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Triagem de biblioteca shRNA agrupada para identificar fatores que modulam um fenótipo de resistência a drogas

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DOI:

10.3791/63383

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17 de junho de 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Haematology, Christian Medical College, 2Department of Biotechnology, Thiruvalluvar University, 3Centre for Stem Cell Research, Christian Medical College

Neste artigo

Resumo

A triagem de interferência de RNA de alto rendimento (RNAi) usando um pool de shRNAs lentiviral pode ser uma ferramenta para detectar alvos letais sintéticos terapeuticamente relevantes em malignidades. Fornecemos uma abordagem de triagem de shRNA agrupada para investigar os efeitos epigenéticos na leucemia mielóide aguda (LMA).

Resumo

Compreender mecanismos de condutores clinicamente relevantes da quimio-resistência adquirida é crucial para elucidar formas de contornar a resistência e melhorar a sobrevivência em pacientes com leucemia mielóide aguda (LMA). Uma pequena fração de células leucêmicas que sobrevivem à quimioterapia têm um estado epigenético equilibrado para tolerar insultos quimioterápicos. A exposição adicional à quimioterapia permite que essas células persistoras de medicamentos atinjam um estado epigenético fixo, o que leva à alteração da expressão genética, resultando na proliferação dessas populações resistentes a medicamentos e, eventualmente, recaídas ou doenças refratárias. Portanto, identificar modulações epigenéticas que necessitam da sobrevivência de células leucêmicas resistentes a medicamentos é fundamental. Detalhamos um protocolo para identificar moduladores epigenéticos que mediam a resistência à cytarabina analógica nucleosídea (AraC) usando a triagem da biblioteca shRNA agrupada em uma linha celular AML resistente à cytarabina adquirida. A biblioteca consiste em 5.485 construções de shRNA visando 407 fatores epigenéticos humanos, o que permite a triagem de fatores epigenéticos de alto rendimento.

Introdução

As opções terapêuticas na leucemia mielóide aguda (LMA) permaneceram inalteradas por quase cinco décadas, com a cytarabina (AraC) e as anthracycraclines como a pedra angular para o tratamento da doença. Um dos desafios para o sucesso da terapia LMA é a resistência das células-tronco leucêmicas à quimioterapia, levando à recaída da doença 1,2. A regulação epigenética desempenha um papel vital na patogênese do câncer e na resistência a medicamentos, e vários fatores epigenéticos surgiram como alvos terapêuticos promissores 3,4,5. Os mecanismos regulatórios epigenéticos afetam a proliferação e a sobrevivência sob exposição contínua a drogas quimioterápicas. Estudos em malignidades não hematológicas relataram que uma pequena fração de células que superam o efeito da droga sofrem várias modificações epigenéticas, resultando na sobrevivência dessas células 6,7. No entanto, o papel dos fatores epigenéticos na mediação da resistência adquirida à cytarabina na LMA não foi explorado.

A triagem de alto rendimento é uma abordagem para a descoberta de drogas que ganhou importância global ao longo do tempo e tornou-se um método padrão em diferentes aspectos para identificar potenciais alvos em mecanismos celulares, para perfilamento de caminhos e no nível molecular 8,9. O conceito de letalidade sintética envolve a interação entre dois genes onde a perturbação de qualquer gene sozinho é viável, mas de ambos os genes simultaneamente resulta na perda de viabilidade10. Explorar a letalidade sintética no tratamento do câncer pode ajudar a identificar e caracterizar mecanicamente interações genéticas letais sintéticasrobustas 11. Adotamos uma abordagem combinatória de triagem de shRNA de alto rendimento com letalidade sintética para identificar os fatores epigenéticos responsáveis pela aquisição da resistência à cytarabina na LMA.

Leucemias agudas impulsionadas pela translocação cromossômica do gene de leucemia de linhagem mista (MLL ou KMT2A) são conhecidas por estarem associadas à má sobrevivência em pacientes. Os produtos quiméricos resultantes dos rearranjos genéticos de MLL , ou seja, proteínas de fusão de MLL (MLL-FPs), podem transformar células hematopoiéticas de tronco/progenitor (HSPCs) em explosões leucêmicas com o envolvimento de múltiplos fatores epigenéticos. Esses reguladores epigenéticos constituem uma rede complicada que dita a manutenção do programa de leucemia e, portanto, poderia formar potenciais alvos terapêuticos. Neste contexto, utilizamos a linha celular MV4-11 (abrigando o gene de fusão MLL-AF4 com a mutação FLT3-ITD; denominada como MV4-11 P) para desenvolver a linha celular resistente à cytarabina adquirida, denominada MV4-11 AraC R. A linha celular foi exposta ao aumento de doses de cytarabina com recuperação intermitente do tratamento medicamentoso, conhecido como feriado medicamentoso. A concentração inibitória semi-máxima (IC50) foi avaliada pelo ensaio de citoxicidade in vitro .

Utilizamos a biblioteca de shRNA epigenética agrupada (ver Tabela de Materiais) impulsionada pelo promotor hEF1a com uma espinha dorsal lentiviral pZIP. Esta biblioteca compreende shRNAs visando 407 fatores epigenéticos. Cada fator tem 5-24 shRNAs, com um total de 5.485 shRNAs, incluindo cinco shRNAs de controle não direcionados. O andaime miR-30 modificado "UltrmiR" foi otimizado para biogênese e expressão primária eficiente12,13.

O esboço deste experimento é ilustrado na Figura 1A. O protocolo atual concentra-se na triagem RNAi usando a biblioteca de fator epigenético shRNA na linha de células R MV4-11 (Figura 1B), uma linha celular de suspensão. Este protocolo pode ser usado para selecionar qualquer biblioteca direcionada em qualquer linha celular resistente a medicamentos de sua escolha. Deve-se notar que o protocolo de transdução será diferente para as células aderentes.

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Protocolo

Siga as diretrizes do Comitê de Biossegurança Institucional (IBSC) e use a facilidade adequada para lidar com lentivírus (BSL-2). O pessoal deve ser devidamente treinado no manuseio e eliminação do lentivírus. Este protocolo segue as diretrizes de biossegurança da Christian Medical College, Vellore.

1. Seleção do promotor mais potente para obter expressão persistente e prolongada dos shRNAs

NOTA: É essencial realizar um experimento de transdução usando vetores lentivirais com diferentes promotores que expressam proteínas de fluorescência para identificar o promotor que fornece uma expressão estável e de longo prazo de shRNAs na linha celular selecionada para o experimento. Os promotores mais utilizados para este fim são os promotores hEF1α (fator de alongamento humano 1α), hCMV (citomegalovírus humano) e promotores de SSFV (vírus formador de foco de baço) que expressam proteína de fluorescência verde (GFP) (Figura 2A).

  1. Execute a contagem de células usando o método de exclusão azul trypan. Suspenda as células MV4-11 AraC R em 10% de RPMI médio (RPMI com 10% de FBS suplementados com penicilina de 100 U/mL e estreptomicina U/mL) contendo polibrene de 8 μg/mL. Semente 1 x 106 células em 1,5 mL de média/poço de uma placa de seis poços em triplicados.
  2. Adicione diferentes volumes de lentivírus concentrados (por exemplo, 10 μL, 20 μL e 40 μL, dependendo do título das lentivírus) a cada poço. Gire suavemente a placa para misturar o conteúdo.
  3. Realize a spinfection por centrifugação a 920 x g a 37 °C por 90 min.
  4. Incubar imediatamente as placas em uma incubadora de CO2 (5% de CO2 a 37 °C).
  5. Observe a expressão GFP após 48 h sob um microscópio de fluorescência para garantir uma transdução bem sucedida.
  6. Quantifique a expressão GFP por citometria de fluxo após 72 h para avaliar a eficiência da transdução.
  7. Cultume as células por um total de 2 semanas e monitore a expressão GFP periodicamente por citometria de fluxo. A redução da expressão GFP medida pela intensidade média da fluorescência e o percentual de células GFP+ indicam silenciamento do promotor.
  8. Classifique as células GFP+ no 10º dia e cultue as células por 1 semana após a triagem. Verifique periodicamente a expressão GFP durante a cultura.
  9. Use as células não traduzidas para definir o portão. Uma população além da escala 1 x 101 em direção à direita no eixo x é considerada uma população positiva para gfp.
  10. Escolha o promotor que mostra uma expressão persistente de GFP na cultura prolongada das células.

2. Preparação de biblioteca de fator epigenético humano lentiviral agrupado

  1. Cultura 293T células (em um número de passagem baixa com uma boa taxa de proliferação) em três pratos de cultura celular de 10 cm com 8 mL de 10% de mMEM médio (DMEM com 10% FBS contendo 100 U/ml penicilina e 100 U/ml streptomicina) em cada placa.
  2. Uma vez que as células atinjam 60% de confluência, substitua o meio por um meio completo.
  3. Prepare o mix de transfecção (conforme descrito na Tabela 1) que contém meio sem soro, embalagens lentivirais (psPAX2) e plasmídeo de envelope (pMD2.G), plasmídeos de biblioteca agrupados e, finalmente, o reagente de transfecção.
  4. Bata na mistura para misturar bem e incubar à temperatura ambiente por 15 minutos.
  5. Adicione a mistura de transfecção às células 293T e misture suavemente girando as placas. Incubar as placas em uma incubadora de CO2 (5% DE CO2 a 37 °C). Troque o meio depois das 24h.
  6. Após 48 h, verifique se há expressão GFP sob um microscópio de fluorescência para garantir alta eficiência de transfecção nas células 293T.
  7. Recolhe os supernacantes do vírus após 48h, 60 h e 72 h e armazena-os a 4 °C. Adicione um meio fresco (8 mL) em cada ponto de tempo após a coleta do vírus.
  8. Juntar os supernantes do vírus. O volume total dos vírus agrupados será: ~8 mL/placa x 3 coleções= ~24 mL/placa; ~24 mL/placa x 3 placas = ~72 mL de 3 placas.
  9. Filtre os vírus agrupados com o filtro de 0,4 μm.
  10. Para obter um alto título de vírus, concentre os vírus agrupados por ultracentrifugação. Transfira o vírus filtrado supernante para dois tubos de 70 Ti (32 mL/tubo) e centrífuga a 18.000x g por 2 h com aceleração lenta e desaceleração. Use um rotor e centrífuga pré-cozido a 4 °C.
  11. Retire os tubos da centrífuga suavemente e remova o sobrenatante completamente.
  12. Usando uma micropipette, resuspenque suavemente a pelota em 400 μL de DMEM (sem FBS e antibióticos). Incubar no gelo por 1h e misturar as pelotas de ambos os tubos.
  13. Aliquot os vírus e congele a −80 °C.
    NOTA: Os tubos e vírus devem ser mantidos no gelo durante as etapas 2.10.-2.13. Evite espumar enquanto reaprúlado do vírus com o meio simples. O médio deve ser mantido a 4 °C.
  14. Calcule a concentração (x) do vírus conforme abaixo:
    Volume total antes da concentração = 72 mL (72.000 μL)
    Volume após concentração = 400 μL
    A concentração = 72.000/400= 180x

3. Estimativa da eficiência de transdução de lentivírus

  1. Transdutor células 293T com o vírus concentrado em diferentes volumes (2 μL, 4 μL, 8 μL) para confirmar a preparação bem sucedida de lentivírus.
    NOTA: Se os vírus concentrados apresentarem alta eficiência de transdução (>50%) em pequenos volumes (1-2 μL), é aconselhável diluir o vírus concentrado nas quantidades desejadas (100x a 75x).
  2. Diluir o vírus concentrado para 100x com DMEM (sem FBS e antibióticos) para realizar experimentos de titulação na linha celular MV4-11 AraC R.
  3. Semente 1 x 106 células (linha de célulaS AraC R MV4-11 em 1,5 mL de 10% de meio RPMI contendo 8 μg/mL de polibrene) em um poço de uma placa de seis poços. Prepare quatro poços para transdução com diferentes volumes de vírus.
  4. Adicione quatro volumes diferentes (por exemplo, 1 μL, 1,5 μL, 2 μL e 2,5 μL) de vírus de 100x.
  5. Realize a spinfection por centrifugação da placa a 920 x g por 90 min a 37 °C.
  6. Após 72 h, meça a porcentagem de células GFP+ por citometria de fluxo.
  7. Determine o volume dos vírus para obter 30% de eficiência de transdução. Esta baixa eficiência de transdução é para garantir uma integração única de shRNA por célula.

4. Transdução da biblioteca de shRNA epigenética agrupada na linha celular resistente a medicamentos

  1. Mantenha a linha de células alvo MV4-11 AraC R a uma densidade de 0,5 x 106 células/mL. Certifique-se de que as células estão na fase exponencial de crescimento da cultura.
  2. Calcule o número de células a serem tomadas para o experimento conforme abaixo com base no número de integradores virais.
    Número de células necessárias para a transdução = 5.485 (número de shRNAs) × 500 (representação do shRNA do fold) / 0,25 (MOI) = 10.982.000 ~11 x 106 células
  3. Resuspend 1.1 x 107 células em 16 mL de 10% de meio RPMI.
  4. Adicione polibreno (8 μg/mL) e misture bem. Em seguida, adicione o volume necessário de vírus para obter 30% de eficiência de transdução conforme calculado na seção anterior.
  5. Semente todas as células em uma placa de seis poços a uma densidade de 1 x 106 células / 1,5 mL de 10% RPMI médio por poço.
  6. Centrifugar a placa por 90 min a 920 x g a 37 °C.
  7. Incubar a placa durante a noite em uma incubadora de CO2 (5% de CO2 a 37 °C).
  8. Após 24 horas, mude o meio e transfira as células transduzidas para um frasco T-75.
  9. Após 48 h, verifique o GFP sob um microscópio de fluorescência para garantir uma transdução bem sucedida.
  10. Após 72 h, quantita a porcentagem de células GFP+ por citometria de fluxo.

5. Enriquecimento de células positivas de GFP

NOTA: Expanda as células transduzidas, culminando-as a uma densidade de 0,5 x 106 células/mL por 5-7 dias. Essas células são uma população mista de transduzidas e não traduzidas, selecionadas com base na GFP por classificação, como mencionado na etapa seguinte.

  1. Realize a triagem de fluxo de células transduzidas GFP+ com as configurações de classificação de fluxo definidas como alta pureza e baixo rendimento. Use as células não traduzidas para definir o portão. Uma população além de 1 x 102 para a direita é considerada uma população positiva.
  2. Colete as células classificadas em 5% RPMI (RPMI com 5% de FBS suplementados com penicilina U/mL e estreptomicina de 100 U/mL).
  3. Cultume as células classificadas em um meio 10% RPMI.
  4. Após 72 h, realize a estimativa pós-classificação do percentual de células GFP+ para garantir >95% de eficiência de classificação.
    NOTA: Certifique-se de obter ~3-5 x 106 células positivas GFP após a classificação para obter 450x a ~500x de representação da biblioteca shRNA.

6. Triagem de abandono para identificar fatores epigenéticos que mediam a resistência a medicamentos

  1. Cultura a biblioteca shRNA células transduzidas em 10% RPMI por até 5 dias. Criopreserve as células transduzidas para experimentos futuros, se necessário, antes do tratamento medicamentoso.
  2. Centrifugar 1 x 107 células em duplicatas a 280 x g por 5 min a 25 °C. Descarte o supernatante e armazene as pelotas a −80 °C. Essas amostras servirão como referência de base para a biblioteca epigenética shRNA.
  3. Cultura as células transduzidas restantes como duplicatas (R1 e R2), cada uma mantida em uma contagem de células que fornece uma representação de 500x da biblioteca.
  4. Trate uma das duplicatas com a droga (10 μM cytarabine) (R2) e a outra sem o tratamento medicamentoso (R1).
  5. Troque o meio para os frascos com e sem a droga a cada 72 horas. Repita a troca média 3x para uma exposição cumulativa de 9 dias.
  6. Após 9 dias de tratamento medicamentoso, verifique a viabilidade das células pelo método de exclusão azul trypan.
  7. Centrifugar as células restantes a 280 x g por 5 min a temperatura ambiente. Resuspenque as células em PBS estérei e lave as células. Centrifugar a 280 x g por 5 min a temperatura ambiente.
  8. Descarte o supernatante e armazene as pelotas a −80 °C para extração de DNA.

7. Amplificação dos shRNAs integrados por PCR

  1. Extrair DNA das células de base transduzidas (T) (passo 6.2.) e as células tratadas com a droga (R2) e não tratadas com a droga (R1).
  2. Verifique a concentração da amostra usando um fluorômetro.
  3. Calcule a quantidade de DNA necessária para pcr como abaixo:
    5.485 (não. de shRNAs) × 500 (representação shRNA) × 1 x 6,6−12 (g/genoma diploide) = 15 μg de DNA
  4. Sujeito as amostras à primeira rodada de PCR.
    NOTA: A mistura de reação pcr é retratada na Tabela 2 com as condições do cicloviário térmico. Os detalhes das primers estão fornecidos na Tabela Suplementar 1.
  5. Configure múltiplas reações contendo 850 ng de DNA por tubo (para um total de 43 reações).
    NOTA: A primeira rodada de PCR amplifica as regiões de flanqueamento do shRNA resultando em um tamanho de amplicon de 397 bp.
  6. Acumule os produtos PCR e purifique os produtos PCR usando 3-4 colunas de um kit de purificação padrão gel/PCR.
    NOTA: Os detalhes estão fornecidos na Tabela 3.
  7. Elute o produto em 50 μL de tampão de cada coluna e acumule os elutes.
  8. Quantifique o DNA e armazene-o a −20 °C.
    NOTA: Os reagentes são tabulados na Tabela 4 com as condições do cicloviário térmico. O PCR de segunda rodada utiliza os primers com a sequência INDEX necessária para multiplexing em NGS em uma célula de fluxo único. Assim, cada amostra deve ser marcada com um índice diferente. As sequências de primer são fornecidas na Tabela Suplementar 1.
  9. Configure quatro reações com 500 ng do produto PCR primário em um volume total de reação de 50 μL para cada amostra e o controle negativo.
  10. Carregue todo o produto para eletroforese usando gel de agarose 2% TBE e confirme o tamanho da banda usando uma escada molecular de 1 kb. O tamanho do amplicon é de 399 bp.
  11. Visualize os produtos PCR no sistema de documentação do gel.
  12. Extirpa a banda específica e purificar usando um kit de purificação de gel.
    NOTA: Os cálculos para purificação com o kit estão fornecidos na Tabela 3.
  13. Elute em um volume final de 30 μL de tampão de eluição. A concentração aproximada de cada eluente será em torno de 80-90 ng/μL com um volume total de 30 μL.

8. Sequenciamento e análise de dados de última geração

  1. Sequencie o produto purificado em gel a partir da etapa 7.13. em um sequenciador de próxima geração (por exemplo, Illumina) para obter a contagem de leitura para os shRNAs esgotados.
  2. Aparar as sequências adaptadoras do FastQ gerados usando o kit de ferramentas Fastx (versão 0.7).
  3. Alinhe as leituras filtradas às sequências de referência usando um alinhador Bowtie com o parâmetro de permitir dois desencontros. Certifique-se de que o comprimento de leitura após o corte do adaptador é de cerca de 21 bp.
  4. Carregue os arquivos usando o programa Samtools (versão 1.9). Use a opção Flagstat e calcule o resumo de alinhamento.
  5. Carregue os arquivos fastQ aparados no software CRISPRCloud2 (CC2) (https://crispr.nrihub.org/) juntamente com as sequências de shRNA de referência na forma de arquivos FASTA e realize a análise de acordo com as instruções.
    1. Clique no link Análise de Início no CC2.
    2. Selecione o tipo de tela como telas de sobrevivência e abandono. Defina o número de grupos e digite o nome de cada grupo.
    3. Faça upload da biblioteca de referência no formato de arquivo FASTA. Os dados carregados são processados. Clique na URL de saída para obter os resultados.
      NOTA: Este software usa um modelo beta-binomial com um teste t-t de um aluno modificado para medir diferenças nos níveis de sgRNA/shRNA, seguido pelo teste combinado de probabilidade de Fisher para estimar a significância do nível genético. Ele calcula alterações de log2 vezes (Log2Fc) estimadas para os fatores epigenéticos entre os tratados (enriquecidos/esgotados) e as amostras não tratadas (linha de base) com "valores p" e "valores FDR".
  6. Certifique-se de que o valor FDR seja "Negativo" para uma tela dropout e "Positive" para uma tela Survival.
    NOTA: CC2 é uma plataforma de análise para contar as leituras e calcular a representação da dobra (enriquecimento ou esgotamento) de shRNAs entre as amostras.
  7. Identificar os shRNAs significativamente enriquecidos e esgotados (FDR <0,05) dos resultados do CC2.
    NOTA: Existem 5-24 shRNAs contra cada fator. Verifique os valores fdr para cada um dos shRNAs; considere o FDR, que é <0,01, e tome uma média para os shRNAs selecionados. Considere os 40 melhores hits. Plote o gráfico para os fatores selecionados com base nos valores negativos do Log2Fc ou FDR. Certifique-se de que os shRNAs não direcionados também tenham valores FDR significativos para garantir a autenticidade dos dados à medida que servem como shRNAs de controle.

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Resultados

O fluxo de trabalho de triagem geral é retratado na Figura 1A. A citotoxicidade in vitro do MV4-11 AraC R (48 h) revelou o IC50 para a citarabina no MV4-11 AraC R a ser maior que o MV4-11 P (Figura 1B). Esta linha celular foi utilizada no estudo como modelo para triagem dos fatores epigenéticos responsáveis pela resistência à cytarabina.

A Figura 2A mostra os mapas vetoriais pZIP...

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Discussão

A interferência de RNA (RNAi) é amplamente utilizada para estudos de genômica funcional, que incluem a triagem de siRNA e shRNA. O benefício do shRNA é que eles podem ser incorporados em vetores plasmídeos e integrados ao DNA genômico, resultando em expressão estável e, portanto, mais longo knockdown do mRNA alvo. Uma triagem de biblioteca shRNA agrupada é robusta e econômica em comparação com as telas convencionais (siRNA). Identificar a essencialidade de uma classe específica de proteínas em uma tela de genoma pode ser...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse e nada a revelar.

Agradecimentos

Este estudo é financiado em parte por uma bolsa do Departamento de Biotecnologia BT/PR8742/AGR/36/773/2013 à SRV; e Departamento de Biotecnologia Índia BT/COE/34/SP13432/2015 e Departamento de Ciência e Tecnologia, Índia: O EMR/2017/003880 para P.B. RVS e P.B. são apoiados pela Wellcome DBT India Alliance IA/S/17/1/503118 e IA/S/15/1/501842, respectivamente. A S.D. é apoiada pela bolsa CSIR-UGC, e a S.I. é apoiada por uma bolsa de pesquisa sênior do ICMR. Agradecemos a Abhirup Bagchi, Sandya Rani e a equipe do CSCR Flow Cytometry Core Facility por sua ajuda. Agradecemos também à MedGenome Inc. por ajudar com o sequenciamento de alto rendimento e análise de dados.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Reagents
100 bp Ladder Hyper LadderBIOLINEBIO-33025
1kb Ladder Hyper LadderBIOLINEBIO-33056
AgaroseLonza Seachekm50004
Betaine (5mM)SigmaB03001VL
Boric AcidQualigens12005
PlasticwareCorningappicable
citosina β-D-arabinofuranosideSigmaC1768-500MG
DMEMMP BIO
DMSOWak Chemie GMBHCryosure DMSO 10ml
EDTASigmaE5134
Brometo deEtídioSigmaE1510-10 mL
Soro Fetal BovinoThermo Fisher Scientific16000044
Kit de Purificação em Gel/PCRMACHEREY-NAGELREF  740609.50
Gibco- RPMI 1640Thermo Fisher Scientific23400021
Ácido Acético GlacialThermoQ11007
hCMV GFP PlasmídeoTransômica TransOmicsSeleção do promotor KIT
hEF1a GFPlasmidTransomicsTransOmics Seleção do promotor KIT
HEK 293TATCCCRL-11268
Linha celular HL60ATCCCCL-240
KOD Hot Start PolimeraseMerck71086
Linha celular Molm13Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, EUADana Farber Cancer Institute, Boston, MA, EUA
Linha celular MV4-11ATCCCRL-9591
Penicilina estreptomicinaThermo Fisher Scientific
psPAX2 e pMD2.GAddgene Addgeneplasmídeo no.12260 & Plasmídeo Addgene no. 12259
Qubit dsDNA HS Kit de EnsaioInvitrogenREF Q32854
SFFV  GFP PlasmídeoTransomicsTransOmics Seleção do promotor KIT
shERWOOD-UltrmiR shRNA Library da TransomicsTransomicsCat No. TLH UD7409; Nº do lote: A116. V 132.14
Trans-IT-LTI MirusMirusMirus Número do catálogo: MIR2300
TrisMP Biomedicals0219485591
Trypan BlueSigma-AldrichT8154-100ML
Beckman Coulter  103319
Equipamentos
5% CO2 incubadoraThermo Fisher
BD Aria III classificador de célulasBecton Dickinson
Beckman Coulter Optima L-100K- UltracentrifugaçãoBeckman coulter
CentrifugeThermo Multiguge 3SR+
Sistema de imagem ChemiDoc( Sistema Fluro Chem M)Fluro Chem
Leica AF600Leica
Light MicroscópioZeiss Axiovert 40c
NanodropThermo Scientific
Qubit 3.0 FluorômetroInvitrogen
TermocicladorBioRad
da cultura celular como o cloridrato da 91233354 15140122 Tubos de centrífuga Ultra

Referências

  1. Döhner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. Acute myeloid leukemia. The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).
  2. De Kouchkovsky, I., Abdul-Hay, M. Acute myeloid leukemia: A comprehensive review and 2016 update. Blood Cancer Journal. 6 (7), 441(2016).
  3. Zuber, J., et al. RNAi screen identifies Brd4 as a therapeutic target in acute myeloid leukaemia. Nature. 478 (7370), 524-528 (2011).
  4. Shi, J., et al. The Polycomb complex PRC2 supports aberrant self-renewal in a mouse model of MLL-AF9;NrasG12D acute myeloid leukemia. Oncogene. 32 (7), 930-938 (2013).
  5. Chen, C. -W., et al. DOT1L inhibits SIRT1-mediated epigenetic silencing to maintain leukemic gene expression in MLL-rearranged leukemia. Nature Medicine. 21 (4), 335-343 (2015).
  6. Li, F., et al. In vivo epigenetic CRISPR screen identifies Asf1a as an immunotherapeutic target in Kras-mutant lung adenocarcinoma. Cancer Discovery. 10 (2), 270-287 (2020).
  7. Balch, C., Huang, T. H. -M., Brown, R., Nephew, K. P. The epigenetics of ovarian cancer drug resistance and resensitization. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 191 (5), 1552-1572 (2004).
  8. Carnero, A. High throughput screening in drug discovery. Clinical and Translational Oncology. 8 (7), 482-490 (2006).
  9. Lal-Nag, M., et al. A high-throughput screening model of the tumor microenvironment for ovarian cancer cell growth. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 22 (5), 494-506 (2017).
  10. O'Neil, N. J., Bailey, M. L., Hieter, P. Synthetic lethality and cancer. Nature Reviews Genetics. 18 (10), 613-623 (2017).
  11. Hoffman, G. R., et al. Functional epigenetics approach identifies BRM/SMARCA2 as a critical synthetic lethal target in BRG1-deficient cancers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3128-3133 (2014).
  12. Fellmann, C., et al. An optimized microRNA backbone for effective single-copy RNAi. Cell Reports. 5 (6), 1704-1713 (2013).
  13. Knott, S. R. V., et al. A computational algorithm to predict shRNA potency. Molecular Cell. 56 (6), 796-807 (2014).
  14. Papaemmanuil, E., et al. Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).
  15. Vidal, S. J., Rodriguez-Bravo, V., Galsky, M., Cordon-Cardo, C., Domingo-Domenech, J. Targeting cancer stem cells to suppress acquired chemotherapy resistance. Oncogene. 33 (36), 4451-4463 (2014).
  16. Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).

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