Quantificando a motilidade de enxame de superfície bacteriana em placas de gradiente indutor

A motilidade bacteriana refere-se à migração coletiva de células bacterianas através da superfície de uma substância. Além das placas de ágar semisóidas especialmente preparadas em ^{laboratório1}, este fenótipo também é observado em alguns substratos macios, como tecidos ^animais2, superfícies ^hidratadas3 e raízes ^vegetais4. Embora uma superfície semisóida seja considerada uma das condições fundamentais para o enxame bacteriano, algumas espécies também requerem um meio rico em energia para apoiar sua motilidade ^{em enxame5}. A rotação flagela alimenta tanto a natação quanto a motilidade-natação infestada descreve a motilidade unicelular dentro de um ambiente líquido, enquanto o enxame é o movimento síncrona de uma população microbiana através de superfícies semisócidas.

A viscosidade substrato influencia a motilidade bacteriana; estudos de micróbios patogênicos, como Helicobacter pylori, mostraram que a motilidade do patógeno muda dependendo da viscosidade da camada de mucina, que é influenciada pela acidificação ambiental no hospedeiro ^humano6. Para replicar esses ambientes, estudos anteriores usando concentração de ágar acima de 0,3% (w/v) restringem a motilidade da natação bacteriana para efetuar uma mudança gradual no enxame de superfície. O uso da concentração de ágar acima de 1% (c/v) impede a motilidade de muitas ^espécies7. Os padrões da colônia formados na superfície são diversos, incluindo tapete sem ^{características}, olho de ^touro9, dendritos10 e vórtice11.

Embora a relevância desses padrões ainda não esteja clara, esses padrões parecem depender de pistas ambientais e ^químicas12. As pistas ambientais abrangem diferentes aspectos, incluindo temperatura, salinidade, luz e pH, enquanto as pistas químicas incluem a presença de moléculas sensoriais de quórum microbiano, subprodutos bioquímicos e nutrientes. O quórum de autoindutores que detectam moléculas de sinalização como a AHL (N-hexanoyl-L homoserina lactona) pode impactar o enxame de superfície, regulando a produção de ^{surfactante13,14}. Resveratrol, um composto de fitoalexina, poderia restringir a motilidade bacteriana ¹⁵.

No presente trabalho, investigamos o efeito das concentrações gradientes de resveratrol na cepa Escherichia coli K12 do tipo selvagem e investigamos a motilidade de enxame arabinose da espécie E. coli K12-YdeH e Pseudomonas aeruginosa PAO1-YdeH. A produção da enzima YdeH é induzida por arabinose através do promotor araBAD, resultando em perturbação c-di-GMP celular e afetando motilidade bacteriana ^16,17. Este comportamento de enxame indutível é estudado usando placas de enxame de gradiente arabinose com cepas E. coli K12-YdeH e P. aeruginosa PAO1-YdeH.

As placas de enxame de gradiente são preparadas solidificando sucessivamente o meio de dupla camada (Figura 1B). A camada inferior compreende o meio adicionado com o indutor, derramado em um lado de uma placa de Petri apoiada. Após a solidificação da camada inferior, a placa de Petri é devolvida a uma superfície plana, onde a camada superior contendo o meio sem o indutor é adicionada do outro lado da placa. Depois que as placas de enxame são completamente solidificadas, os poços de retenção isometricamente organizados são produzidos por furos chatos nas placas do enxame seguindo um layout fixo (Figura 1C) ou imprimindo os poços usando um modelo impresso em 3D da tampa da placa contendo pinos durante o processo de cura média (Figura Suplementar S1). Um sistema de imagem em gel é usado para capturar as morfologias em diferentes pontos de tempo (Figura 2). A análise do enxame de superfície usando o software ImageJ (Figura Suplementar S2) fornece resultados quantitativos do processo de enxame de superfície (Figura 3).

Assim, propomos um método simples para testar a motilidade de enxame de superfície dentro de uma faixa de concentração de indutores. Este método pode ser usado para testar múltiplas respostas de concentração de outros indutores misturando o indutor no meio de camada inferior e pode ser aplicado a outras espécies motile (por exemplo, Bacillus subtilis, Salmonella enterica, Proteus mirabilis, Yersinia enterocolitica). Esta abordagem poderia fornecer resultados qualitativos e quantitativos confiáveis para a triagem de um único indutor químico, e placas separadas podem ser empregadas para avaliar mais indutores químicos.

1. Preparação de placas de enxame de gradiente

1. Preparação do meio enxame
   NOTA: Consulte a seção de discussão para uma breve comparação de diferentes viscosidades médias; Neste protocolo foi utilizada concentração de 0,7% (c/v) de ágar do meio enxame.
   1. Preparar caldo de lysogeny (LB) em pó com ágar em dois frascos cônicos; cada frasco contém 2 g de triptona, 2 g de cloreto de sódio, 1 g de extrato de levedura e 1,4 g de ágar. Adicione água duplamente destilada (_ddH2O) e mexa a suspensão usando uma barra de mexida magnética. Ajuste o volume final para 200 mL adicionando _ddH2O adicional.
   2. Autoclave a solução a 121 °C por 20 min. Use uma tampa permeável de ar ou uma mamadeira com uma ventilação.
      NOTA: O ágar dissolverá-se quando aquecido na autoclave.
   3. Quando a temperatura cair para 65 °C, misture a solução para garantir a homogeneidade e transfira o médio para uma incubadora de 65 °C ou banho de água para uso a curto prazo.
2. Preparação do meio de enxame de camada inferior
   NOTA: O meio de camada inferior é a mistura de soluções de estoque de enxame médio e indutor. A formulação de placas de enxame de gradiente indutor é mostrada na Tabela 1.
   1. Prepare uma solução de estoque de resveratrol de 100 mM dissolvendo 114,12 mg de pó de resveratrol liofilizado em 5 mL de sulfóxido de dimetil (DMSO) e armazene a solução a -20 °C.
   2. Prepare uma solução de estoque arabinose de 20% (w/v) dissolvendo 6 g de pó arabinose em 30 mL de _ddH2O; esperar por 10-15 min para permitir que o arabinose se dissolva; e armazenar a solução em temperatura ambiente.
   3. Retire o meio da incubadora de 65 °C e coloque-o em temperatura ambiente; deixe o enxame médio esfriar até que o frasco de Erlenmeyer esteja frio o suficiente para segurar (~50 °C). Não coloque o enxame médio à temperatura ambiente por longos períodos, pois isso causará a solidificação do ágar.
   4. Adicione o volume necessário da solução de calção do indutor ao meio de enxame a 50 °C (Tabela 1). Use uma pipeta para dispensar a solução indutora em vez de escorá-la. Gire suavemente para misturar o indutor com o meio enxame.
      NOTA: Este passo é para indutores que não podem ser autoclavados. Tenha cuidado para não introduzir bolhas no meio.
3. Preparação de placas de enxame de gradiente de camada dupla
   NOTA: O meio de camada superior é o meio LB contendo 0,7% (w/v) ágar.
   1. Rotule pratos de Petri 13 x 13 cm quadrados com nome e cepas indutores, e apoie os pratos sobre a borda das tampas (Figura 1B).
   2. Adicione 40 mL de camada inferior quente (50 °C) usando uma pipeta de 50 mL ou um tubo de centrífuga de 50 mL.
      NOTA: Alternativamente, para placas de Petri de 13 x 13 cm quadrados, 40 mL de camada inferior e meio de camada superior é adequado; para placas de Petri quadradas de 10 x 10 cm, camada inferior de 25 mL e meio de camada superior é adequado.
   3. Deixe que o meio de camada inferior cure descoberto por 1h dentro de um capô de fluxo laminar. Não perturbe as placas quadradas de Petri enquanto o meio se solidifica.
      NOTA: Ao curar a camada inferior, o meio enxame que não contém indutores deve ser mantido em uma incubadora de 65 °C ou banho de água.
   4. Uma vez que a camada inferior esteja completamente solidificada, remova as tampas e coloque as placas de Petri quadradas dentro de um capô de fluxo laminar.
   5. Adicione 40 mL de meio de camada superior quente (50 °C) usando uma pipeta de 50 mL ou tubo de centrífuga de 50 mL.
      NOTA: O meio de camada superior não contém indutores.
   6. Cure as placas de camada dupla no banco coberto e imperturbável por 1h. Armazene as placas preparadas a 4 °C por até 24 horas.
      NOTA: Tempos de cura mais longos reduziriam o teor de umidade e restringiriam a motilidade de enxame.

2. Crescimento de E. coli K12 e P. aeruginosa PAO1

1. Prepare 500 mL de meio LB adicionando 5 g de triptona, 5 g de NaCl e 2,5 g de extrato de levedura em _ddH2O, e cubra a solução a 500 mL. Autoclave a solução em ciclo líquido por 20 min a 121 °C, e armazene-a a 4 °C.
2. Prepare 100 mL de 1,5% (w/v) meio LB-ágar adicionando 1 g de triptona, 1 g de NaCl, 0,5 g de extrato de levedura e 1,5 g de ágar no _ddH2O e cubra a solução a 100 mL. Autoclave a solução em ciclo líquido por 20 min a 121 °C. Transfira o meio para um banho de água de 50 °C para evitar que o ágar se solidifique.
3. Quando o frasco médio LB-ágar estiver confortável de segurar, adicione 20 mL de meio LB-ágar em uma placa de Petri (10 cm de diâmetro) usando uma pipeta de 25 mL. Deixe a placa em temperatura ambiente durante a noite, e armazene a placa LB-ágar a 4 °C.
4. Faça o balanço de culturas armazenadas a -80 °C, raia E. coli K12, E. coli K12-YdeH, P. aeruginosa PAO1, e P. aeruginosa PAO1-YdeH em placas LB-ágar Petri usando laços de inoculação descartáveis. Incubar as placas de Petri invertidas durante a noite a 37 °C.
5. Escolha colônias individuais para diferentes cepas dos pratos petri, inocula cada colônia em 5 mL de meio LB, e incuba a cultura a 37 °C em um shaker orbital de laboratório definido a 220 rpm.
6. Quando a densidade cultural atingir _OD600nm ~1.0, remova a cultura do agitador e coloque-a em temperatura ambiente. Ajuste a densidade da cultura para _OD600nm = 1.0, conforme descrito na etapa 3.2.1.

3. Inoculação e incubação de placas de enxame de gradiente

1. Preparação de poços de inoculação
   NOTA: Modelos de capa de impressão 3D capazes de gerar poços separados por uma distância padrão podem ser usados em vez do método descrito abaixo (Figura Suplementar S1).
   1. Marque as posições do poço no papel A4 mostrado na Figura 1C. Coloque três concentrações de teste em uma placa de Petri quadrada com duas ou três réplicas.
   2. Coloque o papel A4 marcado sob uma placa de gradiente solidificada. Empurre o lado mais amplo de uma ponta de pipeta de 100 μL para a superfície média semisóida na posição marcada. Pressione a ponta da pipeta até atingir a parte inferior do meio de camada superior.
   3. Quando a ponta tocar a parte inferior, não aplique força vertical na ponta; gire suavemente a ponta para isolar o conteúdo do poço cilíndrico.
   4. Mova horizontalmente as pontas da pipeta ao longo de uma distância muito pequena para permitir o fluxo de ar para o lugar estreito reservado. Pressione a ponta com o dedo indicador para bloquear o fluxo de gás dentro da ponta enquanto segura a pipeta usando o polegar e o dedo médio.
   5. Puxe a ponta verticalmente, mantendo o bem conteúdo na ponta enquanto puxa-o para fora.
      NOTA: Se o conteúdo do poço escorregar, aplique um pouco mais de pressão com o dedo indicador para selar completamente a ponta.
   6. Repetição de passos 3.1.2 a 3.1.5 em cada posição marcada. Cubra a placa do enxame antes da inoculação.
2. Inoculação e incubação da placa de gradiente
   1. Ajuste a densidade da cultura de crescimento durante a noite para _OD600nm = 1,0.
   2. Pipeta 80 μL da cultura de crescimento da noite para o dia em todos os poços. Não derrame a cultura bacteriana fora dos poços.
   3. Enrole as placas com filme de vedação. Para observação de longo prazo (3-5 dias), enrole as placas com fita de borracha de laboratório estéril.
      NOTA: A fita de borracha é menos provável de quebrar.
   4. Coloque um béquer cheio de _ddH2O na incubadora para manter a umidade dentro da incubadora. Incubar as placas de enxame de gradiente a 37 °C.
      NOTA: Não incubar as placas do enxame de cabeça para baixo; isso fará com que a cultura bacteriana vaze dos poços.
   5. Imagem da placa do enxame imediatamente após a inoculação, registrando-a como o ponto de tempo de 0h .

4. Imagem de superfície bacteriana swarming

1. Retire as placas do enxame, uma de cada vez, da incubadora a cada 12 horas, segurando a placa horizontalmente, e coloque-as no sistema de imagem em gel (veja a Tabela de Materiais).
   NOTA: Não deixe impressões digitais na superfície das placas; segure o lado da placa do enxame com luvas limpas.
2. Selecione o modo de imagem em gel ; expor a placa enxame à luz branca; e ajustar a distância focal para dar a visão mais clara dos enxames.
   NOTA: Use a mesma distância focal para todas as placas em um determinado lote.
3. Aumente o brilho dos enxames para observação clara, ajustando o tempo de exposição para 300 ms. Ajuste o limiar para minimizar a interferência da luz de fundo.
   NOTA: O limiar é ajustado na interface operacional do sistema de imagem gel. Aumentar os valores à esquerda para minimizar a interferência da luz de fundo; diminuir valores à direita para aumentar o brilho dos enxames. Neste protocolo, a região geralmente está entre 6.000 e 50.000.
4. Salve o arquivo de imagem para análise suplementar. Regisso tempo de imagem, tipo indutor, orientação gradiente e cepas em um arquivo .txt .

5. Quantifique a área do enxame usando o software ImageJ

1. Importe o arquivo de imagem adquirido usando o sistema de imagem em gel.
2. Defina a barra de escala usando o software ImageJ e aplique-a a todas as imagens.
   1. Crie um segmento de linha marcando o comprimento da placa clicando na ferramenta de linha.
   2. Clique em Analisar | Defina escala para abrir a janela Escala de configuração .
   3. Digite o comprimento real na distância conhecida e unidade de comprimento.
      NOTA: Como foram utilizadas placas de Petri de 13 x 13 cm quadrados neste trabalho, o comprimento real é '130', e a unidade de comprimento é 'mm'.
   4. Verifique a caixa global .
   5. Insira uma barra de escala clicando em Analisar | Ferramentas | Barra de escala, digite Largura em mm, Altura em pixels, tamanho da fonte e selecione Cor, Fundo e Localização no menu suspenso. Alternativamente, escolha Texto Negrito, Texto de Ocultação, Fonte Serif e Sobreposição marcando as caixas de seleção.
      NOTA: A escolha desses parâmetros é determinada pelos usuários e pelas propriedades das imagens. Neste protocolo, largura em mm foi definida como 25, Altura em pixels para 20, tamanho da fonte para 80, e a barra de escala foi colocada no canto inferior direito selecionando Local | Mais à direita. Outros parâmetros podem ser escolhidos pelo usuário.
3. Clique em processá| Sombras para aumentar a nitidez da imagem, especialmente os limites (Figura Suplementar S2A). Clique em process | Lote para processar imagens.
   NOTA: O objetivo desta etapa é fornecer uma demarcação de limite mais precisa.
   1. Processe uma imagem como referência clicando em Process | Sombras | No sul.
   2. Clique em process | | de lote Macro para abrir a janela Processo de lote . Procure os seguintes comandos exibidos na janela:
      run ("Sul");
      executar ("Salvar");
      close();
   3. Digite o endereço da pasta das imagens originais e o endereço do arquivo de saída clicando em Processar na janela Processo de lote .
      NOTA: Recomenda-se exportar imagens com sombras para outra pasta e reter uma cópia das imagens originais.
4. Use a ferramenta Varinha (rastreamento) para selecionar enxames individualmente e ajustar a ferramenta tolerância ( duplo clique em Varinha (rastreamento) até que a linha gerada se encaixe corretamente no limite do enxame (Figura Suplementar S2B).
   NOTA: Primeiro, clique na ferramenta Varinha (rastreamento) e selecione um enxame em uma imagem. Se os limites não tiverem sido retratados corretamente, clique duas vezes na ferramenta Varinha (rastreamento) para abrir as janelas da Ferramenta varinha , onde a Tolerância pode ser ajustada.
5. Clique em Analisar | Medida para exportar o valor da área.
6. Repetição de passos 5.1.1-5.1.5 até que todos os enxames sejam medidos, salve os resultados em um arquivo .csv para análise posterior.

O fluxo de trabalho constituído pela preparação de placas de enxame de gradiente, inoculação e incubação é mostrado na Figura 1B. Para gerar placas de nado gradiente, o meio de camada inferior é derramado em pratos apoiados a ~4,3° do plano horizontal (Figura Suplementar S3), seguido por derramar o meio de camada superior após a camada inferior ser completamente solidificada. A composição do meio de camada dupla é mostrada na Tabela 1. Em seguida, a cultura bacteriana cultivada durante a noite é pipetada nos poços de teste e incubada a 37 °C, mantendo níveis adequados de umidade. Várias concentrações de teste são definidas em uma placa de enxame gradiente com duas ou três réplicas (Figura 1C). A opção alternativa de um modelo de impressão 3D da tampa com a saliência colunar nos pontos de teste é mostrada na Figura Suplementar S1.

Duas espécies projetadas, E. coli K12-YdeH e P. aeruginosa PAO1-YdeH, foram testadas em placas de gradiente arabinose. A Figura 2A mostra o teste do processo de enxame de superfície em cinco poços, com sobreposição ocorrendo entre poços adjacentes. Três poços de teste foram definidos em uma placa, como mostrado na Figura 2B,C, que possibilitou a formação de limites não sobrepostos. A motilidade bacteriana foi promovida com um aumento na concentração arabinosa da menor concentração, mas foi gradualmente restrita com maiores concentrações arabinosas. E. coli A cepa de tipo selvagem K12 foi testada em placas gradientes de resveratrol (Figura 2C), dentro da faixa de concentração de 0-400 μM. Observou-se uma restrição modesta da motilidade do enxame com o aumento da concentração de resveratrol. As áreas de enxame foram quantificadas pelo software ImageJ (Figura Suplementar S2). As curvas de enxame exibem as múltiplas respostas de concentração (Figura 3).

Figura 1: Esquemático de preparação de placa de enxame de gradiente indutor, inoculação e incubação. (A) Crescimento noturno da cultura bacteriana a 37 °C. (B) Fluxo de trabalho da placa de enxame de gradiente de dupla camada. i) Prop up pratos de Petri quadrados. ii) Despeje a camada inferior média e solidifique à temperatura ambiente. iii) Coloque as placas de Petri quadradas planas e despeje o meio de camada superior. iv) Cura de placas. v) Faça poços correspondentes às posições marcadas. vi) Cultura bacteriana pipeta em poços. vii) Enrole placas usando filme de vedação ou fita de borracha. viii) Coloque placas de enxame em uma incubadora de 37 °C. C) Mapa de esboço de poços em papel A4 ou modelo de impressão 3D. Três poços com I) três réplicas e II) duas réplicas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Processos de enxame de superfície em placas de gradiente de indutor. Os processos de enxame de superfície bacteriana são capturados usando um sistema de imagem em gel dentro de 5 dias após a inoculação. (A) Processo de enxame de superfície induzido por Arabinose de E. coli K12-YdeH. (B) Processo de enxame de superfície induzido por Arabinose de P. aeruginosa PAO1-YdeH. (C) Processo de enxame de superfície de e. coli K12 tensão tipo selvagem na placa gradiente resveratrol. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: As curvas de enxame de superfície representam múltiplas respostas de concentração em placas de gradiente indutor. Cada ponto de dados quantificável consiste em três réplicas. (A) Motilidade de enxame induzida por arabinose de P. aeruginosa PAO1-YdeH; concentrações aproximadas dentro dos poços de teste são 0,17% (w/v), 0,25% (w/v) e 0,42% (w/v). (B) E. coli K12 tensão tipo selvagem que se aglomera na placa de enxame de gradiente de resveratrol; concentrações aproximadas dentro de poços de teste são de 67 μM, 200 μM e 335 μM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Especificações médias de enxame de camada dupla.

Figura Suplementar S1: Modelos de impressão 3D da tampa da placa de enxame. (A) 3 x 3 poços, incluindo três poços e três réplicas. (B) 3 x 2 poços, incluindo três poços e duas réplicas. (C) Faça poços com modelos de impressão 3D. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura Suplementar S2: Quantificação da área de enxame de superfície usando o software ImageJ. (A) Adicionar 'sombras' às imagens originais (Processe | Sombras) para gerar enxames quantificáveis com limites claros. (B) Definir barra de escala (Analisar | Escala definida), selecione enxames usando ferramentas de varinha (rastreamento) e área de enxame de exportação (Analise | Medida). Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar S3: Placa de Petri quadrada apoiada para derramar meio de camada inferior. O ângulo de inclinação é ~4.3 °. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.