C4 | Sigma-Aldrich | G44896 | |
| Albumina de soro bovino (BSA) | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| Color Taq PCR Master Mix (2x) | EurX | E2525 | |
| Controle Duplo Nickase Plasmídeo | Santa Cruz Biotechnology Inc., | sc-437281 | |
| Coverslips | bionovo | 16283 | |
| Dako Meio de montagem | Clontech | S3023 | |
| DMSO - Kit de | A3672,0250 | applichem | |
| EurX | 3555-02 | ||
| burro anti-rato-Alexa Fluor 488 | Invitrogen | # A-21202 | |
| DTT - 1,4-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 10197777001 | |
| EcoRI | Thermo Fisher Scientific | FD0274 | |
| EDTA- ácido etilenodiaminotetracético | Poch (Pol-Aura) | 593280117 | |
| EGTA - etilenoglicol-bis(2-aminoetil éter)- N,N,N',N'-ácido tetracético | Sigma-Aldrich | E0396 | |
| FBS - Soro Fetal Bovino | Gibco | 10270-106 | |
| Gelsolin CRISPR Plasmids | Santa Cruz Biotechnology Inc., | sc-401005-NIC | |
| Formaldeído | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Glicerol | Sigma-Aldrich | L-4909 | |
| glicose alta Dulbecco' s Águia modificada' s meio com concentração reduzida (1,5 g/l) de NaHCO3 | Academia Polonesa de Ciências, Wroc aw, Polônia | 11-500 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| L-Glutamina | Gibco | 25030-024 | |
| Lignina | Bionovo | B-0521 | |
| Lipofectamine 3000 Reagente de Transfecção | Invitrogen | L3000-008 | |
| Na3VO4 | Sigma-Aldrich | S6508 | |
| Na4P2O7 | Sigma-Aldrich | P8010 | |
| NaF | Sigma-Aldrich | 450022 | |
| NEBuilder Ferramenta de Montagem | http://nebuilder.neb.com/#!/ | ||
| pACGFP-C1 | PageRuler da Clontech | ||
| Thermo Fisher Scientific | 26616 | ||
| Perfect 100 bp DNA ladder | EurX | E3134 | |
| faloidina-Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A12380 | |
| Inibidor de fosfatase Cocktail 2 | Sigma-Aldrich | P5726 | |
| Fosfatase Inhibitor Cocktail 3 | Sigma-Aldrich | P0044 | |
| Phusion DNA polimerase de alta fidelidade | Pierce F530S | Thermo Fisher Scientific | |
| Thermo Fisher Scientific | 23225 | ||
| polietilenimina (PEI) | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| inibidor de protease coquetel | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| puromicina | InviviGen | ant-pr | |
| SDS - dodecil sulfato de sódio | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| silicone | CX80 Polska | ||
| Cloreto de sódio - NaCl | Chempur | 7647-14-5 | |
| desoxicolato de sódio | Sigma-Aldrich | D6750259 | |
| sacarose | Poch (Pol-Aura) | PA-06-772090110 | |
| os cilindros de vidro | Sigma-Aldrich | C3983-50EA | |
| Balão de Cultura de Tecidos 25mL | VWR International | 10062-868 | |
| Balão de Cultura de Tecidos 75 cm2 | VWR | 10062-872 | |
| Base Trisma | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| tripsina | Academia Polonesa de Ciências, Wrocaw, Polônia | 20-500 | |
| ureia | Sigma-Aldrich | 8656 | |
| solução de xileno | Chempur | 115208603 |
Referências
- Recillas-Targa, F. Multiple strategies for gene transfer, expression, knockdown, and chromatin influence in mammalian cell lines and transgenic animals. Molecular Biotechnology. 34 (3), 337-354 (2006).
- Wurm, F. M.
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Reimpressões e permissões
Este artigo foi publicado
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