A triagem de interferência de RNA de alto rendimento (RNAi) usando um pool de shRNAs lentiviral pode ser uma ferramenta para detectar alvos letais sintéticos terapeuticamente relevantes em malignidades. Fornecemos uma abordagem de triagem de shRNA agrupada para investigar os efeitos epigenéticos na leucemia mielóide aguda (LMA).
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Artigo de método
Triagem de biblioteca shRNA agrupada para identificar fatores que modulam um fenótipo de resistência a drogas
Neste artigo
Resumo
Resumo
Compreender mecanismos de condutores clinicamente relevantes da quimio-resistência adquirida é crucial para elucidar formas de contornar a resistência e melhorar a sobrevivência em pacientes com leucemia mielóide aguda (LMA). Uma pequena fração de células leucêmicas que sobrevivem à quimioterapia têm um estado epigenético equilibrado para tolerar insultos quimioterápicos. A exposição adicional à quimioterapia permite que essas células persistoras de medicamentos atinjam um estado epigenético fixo, o que leva à alteração da expressão genética, resultando na proliferação dessas populações resistentes a medicamentos e, eventualmente, recaídas ou doenças refratárias. Portanto, identificar modulações epigenéticas que necessitam da sobrevivência de células leucêmicas resistentes a medicamentos é fundamental. Detalhamos um protocolo para identificar moduladores epigenéticos que mediam a resistência à cytarabina analógica nucleosídea (AraC) usando a triagem da biblioteca shRNA agrupada em uma linha celular AML resistente à cytarabina adquirida. A biblioteca consiste em 5.485 construções de shRNA visando 407 fatores epigenéticos humanos, o que permite a triagem de fatores epigenéticos de alto rendimento.
Introdução
As opções terapêuticas na leucemia mielóide aguda (LMA) permaneceram inalteradas por quase cinco décadas, com a cytarabina (AraC) e as anthracycraclines como a pedra angular para o tratamento da doença. Um dos desafios para o sucesso da terapia LMA é a resistência das células-tronco leucêmicas à quimioterapia, levando à recaída da doença 1,2. A regulação epigenética desempenha um papel vital na patogênese do câncer e na resistência a medicamentos, e vários fatores epigenéticos surgiram como alvos terapêuticos promissores 3,4,5
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Protocolo
Siga as diretrizes do Comitê de Biossegurança Institucional (IBSC) e use a facilidade adequada para lidar com lentivírus (BSL-2). O pessoal deve ser devidamente treinado no manuseio e eliminação do lentivírus. Este protocolo segue as diretrizes de biossegurança da Christian Medical College, Vellore.
1. Seleção do promotor mais potente para obter expressão persistente e prolongada dos shRNAs
NOTA: É essencial realizar um experimento de transdução usando vetores lentivirais com diferentes promotores que expressam proteínas de fluorescência para identificar o promotor que fornece uma expressão estável....
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Resultados
O fluxo de trabalho de triagem geral é retratado na Figura 1A. A citotoxicidade in vitro do MV4-11 AraC R (48 h) revelou o IC50 para a citarabina no MV4-11 AraC R a ser maior que o MV4-11 P (Figura 1B). Esta linha celular foi utilizada no estudo como modelo para triagem dos fatores epigenéticos responsáveis pela resistência à cytarabina.
A Figura 2A mostra os mapas vetoriais pZIP.......
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Discussão
A interferência de RNA (RNAi) é amplamente utilizada para estudos de genômica funcional, que incluem a triagem de siRNA e shRNA. O benefício do shRNA é que eles podem ser incorporados em vetores plasmídeos e integrados ao DNA genômico, resultando em expressão estável e, portanto, mais longo knockdown do mRNA alvo. Uma triagem de biblioteca shRNA agrupada é robusta e econômica em comparação com as telas convencionais (siRNA). Identificar a essencialidade de uma classe específica de proteínas em uma tela de genoma pode ser.......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse e nada a revelar.
Agradecimentos
Este estudo é financiado em parte por uma bolsa do Departamento de Biotecnologia BT/PR8742/AGR/36/773/2013 à SRV; e Departamento de Biotecnologia Índia BT/COE/34/SP13432/2015 e Departamento de Ciência e Tecnologia, Índia: O EMR/2017/003880 para P.B. RVS e P.B. são apoiados pela Wellcome DBT India Alliance IA/S/17/1/503118 e IA/S/15/1/501842, respectivamente. A S.D. é apoiada pela bolsa CSIR-UGC, e a S.I. é apoiada por uma bolsa de pesquisa sênior do ICMR. Agradecemos a Abhirup Bagchi, Sandya Rani e a equipe do CSCR Flow Cytometry Core Facility por sua ajuda. Agradecemos também à MedGenome Inc. por ajudar com o sequenciamento de alto rendimento e análise de dados.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Reagents | |||
| 100 bp Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33025 | |
| 1kb Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33056 | |
| Agarose | Lonza Seachekm | 50004 | |
| Betaine (5mM) | Sigma | B03001VL | |
| Boric Acid | Qualigens | 12005 | |
| Plasticware | Corning | appicable | |
| citosina β-D-arabinofuranoside | Sigma | C1768-500MG | |
| DMEM | MP BIO | ||
| DMSO | Wak Chemie GMBH | Cryosure DMSO 10ml | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Brometo de | EtídioSigma | E1510-10 mL | |
| Soro Fetal Bovino | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Kit de Purificação em Gel/PCR | MACHEREY-NAGEL | REF 740609.50 | |
| Gibco- RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 23400021 | |
| Ácido Acético Glacial | Thermo | Q11007 | |
| hCMV GFP Plasmídeo | Transômica TransOmics | Seleção do promotor KIT | |
| hEF1a GFPlasmid | Transomics | TransOmics Seleção do promotor KIT | |
| HEK 293T | ATCC | CRL-11268 | |
| Linha celular HL60 | ATCC | CCL-240 | |
| KOD Hot Start Polimerase | Merck | 71086 | |
| Linha celular Molm13 | Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, EUA | Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, EUA | |
| Linha celular MV4-11 | ATCC | CRL-9591 | |
| Penicilina estreptomicina | Thermo Fisher Scientific | ||
| psPAX2 e pMD2.G | Addgene Addgene | plasmídeo no.12260 & Plasmídeo Addgene no. 12259 | |
| Qubit dsDNA HS Kit de Ensaio | Invitrogen | REF Q32854 | |
| SFFV GFP Plasmídeo | Transomics | TransOmics Seleção do promotor KIT | |
| shERWOOD-UltrmiR shRNA Library da Transomics | Transomics | Cat No. TLH UD7409; Nº do lote: A116. V 132.14 | |
| Trans-IT-LTI Mirus | Mirus | Mirus Número do catálogo: MIR2300 | |
| Tris | MP Biomedicals | 0219485591 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | |
| Beckman Coulter | 103319 | ||
| Equipamentos | |||
| 5% CO2 incubadora | Thermo Fisher | ||
| BD Aria III classificador de células | Becton Dickinson | ||
| Beckman Coulter Optima L-100K- Ultracentrifugação | Beckman coulter | ||
| Centrifuge | Thermo Multiguge 3SR+ | ||
| Sistema de imagem ChemiDoc( Sistema Fluro Chem M) | Fluro Chem | ||
| Leica AF600 | Leica | ||
| Light Microscópio | Zeiss Axiovert 40c | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Qubit 3.0 Fluorômetro | Invitrogen | ||
| Termociclador | BioRad |
Referências
- Döhner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. Acute myeloid leukemia. The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).
- De Kouchkovsky, I., Abdul-Hay, M. Acute myeloid leukemia: A comprehensive review and 2016 update. Blood Cancer Journal. 6 (7), 441(201....
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Reimpressões e permissões
