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Artigo de método

Isolamento de clones de células de melanoma transfectadas de forma estável

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DOI:

10.3791/63371

⸱

4 de agosto de 2022

 ,  , 
1Department of Cell Pathology, Faculty of Biotechnology, University of Wrocław

Neste artigo

Resumo

Um protocolo é descrito para isolar clones de células de melanoma transfectadas de forma estável usando cilindros de vidro. Focamo-nos em conselhos práticos que podem ser decisivos para o sucesso de todo o procedimento.

Resumo

Populações de células que apresentam mudanças estáveis em suas informações genômicas são amplamente utilizadas pelos cientistas como modelo de pesquisa. Eles não requerem transfecção celular repetida, pois podem levar a uma população celular heterogênea e eficiência de transfecção variável, afetando a reprodutibilidade. Além disso, eles são preferíveis para análises em larga escala. A geração de clones celulares estáveis é útil para uma ampla gama de aplicações, como pesquisa sobre funções gênicas e produção de proteínas recombinantes. Existem alguns métodos para obter uma população de células homogênea após a transfecção transitória inicial. Aqui, descrevemos o isolamento de clones de células únicas com cilindros de vidro. Embora esse método seja conhecido há algum tempo, existem algumas etapas cruciais e negligenciá-las pode levar ao fracasso. Usamos com sucesso este método para obter clones superexpressando de forma estável uma proteína de interesse (POI) ou com nocaute de um gene de interesse (GOI). Descrevemos etapas de preparação, como a otimização da seleção de concentrações de drogas, preparação de cilindros de vidro e validação se os clones obtidos têm a mudança desejada na expressão do GOI por PCR, análise de western blot, imunocoloração ou sequenciamento de gDNA (dependendo do tipo de clones derivados). Também discutimos a heterogeneidade fenotípica de linhagens celulares bem estabelecidas, pois isso pode ser um problema na obtenção de clones celulares estáveis.

Introdução

A transfecção estável de células de mamíferos é um método usado rotineiramente em várias aplicações de cultura de células, incluindo a pesquisa do câncer. Sua vantagem sobre a transfecção transitória é que o material genético estranho introduzido não pode ser perdido devido a fatores ambientais (por exemplo, confluência celular ou estágio de replicação) e divisão celular porque está integrado ao genoma do hospedeiro1. O desenvolvimento de linhagens celulares que expressam de forma estável pode ser trabalhoso e desafiador, mas se uma expressão sustentada de genes for necessária por um longo período, a derivação de linhagens celulares estáveis é uma opção preferida. O objetivo mais comum da transfecção é estudar as funções de um gene específico ou produto gênico por superprodução ou regulação negativa de sua expressão. No entanto, a produção de proteínas recombinantes e terapias genéticas também requer a introdução de material genético estranho na célula2.

Um clone é definido como uma população de células derivada de uma célula individual. O isolamento de clones unicelulares é um aspecto crucial da biologia celular quando se estudam células com variabilidade genotípica e fenotípica. Três técnicas principais são usadas para derivar clones de células: a técnica de diluição, a técnica de anel de clonagem3 e a técnica de classificação de células4. Cada um tem vantagens e desvantagens. Fornecemos uma descrição detalhada de um método para isolar clones de células de melanoma usando a técnica do cilindro de vidro. A vantagem deste método é que as células exibem crescimento clonal moderado a partir de culturas de células com baixa densidade. Além disso, as células selecionadas já demonstraram capacidade de proliferação porque já formaram colônias5. Este procedimento envolve a semeadura de células transfectadas esparsamente, mas não limitando a diluição, em um grande vaso e permitindo que elas se expandam e formem colônias por 2-3 semanas na presença de um antibiótico seletivo. As colônias individuais podem então ser isoladas usando cilindros de vidro que são colocados sobre as colônias e aderidos ao recipiente usando graxa de silicone. Em seguida, as células são destacadas com tripsina e depois transferidas para placas multipoços para posterior cultura na presença de um meio seletivo.

Existem vários estudos descrevendo o isolamento de clones, mas nos concentramos em mostrar detalhes como o tamanho que os clones devem ter após 2 semanas de seleção, como marcar a localização dos clones durante seu isolamento e como escolher uma concentração apropriada de antibiótico para a seleção. Focamo-nos em conselhos práticos que podem ser decisivos para o sucesso de todo o procedimento. O protocolo apresentado nos permite obter clones celulares estáveis em 2-4 semanas. O método é fácil e barato e não requer equipamentos complicados. Compartilhamos uma técnica que nos permitiu obter muitos modelos de pesquisa, incluindo clones GSN KO 6,7,8.

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Protocolo

1. Subcultura e semeadura de células para otimização da concentração de fármacos

  1. Aqueça o meio de cultura celular (neste caso, o meio de Eagle modificado de Dulbecco com uma concentração reduzida (1,5 g / L) de NaHCO3, 10% (v / v) de soro fetal bovino (FBS), 1% (v / v) de L-glutamina e 1% (v / v) antibiótico-antimicótico) e solução de tripsina em banho-maria a 37 ° C.
  2. Aspirar e rejeitar o meio de cultura das células A735 que crescem num balão de cultura de células T25. A linhagem celular é obtida de fontes comerciais.
  3. Lave qualquer meio de cultura celular restante das células lavando o frasco com 1 mL de tripsina ou solução de PBS.
  4. Aspire e descarte a solução de tripsina ou PBS das células.
  5. Adicionar 1 ml de solução de tripsina ao balão e incubá-lo a 37 °C. Observe cuidadosamente o descolamento das células usando um microscópio invertido.
  6. Pare a atividade da tripsina adicionando 3 mL de meio de cultura de células completo fresco e enxágue o frasco de cultura de células com ele quando as células se desprenderem.
  7. Transferir a suspensão celular do balão para um tubo de centrifugação de 15 ml.
  8. Centrifugue as células a 800 x g por 5 min em temperatura ambiente (RT).
  9. Aspire e descarte o sobrenadante.
  10. Ressuspenda as células em 1 mL do meio de cultura de células frescas.
  11. Para calcular a densidade celular, conte as células com um contador automático de células ou hemocitômetro.
  12. Semeie o número adequado de células em uma placa de cultura de tamanho apropriado.
    NOTA: Neste experimento, 450.000 células da linhagem A375 foram semeadas em 2 mL do meio de cultura celular em uma placa de cultura de 35 mm.

2. Otimização da concentração do medicamento selecionado

  1. Encontre a faixa de concentração recomendada pelo fabricante do medicamento a ser usado para selecionar clones de células estáveis.
    NOTA: Um gene de seleção introduzido em uma célula por transfecção com um vetor genético fornece à célula resistência ao medicamento de seleção. A puromicina na concentração de 1 μg/mL foi utilizada como marcador de seleção para obter expressão estável do vetor genético e eliminar células não transfectadas.
  2. Semeie as células nos poços de uma placa de 96 poços para atingir 50% de confluência no dia seguinte. Prepare três poços para cada concentração de medicamento e um controle não tratado. Semeie 10.000 células por poço. O número de células depende da linhagem celular que está sendo usada e precisa ser determinado empiricamente.
  3. Após 24 h, prepare 10 diluições do medicamento no meio completo, da concentração mais baixa para a mais alta recomendada pelo fabricante, e adicione-as às células.
    NOTA: Neste caso, foi utilizada puromicina. A faixa de concentração foi de 0-10 μg/mL. A cada 3 dias, ou quando muitas células mortas são observadas no meio, mude para meio fresco.
  4. Observe as células diariamente durante uma semana e faça anotações sobre sua confluência, proliferação e morte em relação à placa de controle.
    NOTA: Uma concentração apropriada é aquela em que as células param de proliferar e não causam a morte celular imediatamente, mas matam todas as células tratadas após 48-120 h. No entanto, para algumas combinações de linhagens celulares e medicamentos, pode não haver uma fase em que as células parem de proliferar, mas morram. Em tal situação, a concentração mais baixa de droga que mata todas as células seria apropriada para a seleção.

3. Semeadura e transfecção celular

  1. Semeie as células em um poço de uma placa de seis poços.
    NOTA: O volume final da suspensão celular no meio de cultura celular deve ser de 2,5 mL. Para este experimento, 450.000 células por poço foram semeadas. O número de células precisa ser determinado empiricamente para que sua confluência não exceda 90% após 48 h de semeadura.
  2. Cultivar as células a 37 °C numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO2 durante 24 h.
    NOTA: As células foram cultivadas por 24 h antes da transfecção. No entanto, 48 h após a semeadura, observou-se que as células foram transfectadas de forma mais eficiente.
  3. Aspirar e rejeitar o meio de cultura de células acima das células.
  4. Substitua o meio descartado por meio de cultura de células pré-aquecido sem antibióticos (10% (v / v) FBS, DMEM suplementado com glutamina).
    NOTA: A necessidade de troca do meio de cultura celular se deve ao aumento da permeabilidade celular causado por alguns reagentes de transfecção, o que pode causar um aumento do influxo de antibióticos nas células, resultando na morte celular.
  5. Dilua os reagentes de transfecção em DMEM sem antibióticos e soro. Use polietilenoimina (PEI), reagente de transfecção à base de lipídios ou eletroporação. Para a transfecção celular, utilizar 2 mg/ml de solução de polietilenoimina numa proporção ponderal de 1:2,175 para 4 μg de ADN.
    NOTA: Como solução de DNA, uma mistura de dois plasmídeos foi usada no sistema CRISPR / Cas9 (D10A) com as seguintes sequências de gRNA: 5'ccgggccgtgcagcaccgtg3' e 5'atccagctgcacggtaaaga3'.
  6. Incubar a mistura de transfecção por 30 min em RT.
  7. Após a incubação, adicione cuidadosamente a mistura de transfecção gota a gota às células que crescem nos poços de uma placa de seis poços.
  8. Cultivar as células a 37 °C numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO2 durante 2-6 h.
  9. Mude o meio para o meio de cultura celular completo.
  10. Cultivar as células a 37 °C numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO2 durante as 24 h seguintes.

4. Geração de clones celulares

  1. Tripsinizar e transferir as células transfectadas para uma placa de cultura de 150 mm de diâmetro com uma grelha moldada de 20 mm, de acordo com as instruções da secção 1 do protocolo.
    NOTA: Devido à fusão das células entre si no caso de alta densidade, recomenda-se que as células sejam transferidas uniformemente para duas placas de cultura de células. A grade na placa de cultura ajuda a localizar clones e rastrear sua migração. Em um plano de prato impresso, pode-se marcar posteriormente a localização dos clones (Figura 1B). Além disso, para células que não toleram a remoção do meio e a exposição ao ar (resultando em morte/dano irreversível), seria melhor usar mais placas com uma área de superfície menor para isolar menos colônias de uma placa. Isso pode reduzir o tempo de exposição ao ar durante o isolamento do clone e reduzir a probabilidade de desidratação celular.
  2. Cultivar as células a 37 °C numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO2 durante 24 h.
  3. Mudar o meio de cultura celular para um meio que contenha um antibiótico selectivo.
    NOTA: A partir deste ponto, é importante cultivar as células na presença de um antibiótico seletivo; caso contrário, há uma chance de cortar o transgene integrado do gene.
  4. Troque o meio a cada 3 dias ou quando houver muitas células mortas flutuando no meio.
    NOTA: Neste experimento, as células foram incubadas com puromicina na concentração de 1 μg/mL. A etapa de seleção do clone celular leva aproximadamente 2 semanas. A formação de clones deve ser monitorada observando seu crescimento em microscópio invertido, pois eles não devem crescer e entrar em contato com clones de células vizinhas. As células de uma colônia não podem ser impedidas de migrar e crescer com outra colônia. Portanto, é importante observar a placa para migração celular dos clones e anotar as informações sobre ela no plano da placa.

5. Escolhendo os clones para isolamento

  1. Examine a placa de cultura de células para clones de células sob um microscópio invertido com uma objetiva de 10x ou 20x.
    NOTA: Os clones são compostos por aproximadamente 500-30.000 células. No entanto, depende da linhagem celular utilizada. Uma colônia satisfatória deve ser separada de outras colônias de células e ter tamanho médio, pois clones muito grandes e notáveis podem surgir de mais de uma célula (Figura 1B).
  2. Encontre uma colônia adequada usando o microscópio invertido, examinando cuidadosamente o prato e avaliando os clones encontrados. Coloque o marcador no local do clone selecionado com o marcador no prato embaixo. Simultaneamente, marque a localização da colônia no plano do prato impresso (Figura 1B).
    NOTA: Aproximadamente 20-30 colônias do prato devem ser selecionadas. Às vezes, menos clones de células são obtidos, e todos eles devem ser isolados nesses casos.

6. Preparação de cilindros de vidro

  1. Antes do isolamento dos clones, colocar os cilindros de vidro (6,4 mm de diâmetro e 8 mm de altura) (Figura 1C) na primeira placa de Petri de vidro e autoclavá-los.
  2. Autoclave a segunda placa de Petri de vidro.
  3. Aplique uma fina camada de graxa de silicone no fundo da segunda placa de Petri de vidro autoclavada. Coloque o prato sob um gabinete de fluxo laminar e aplique luz ultravioleta por 30 min para esterilizar a graxa de silicone.
    NOTA: Opcionalmente, a graxa de silicone pode ser autoclavada.
  4. Mergulhe os cilindros autoclavados em uma placa de Petri revestida com graxa de silicone. Agora eles estão prontos para isolar os clones.
  5. Depois de isolar os clones, limpar os cilindros de acordo com as regras aplicáveis ao material celular com o qual são manuseados. No caso de modificação genética, use hipoclorito de sódio para esterilização.
  6. Lave os cilindros com xileno durante a noite para limpá-los da graxa de silicone.
  7. Lave os cilindros com água deionizada sob uma coifa química para remover a solução de xileno.
  8. Coloque os cilindros em uma toalha de papel e deixe secar.
  9. Armazene os cilindros em uma placa de Petri de vidro.
  10. Prepare os cilindros antes do próximo uso, a partir do ponto 1 deste manual.

7. Isolamento de clones

  1. Prepare uma placa de 24 poços contendo 0,5 mL de meio de cultura de células completo pré-aquecido em cada poço.
  2. Lave cuidadosamente as células transfectadas que crescem em um prato de 150 mm três vezes com 15 mL de PBS quente e estéril. Aspire e descarte cuidadosamente o PBS.
  3. Use uma pinça estéril para transferir cilindros que tenham graxa de um lado. Pressione os cilindros no fundo de uma placa de cultura nos locais dos clones marcados para criar poços isolados ao redor das colônias em crescimento de origem de clone unicelular.
    NOTA: O cilindro deve aderir bem ao fundo para evitar vazamento de fluidos.
  4. Adicione 50 μL de solução de tripsina a cada cilindro e incube por alguns minutos. Tenha cuidado para não danificar as células enzimaticamente. Processe as colônias uma a uma. Lembre-se de trocar a ponta da pipeta de cada cilindro para não contaminar as colônias com outras.
    NOTA: O tempo de incubação depende da linha celular que está sendo usada e precisa ser determinado empiricamente. A solução de tripsina pode ser pipetada para cima e para baixo para facilitar o descolamento celular. Monitore cuidadosamente o descolamento da célula usando um microscópio invertido. Após o descolamento celular, interrompa a atividade da tripsina adicionando 50 μL de meio de cultura celular a cada cilindro.
  5. Transfira imediatamente 100 μL da suspensão celular para o meio em um poço de uma placa de 24 poços.
    NOTA: Aqui, o crescimento do clone foi continuado com um antibiótico seletivo na concentração de 0,5 μg / mL.
  6. Monitore o crescimento dos clones celulares na placa de 24 poços e, quando atingirem 90% de confluência, transfira-os para uma placa de seis poços. Siga as instruções na seção 1 do protocolo; alterar apenas os volumes de tripsina (0,5 mL) e meio de parada (1,5 mL).
  7. Monitore os clones celulares que crescem em uma placa de seis poços e, quando atingirem a confluência, transfira-os para o frasco de cultura de células T12.5.
  8. Observe os clones celulares no frasco de cultura de células T12.5 e, quando atingirem a confluência, subcultive e conte-os com um método adequado, como o uso de um contador de células automatizado ou hemocitômetro. Congele metade das células no meio contendo 70% de meio completo com antibiótico seletivo, 20% (v/v) de FBS e 10% (v/v) de DMSO. Semeie o resto das células em lamínulas (12 mm x 12 mm) para imunocoloração e em dois poços de uma placa de seis poços para isolamento de gDNA e preparação de lisado.
    NOTA: No caso da linha celular A375, semeie 45.000 células por lamínula e 450.000 células por poço de uma placa de seis poços.

8. Validação dos clones celulares gerados

  1. Imunocoloração
    NOTA: Realize imunocoloração nas células para determinar o nível de expressão da proteína de interesse (POI). É importante corar células do tipo selvagem ou clones de controle simultaneamente como controle para poder comparar os níveis de expressão do POI (Figura 2A).
    1. Aspirar e rejeitar o meio de cultura celular.
    2. Lave as células que crescem nas lamínulas três vezes com PBS.
    3. Fixe as células adicionando 0,5 mL de solução de formaldeído a 4% em cada poço e incube-as por 20 min em RT.
      NOTA: Diferentes anticorpos podem exigir diferentes métodos de fixação.
    4. Lave as células duas vezes com PBS.
    5. Para permeabilizar as células, incube as lamínulas em Triton X-100 a 0,1% em PBS por 5 min em RT.
      NOTA: Diferentes anticorpos podem exigir diferentes métodos de permeabilização.
    6. Lave as lamínulas duas vezes com PBS.
    7. Coloque as lamínulas em uma câmara de coloração9.
    8. Incube as lamínulas em BSA a 1% (p / v) em Triton X-100 a 0,1% (v / v) em solução de PBS por 30 min em RT para evitar a ligação inespecífica de anticorpos.
    9. Remova a solução colocando a lamínula com a borda em um pedaço de lignina usando uma agulha e uma pinça.
    10. Prepare uma solução de coloração composta de anticorpos primários em 1% (p / v) BSA e 0,1% (v / v) Triton X-100 em PBS. Colocar 30 μl de solução em cada lamínula e incubá-los durante 24 h a 4 °C numa câmara húmida.
      NOTA: O anticorpo anti-GSN de camundongo na diluição de 1:200 foi usado neste experimento.
    11. Remova a solução colocando as lamínulas com a borda em um pedaço de lignina usando uma agulha e uma pinça. Coloque as lamínulas em uma placa de 24 poços.
    12. Lave as lamínulas três vezes com PBS por 5 min em RT.
    13. Prepare anticorpos secundários e corantes em BSA a 1% (p / v) e Triton X-100 a 0,1% (v / v) em solução de PBS. Coloque 30 μL de solução em cada lamínula e incube-os por 1 h em RT no escuro.
      NOTA: Use anticorpos secundários marcados com anti-fluorescência de rato de burro 488 na diluição de 1:200. Para detectar F-actina e núcleos celulares, usamos faloidina-Alexa Fluor 568 na diluição 1:200 e Hoechst 33342 na diluição 1:1000.
    14. Remova a solução colocando as lamínulas com a borda em um pedaço de lignina usando uma agulha e uma pinça. Coloque as lamínulas em uma placa de 24 poços.
    15. Lave as lamínulas três vezes com PBS por 5 min em RT no escuro.
    16. Lave as lamínulas uma vez com água deionizada.
    17. Monte as lamínulas usando o meio de montagem no vidro do microscópio.
    18. Visualize a coloração celular usando um microscópio confocal para estabelecer o nível de POI expresso em clones derivados (Figura 2A).
  2. Análise de Western Blot
    NOTA: Para confirmar a falta, nível elevado ou nível reduzido de expressão de POI em clones derivados, execute a análise de western blot sob condições padrão10. Analise as células do tipo selvagem ou clones de controle simultaneamente (Figuras 2B, C).
    1. Lave as células que crescem no poço de uma placa de seis poços três vezes com PBS.
    2. Colha as células usando um raspador para um tampão de escolha e vortex suavemente por 20 s. Efectuar três ciclos de congelação (a -80 °C) e descongelação (a 4 °C) da amostra.
      NOTA: Use tampão de extração de proteína ligado ao citoesqueleto [10 mM Tris-HCl pH 7,4, 100 mM NaCl, 1 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), 1 mM de etilenoglicol-bis(2-éter aminoetílico)-N,N,N',N'-ácido tetracético (EGTA), 1 mM NaF, 20 mM Na4P2O7, 2 mM Na3VO4, 1% (v/v) Triton X-100, 10% (v/v) de glicerol, SDS 0,1% (p/v), desoxicolato de sódio a 0,5% ou tampão ureia [50 mM TRIS-HCl pH 7, 5% (p/v) SDS, 8,6% (p/v) sacarose, ureia 74 mM, DTT 1 mM], ambos com adição de coquetel inibidor de protease 1:100, inibidor de serina fosfatase 1:100 e inibidor de tirosina fosfatase 1:100.
    3. Centrifugue os lisados a 12.000 x g por 5 min a 4 °C.
    4. Determine a concentração de proteína nas amostras (por exemplo, pelo ensaio BCA).
      NOTA: O ensaio depende da compatibilidade com a composição do tampão.
    5. Para realizar a análise de western blot das amostras, carregue 30 μg de proteína em cada poço em gel de poliacrilamida (7% -15%).
    6. Realize a eletroforese SDS-PAGE e transfira as proteínas para uma membrana de nitrocelulose.
    7. Visualize o nível de expressão do POI colorindo a membrana com anticorpos adequados (Figuras 2B, C).
      NOTA: Anticorpos anti-GSN de camundongo na diluição de 1:2000 e anticorpos anti-GAPDH de camundongo na diluição de 1:200 foram usados. Consulte nossos artigos para obter detalhes 2,11. O tempo de exposição deve ser longo o suficiente para que sinais fracos não sejam esquecidos (Figura 2C).
  3. Análise de gDNA
    NOTA: Após a estimativa do nível de expressão de POI em clones derivados por técnicas microscópicas e western blot, o DNA genômico deve ser analisado. Uma comparação do comprimento do produto da reação de PCR obtido no molde de gDNA dos clones obtidos fornece informações sobre se a sequência do GOI foi editada (Figura 2D).
    1. Lave as células que crescem no poço de uma placa de seis poços três vezes com PBS.
    2. Colha as células usando um raspador em 1 mL de PBS.
    3. Centrifugar as células a 5000 x g durante 5 min a 4 °C.
    4. Aspirar e rejeitar os sobrenadantes.
      NOTA: Os pellets podem ser armazenados por vários meses a -80 °C.
    5. Isole o gDNA de pellets de clones derivados usando um kit de extração de gDNA disponível comercialmente.
    6. Projete primers de PCR recozendo pelo menos 300 pb a montante e a jusante do alvo de gRNA no local de edição de genes CRISPR/Cas9.
      NOTA: Foram utilizados os seguintes primers: Fwd: 5'gtgcagccaggatgagag3', Rev: 5'ccctgttactggtgcatc3'.
    7. Realize reações de PCR usando DNA Polimerase Master Mix de acordo com as instruções do fabricante.
      NOTA: A composição da mistura de reação de PCR é mostrada na Tabela 1, e as configurações do termociclador para a reação de PCR são apresentadas na Tabela 2.
    8. Analise os produtos de PCR em gel de agarose a 1% ou 2% (p / v) em tampão Tris-acetato-EDTA (40 mM Tris pH 8,0, 20 mM de ácido acético, 1 mM de EDTA).
    9. Compare o comprimento do amplicon do produto de PCR dos clones GSN KO com o comprimento do produto PCR dos clones CTRL KO (203 bp; Figura 2D).
  4. Sequenciamento de gDNA
    1. Projete primers de PCR por recozimento para as sequências a montante e a jusante das sequências reconhecidas pelos gRNAs codificados por plasmídeos CRISPR/Cas9(D10A).
      NOTA: Projete os primers da seguinte forma: Fwd: 5'gatctcgagctcaagcttcgaattctgaacagtgcagacctttg3', Rev: 5'cgcggtaccgtcgactgcagaattcaattcaccagaacaggactaggc3'.
    2. Realize PCR usando DNA polimerase de alta fidelidade (tal análise requer alta precisão durante a amplificação do DNA) e gDNA como modelo.
      NOTA: A composição da mistura de reação de PCR é mostrada na Tabela 3, e as configurações do termociclador para a reação de PCR são apresentadas na Tabela 4.
    3. Linearize o plasmídeo com uma enzima de restrição em vários locais de clonagem, incubando por 1 h a 37 ° C.
      NOTA: A composição da mistura de reação de digestão de restrição é mostrada na Tabela 5. Não importa qual plasmídeo está sendo usado. O pACGFP-C1 foi linearizado com a enzima EcoRI.
    4. Estimar a concentração de insertos e plasmídeos de corte por eletroforese em gel de agarose.
    5. Prepare reações de montagem de DNA.
      NOTA: Um método de clonagem tradicional ou qualquer outro método pode ser usado.
    6. Transforme bactérias competentes (por exemplo, por procedimento de choque térmico)12.
    7. Isole os plasmídeos (por exemplo, de seis colônias de bactérias por construção de acordo com as instruções do fabricante ou com o protocolo citado)13.
    8. Verificar se a inserção foi clonada com êxito no plasmídeo e se o seu comprimento é adequado por digestão por restrição e eletroforese de ADN.
      NOTA: Se as colônias selecionadas não contiverem um plasmídeo com uma inserção, os plasmídeos devem ser isolados das colônias bacterianas subsequentes.
    9. Confirme a edição gênica por sequenciamento de plasmídeo (Figura 3).
      NOTA: Deve-se obter pelo menos dois resultados diferentes de sequenciamento de DNA para cada clone de célula derivada devido à existência de dois alelos de genes. Para linhagens celulares multiplóides (maiores que 2 n), é necessário sequenciar mais plasmídeos para obter a sequência de todas as cópias de genes na célula que são obtidas. Isole quantas colônias forem necessárias até que os plasmídeos com as sequências clonadas de todas as cópias do gene sejam isolados. Pode-se usar um kit disponível comercialmente para estimar o número de loci para o gene estudado.
    10. Compare as sequências de gDNA obtidas para os clones GSN KO e CTRL KO usando um programa de alinhamento de sequências múltiplas (Figura 3).
ReagentesVolume
DNA Polimerase Master Mix7,5 μl
Primer direto (10 μM)1,5 μl
Primer reverso (10 μM)1,5 μl
Água estéril3,5 μl
gDNA1 μl contendo 10 ng de gDNA

Tabela 1. Composição da mistura de reação de PCR.

PassosTemperatura [°C]Tempo [minutos: segundos]
19504:00
29500:30
35700:30
47200:45
5vá para 2, 35xX
67210:00
78∞

Tabela 2. Configurações do termociclador para a reação de PCR.

ReagentesVolume
5 x tampão de polimerase de DNA de alta fidelidade4 μl
dNTPs (10 mM)0,4 μl
Primer direto (10 μM)1 μl
Primer reverso (10 μM)1 μl
Água estéril12,4 μl
gDNA1 μl contendo 10 ng de gDNA
DNA polimerase de alta fidelidade0,2 μl

Tabela 3. Composição da mistura de reação de PCR.

PassosTemperatura [°C]Tempo [minutos: segundos]
19800:30
29800:30
36100:30
47201:00
5Vá para a etapa 2, 35 vezesX
67210:00
78∞

Tabela 4. Configurações do termociclador para a reação de PCR.

ReagentesQuantidade
10 x tampão3 μl
Enzima de restrição1 μl
Água estéril20,7 μl
Plasmídeo5,3 μl contendo 5 μg de DNA

Tabela 5. Composição da mistura de reação de digestão de restrição.

9. Avalie a heterogeneidade fenotípica da linhagem celular

  1. Realize a imunocoloração das células para determinar o nível de expressão de POI.
  2. Tire fotos sem ampliação usando uma lente de imersão em óleo de 60x em um microscópio confocal.
  3. Para estabelecer a taxa de distribuição de células com diferentes níveis, use a ferramenta "superexposição/subexposição" que geralmente está disponível na maioria dos programas de análise de imagens microscópicas. Trate as células que mostram áreas subexpostas como produzindo o POI em um nível baixo. Classifique as células superexpostas como células com alto nível de expressão de POI e as células restantes como expressando POI em nível médio.

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Resultados

Usando o protocolo apresentado, fornecemos uma demonstração detalhada do isolamento de clones de células de melanoma transfectadas de forma estável com o método do cilindro de vidro (Figura 1A). Nossos estudos estão relacionados à biologia celular do melanoma, e o modelo de pesquisa mais comum que usamos é a linha de melanoma A375 aderente e altamente invasiva. Como nossa pesquisa mostrou que as células de melanoma produzem gelsolina (GSN) em alto nível em comparação com outros tipos de cânc...

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Discussão

Fornecemos uma descrição detalhada do isolamento de clones de células de melanoma transfectadas de forma estável com cilindros de vidro. É importante obter clones de controle ao derivar clones com expressão alterada de genes, pois os resultados obtidos para os clones de modificação direcionados devem sempre ser comparados com os resultados obtidos para os controles. Desta forma, podemos verificar se a transfecção em si ou a cultura com um antibiótico seletivo não afeta os resultados dos ...

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Divulgações

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Centro Nacional de Ciência, Polônia (projeto # 2016 / 22 / E / NZ3 / 00654, concedido ao AJM).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubo de centrífuga de 15 mlGoogleLab ScientificG66010522
Placa de cultura de células de 150 mm com grelha de 20 mmPlacaFalcon 353025
de 24 poçosVWR International10062-896
Placa de cultura de 35 mmEppendorfEP0030700112
placa de 6 poçosEppendorfEP0030700113
de 96 poços placaVWR International10062-900 
Solução de ácido acético, 80%Chempur115687330
AgaroseProna-AboBLE500
Antibiótico-AntimicóticoGibco15240062
anticorpos anti-GAPDHSanta Cruz Biotechnology Inc.,sc-47724
anticorpos anti-GSN  - clone C20Santa Cruz Biotechnology Inc.,sc-6405
anticorpos anti-GSN  - clone GS-2C4Sigma-AldrichG44896
Albumina de soro bovino (BSA)Sigma-AldrichA3294
Color Taq PCR Master Mix (2x)EurXE2525
Controle Duplo Nickase PlasmídeoSanta Cruz Biotechnology Inc.,sc-437281
Coverslipsbionovo16283
Dako Meio de montagem ClontechS3023
DMSO -  Kit deA3672,0250applichem
 EurX3555-02
burro anti-rato-Alexa Fluor 488Invitrogen# A-21202
DTT - 1,4-DithiothreitolSigma-Aldrich10197777001
EcoRI Thermo Fisher ScientificFD0274
EDTA- ácido etilenodiaminotetracético Poch (Pol-Aura)593280117
EGTA - etilenoglicol-bis(2-aminoetil éter)- N,N,N',N'-ácido tetracético Sigma-AldrichE0396
FBS - Soro Fetal BovinoGibco10270-106
Gelsolin CRISPR PlasmidsSanta Cruz Biotechnology Inc.,sc-401005-NIC
FormaldeídoSigma-AldrichP6148
GlicerolSigma-AldrichL-4909
glicose alta Dulbecco' s Águia modificada' s meio com concentração reduzida (1,5 g/l) de NaHCO3 Academia Polonesa de Ciências, Wrocfigure-materials-1aw, Polônia11-500
Hoechst 33342 Thermo Fisher ScientificH3570
L-GlutaminaGibco25030-024
Lignina BionovoB-0521
Lipofectamine 3000 Reagente de Transfecção InvitrogenL3000-008
Na3VO4Sigma-AldrichS6508
Na4P2O7Sigma-AldrichP8010
NaFSigma-Aldrich450022
NEBuilder Ferramenta de Montagem http://nebuilder.neb.com/#!/
pACGFP-C1 PageRuler da Clontech
Thermo Fisher Scientific 26616
Perfect 100 bp DNA ladderEurXE3134
faloidina-Alexa Fluor 568InvitrogenA12380
Inibidor de fosfatase Cocktail 2Sigma-AldrichP5726
Fosfatase Inhibitor Cocktail 3Sigma-AldrichP0044
Phusion DNA polimerase de alta fidelidade Pierce F530SThermo Fisher Scientific
 Thermo Fisher Scientific 23225
polietilenimina (PEI)Sigma-Aldrich408727
inibidor de protease coquetelSigma-AldrichP8340
puromicinaInviviGenant-pr
SDS - dodecil sulfato de sódio Sigma-AldrichL4509
silicone CX80 Polska
Cloreto de sódio - NaClChempur7647-14-5
desoxicolato de sódioSigma-AldrichD6750259
sacarosePoch (Pol-Aura)PA-06-772090110
os cilindros de vidro Sigma-AldrichC3983-50EA
Balão de Cultura de Tecidos 25mLVWR International10062-868
Balão de Cultura de Tecidos 75 cm2VWR10062-872
Base TrismaSigma-AldrichT1503
Triton X-100Sigma-AldrichX100
tripsina Academia Polonesa de Ciências, Wrocfigure-materials-2aw, Polônia20-500
ureiaSigma-Aldrich8656
solução de xilenoChempur115208603
Purificação de DNA Dimethylsulfoxide Escada de Proteína Prestained Kit de Ensaio de Proteína BCA da

Referências

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