Triagem de biblioteca shRNA agrupada para identificar fatores que modulam um fenótipo de resistência a drogas

As opções terapêuticas na leucemia mielóide aguda (LMA) permaneceram inalteradas por quase cinco décadas, com a cytarabina (AraC) e as anthracycraclines como a pedra angular para o tratamento da doença. Um dos desafios para o sucesso da terapia LMA é a resistência das células-tronco leucêmicas à quimioterapia, levando à recaída da doença ^1,2. A regulação epigenética desempenha um papel vital na patogênese do câncer e na resistência a medicamentos, e vários fatores epigenéticos surgiram como alvos terapêuticos promissores ^3,4,5. Os mecanismos regulatórios epigenéticos afetam a proliferação e a sobrevivência sob exposição contínua a drogas quimioterápicas. Estudos em malignidades não hematológicas relataram que uma pequena fração de células que superam o efeito da droga sofrem várias modificações epigenéticas, resultando na sobrevivência dessas células ^6,7. No entanto, o papel dos fatores epigenéticos na mediação da resistência adquirida à cytarabina na LMA não foi explorado.

A triagem de alto rendimento é uma abordagem para a descoberta de drogas que ganhou importância global ao longo do tempo e tornou-se um método padrão em diferentes aspectos para identificar potenciais alvos em mecanismos celulares, para perfilamento de caminhos e no nível molecular ^8,9. O conceito de letalidade sintética envolve a interação entre dois genes onde a perturbação de qualquer gene sozinho é viável, mas de ambos os genes simultaneamente resulta na perda de viabilidade¹⁰. Explorar a letalidade sintética no tratamento do câncer pode ajudar a identificar e caracterizar mecanicamente interações genéticas letais sintéticas^{robustas 11}. Adotamos uma abordagem combinatória de triagem de shRNA de alto rendimento com letalidade sintética para identificar os fatores epigenéticos responsáveis pela aquisição da resistência à cytarabina na LMA.

Leucemias agudas impulsionadas pela translocação cromossômica do gene de leucemia de linhagem mista (MLL ou KMT2A) são conhecidas por estarem associadas à má sobrevivência em pacientes. Os produtos quiméricos resultantes dos rearranjos genéticos de MLL , ou seja, proteínas de fusão de MLL (MLL-FPs), podem transformar células hematopoiéticas de tronco/progenitor (HSPCs) em explosões leucêmicas com o envolvimento de múltiplos fatores epigenéticos. Esses reguladores epigenéticos constituem uma rede complicada que dita a manutenção do programa de leucemia e, portanto, poderia formar potenciais alvos terapêuticos. Neste contexto, utilizamos a linha celular MV4-11 (abrigando o gene de fusão MLL-AF4 com a mutação FLT3-ITD; denominada como MV4-11 P) para desenvolver a linha celular resistente à cytarabina adquirida, denominada MV4-11 AraC R. A linha celular foi exposta ao aumento de doses de cytarabina com recuperação intermitente do tratamento medicamentoso, conhecido como feriado medicamentoso. A concentração inibitória semi-máxima (IC50) foi avaliada pelo ensaio de citoxicidade in vitro .

Utilizamos a biblioteca de shRNA epigenética agrupada (ver Tabela de Materiais) impulsionada pelo promotor hEF1a com uma espinha dorsal lentiviral pZIP. Esta biblioteca compreende shRNAs visando 407 fatores epigenéticos. Cada fator tem 5-24 shRNAs, com um total de 5.485 shRNAs, incluindo cinco shRNAs de controle não direcionados. O andaime miR-30 modificado "UltrmiR" foi otimizado para biogênese e expressão primária eficiente^12,13.

O esboço deste experimento é ilustrado na Figura 1A. O protocolo atual concentra-se na triagem RNAi usando a biblioteca de fator epigenético shRNA na linha de células R MV4-11 (Figura 1B), uma linha celular de suspensão. Este protocolo pode ser usado para selecionar qualquer biblioteca direcionada em qualquer linha celular resistente a medicamentos de sua escolha. Deve-se notar que o protocolo de transdução será diferente para as células aderentes.

Siga as diretrizes do Comitê de Biossegurança Institucional (IBSC) e use a facilidade adequada para lidar com lentivírus (BSL-2). O pessoal deve ser devidamente treinado no manuseio e eliminação do lentivírus. Este protocolo segue as diretrizes de biossegurança da Christian Medical College, Vellore.

1. Seleção do promotor mais potente para obter expressão persistente e prolongada dos shRNAs

NOTA: É essencial realizar um experimento de transdução usando vetores lentivirais com diferentes promotores que expressam proteínas de fluorescência para identificar o promotor que fornece uma expressão estável e de longo prazo de shRNAs na linha celular selecionada para o experimento. Os promotores mais utilizados para este fim são os promotores hEF1α (fator de alongamento humano 1α), hCMV (citomegalovírus humano) e promotores de SSFV (vírus formador de foco de baço) que expressam proteína de fluorescência verde (GFP) (Figura 2A).

1. Execute a contagem de células usando o método de exclusão azul trypan. Suspenda as células MV4-11 AraC R em 10% de RPMI médio (RPMI com 10% de FBS suplementados com penicilina de 100 U/mL e estreptomicina U/mL) contendo polibrene de 8 μg/mL. Semente 1 x 10⁶ células em 1,5 mL de média/poço de uma placa de seis poços em triplicados.
2. Adicione diferentes volumes de lentivírus concentrados (por exemplo, 10 μL, 20 μL e 40 μL, dependendo do título das lentivírus) a cada poço. Gire suavemente a placa para misturar o conteúdo.
3. Realize a spinfection por centrifugação a 920 x g a 37 °C por 90 min.
4. Incubar imediatamente as placas em uma incubadora de CO₂ (5% de CO₂ a 37 °C).
5. Observe a expressão GFP após 48 h sob um microscópio de fluorescência para garantir uma transdução bem sucedida.
6. Quantifique a expressão GFP por citometria de fluxo após 72 h para avaliar a eficiência da transdução.
7. Cultume as células por um total de 2 semanas e monitore a expressão GFP periodicamente por citometria de fluxo. A redução da expressão GFP medida pela intensidade média da fluorescência e o percentual de células GFP+ indicam silenciamento do promotor.
8. Classifique as células GFP+ no 10º dia e cultue as células por 1 semana após a triagem. Verifique periodicamente a expressão GFP durante a cultura.
9. Use as células não traduzidas para definir o portão. Uma população além da escala 1 x 10¹ em direção à direita no eixo x é considerada uma população positiva para gfp.
10. Escolha o promotor que mostra uma expressão persistente de GFP na cultura prolongada das células.

2. Preparação de biblioteca de fator epigenético humano lentiviral agrupado

1. Cultura 293T células (em um número de passagem baixa com uma boa taxa de proliferação) em três pratos de cultura celular de 10 cm com 8 mL de 10% de mMEM médio (DMEM com 10% FBS contendo 100 U/ml penicilina e 100 U/ml streptomicina) em cada placa.
2. Uma vez que as células atinjam 60% de confluência, substitua o meio por um meio completo.
3. Prepare o mix de transfecção (conforme descrito na Tabela 1) que contém meio sem soro, embalagens lentivirais (psPAX2) e plasmídeo de envelope (pMD2.G), plasmídeos de biblioteca agrupados e, finalmente, o reagente de transfecção.
4. Bata na mistura para misturar bem e incubar à temperatura ambiente por 15 minutos.
5. Adicione a mistura de transfecção às células 293T e misture suavemente girando as placas. Incubar as placas em uma incubadora de CO₂ (5% DE CO₂ a 37 °C). Troque o meio depois das 24h.
6. Após 48 h, verifique se há expressão GFP sob um microscópio de fluorescência para garantir alta eficiência de transfecção nas células 293T.
7. Recolhe os supernacantes do vírus após 48h, 60 h e 72 h e armazena-os a 4 °C. Adicione um meio fresco (8 mL) em cada ponto de tempo após a coleta do vírus.
8. Juntar os supernantes do vírus. O volume total dos vírus agrupados será: ~8 mL/placa x 3 coleções= ~24 mL/placa; ~24 mL/placa x 3 placas = ~72 mL de 3 placas.
9. Filtre os vírus agrupados com o filtro de 0,4 μm.
10. Para obter um alto título de vírus, concentre os vírus agrupados por ultracentrifugação. Transfira o vírus filtrado supernante para dois tubos de 70 Ti (32 mL/tubo) e centrífuga a 18.000x g por 2 h com aceleração lenta e desaceleração. Use um rotor e centrífuga pré-cozido a 4 °C.
11. Retire os tubos da centrífuga suavemente e remova o sobrenatante completamente.
12. Usando uma micropipette, resuspenque suavemente a pelota em 400 μL de DMEM (sem FBS e antibióticos). Incubar no gelo por 1h e misturar as pelotas de ambos os tubos.
13. Aliquot os vírus e congele a −80 °C.
    NOTA: Os tubos e vírus devem ser mantidos no gelo durante as etapas 2.10.-2.13. Evite espumar enquanto reaprúlado do vírus com o meio simples. O médio deve ser mantido a 4 °C.
14. Calcule a concentração (x) do vírus conforme abaixo:
    Volume total antes da concentração = 72 mL (72.000 μL)
    Volume após concentração = 400 μL
    A concentração = 72.000/400= 180x

3. Estimativa da eficiência de transdução de lentivírus

1. Transdutor células 293T com o vírus concentrado em diferentes volumes (2 μL, 4 μL, 8 μL) para confirmar a preparação bem sucedida de lentivírus.
   NOTA: Se os vírus concentrados apresentarem alta eficiência de transdução (>50%) em pequenos volumes (1-2 μL), é aconselhável diluir o vírus concentrado nas quantidades desejadas (100x a 75x).
2. Diluir o vírus concentrado para 100x com DMEM (sem FBS e antibióticos) para realizar experimentos de titulação na linha celular MV4-11 AraC R.
3. Semente 1 x 10⁶ células (linha de célulaS AraC R MV4-11 em 1,5 mL de 10% de meio RPMI contendo 8 μg/mL de polibrene) em um poço de uma placa de seis poços. Prepare quatro poços para transdução com diferentes volumes de vírus.
4. Adicione quatro volumes diferentes (por exemplo, 1 μL, 1,5 μL, 2 μL e 2,5 μL) de vírus de 100x.
5. Realize a spinfection por centrifugação da placa a 920 x g por 90 min a 37 °C.
6. Após 72 h, meça a porcentagem de células GFP+ por citometria de fluxo.
7. Determine o volume dos vírus para obter 30% de eficiência de transdução. Esta baixa eficiência de transdução é para garantir uma integração única de shRNA por célula.

4. Transdução da biblioteca de shRNA epigenética agrupada na linha celular resistente a medicamentos

1. Mantenha a linha de células alvo MV4-11 AraC R a uma densidade de 0,5 x 10⁶ células/mL. Certifique-se de que as células estão na fase exponencial de crescimento da cultura.
2. Calcule o número de células a serem tomadas para o experimento conforme abaixo com base no número de integradores virais.
   Número de células necessárias para a transdução = 5.485 (número de shRNAs) × 500 (representação do shRNA do fold) / 0,25 (MOI) = 10.982.000 ~11 x 10⁶ células
3. Resuspend 1.1 x 10⁷ células em 16 mL de 10% de meio RPMI.
4. Adicione polibreno (8 μg/mL) e misture bem. Em seguida, adicione o volume necessário de vírus para obter 30% de eficiência de transdução conforme calculado na seção anterior.
5. Semente todas as células em uma placa de seis poços a uma densidade de 1 x 10⁶ células / 1,5 mL de 10% RPMI médio por poço.
6. Centrifugar a placa por 90 min a 920 x g a 37 °C.
7. Incubar a placa durante a noite em uma incubadora de CO₂ (5% de CO₂ a 37 °C).
8. Após 24 horas, mude o meio e transfira as células transduzidas para um frasco T-75.
9. Após 48 h, verifique o GFP sob um microscópio de fluorescência para garantir uma transdução bem sucedida.
10. Após 72 h, quantita a porcentagem de células GFP+ por citometria de fluxo.

5. Enriquecimento de células positivas de GFP

NOTA: Expanda as células transduzidas, culminando-as a uma densidade de 0,5 x 10⁶ células/mL por 5-7 dias. Essas células são uma população mista de transduzidas e não traduzidas, selecionadas com base na GFP por classificação, como mencionado na etapa seguinte.

1. Realize a triagem de fluxo de células transduzidas GFP+ com as configurações de classificação de fluxo definidas como alta pureza e baixo rendimento. Use as células não traduzidas para definir o portão. Uma população além de 1 x 10² para a direita é considerada uma população positiva.
2. Colete as células classificadas em 5% RPMI (RPMI com 5% de FBS suplementados com penicilina U/mL e estreptomicina de 100 U/mL).
3. Cultume as células classificadas em um meio 10% RPMI.
4. Após 72 h, realize a estimativa pós-classificação do percentual de células GFP+ para garantir >95% de eficiência de classificação.
   NOTA: Certifique-se de obter ~3-5 x 10⁶ células positivas GFP após a classificação para obter 450x a ~500x de representação da biblioteca shRNA.

6. Triagem de abandono para identificar fatores epigenéticos que mediam a resistência a medicamentos

1. Cultura a biblioteca shRNA células transduzidas em 10% RPMI por até 5 dias. Criopreserve as células transduzidas para experimentos futuros, se necessário, antes do tratamento medicamentoso.
2. Centrifugar 1 x 10⁷ células em duplicatas a 280 x g por 5 min a 25 °C. Descarte o supernatante e armazene as pelotas a −80 °C. Essas amostras servirão como referência de base para a biblioteca epigenética shRNA.
3. Cultura as células transduzidas restantes como duplicatas (R1 e R2), cada uma mantida em uma contagem de células que fornece uma representação de 500x da biblioteca.
4. Trate uma das duplicatas com a droga (10 μM cytarabine) (R2) e a outra sem o tratamento medicamentoso (R1).
5. Troque o meio para os frascos com e sem a droga a cada 72 horas. Repita a troca média 3x para uma exposição cumulativa de 9 dias.
6. Após 9 dias de tratamento medicamentoso, verifique a viabilidade das células pelo método de exclusão azul trypan.
7. Centrifugar as células restantes a 280 x g por 5 min a temperatura ambiente. Resuspenque as células em PBS estérei e lave as células. Centrifugar a 280 x g por 5 min a temperatura ambiente.
8. Descarte o supernatante e armazene as pelotas a −80 °C para extração de DNA.

7. Amplificação dos shRNAs integrados por PCR

1. Extrair DNA das células de base transduzidas (T) (passo 6.2.) e as células tratadas com a droga (R2) e não tratadas com a droga (R1).
2. Verifique a concentração da amostra usando um fluorômetro.
3. Calcule a quantidade de DNA necessária para pcr como abaixo:
   5.485 (não. de shRNAs) × 500 (representação shRNA) × 1 x 6,6⁻¹² (g/genoma diploide) = 15 μg de DNA
4. Sujeito as amostras à primeira rodada de PCR.
   NOTA: A mistura de reação pcr é retratada na Tabela 2 com as condições do cicloviário térmico. Os detalhes das primers estão fornecidos na Tabela Suplementar 1.
5. Configure múltiplas reações contendo 850 ng de DNA por tubo (para um total de 43 reações).
   NOTA: A primeira rodada de PCR amplifica as regiões de flanqueamento do shRNA resultando em um tamanho de amplicon de 397 bp.
6. Acumule os produtos PCR e purifique os produtos PCR usando 3-4 colunas de um kit de purificação padrão gel/PCR.
   NOTA: Os detalhes estão fornecidos na Tabela 3.
7. Elute o produto em 50 μL de tampão de cada coluna e acumule os elutes.
8. Quantifique o DNA e armazene-o a −20 °C.
   NOTA: Os reagentes são tabulados na Tabela 4 com as condições do cicloviário térmico. O PCR de segunda rodada utiliza os primers com a sequência INDEX necessária para multiplexing em NGS em uma célula de fluxo único. Assim, cada amostra deve ser marcada com um índice diferente. As sequências de primer são fornecidas na Tabela Suplementar 1.
9. Configure quatro reações com 500 ng do produto PCR primário em um volume total de reação de 50 μL para cada amostra e o controle negativo.
10. Carregue todo o produto para eletroforese usando gel de agarose 2% TBE e confirme o tamanho da banda usando uma escada molecular de 1 kb. O tamanho do amplicon é de 399 bp.
11. Visualize os produtos PCR no sistema de documentação do gel.
12. Extirpa a banda específica e purificar usando um kit de purificação de gel.
    NOTA: Os cálculos para purificação com o kit estão fornecidos na Tabela 3.
13. Elute em um volume final de 30 μL de tampão de eluição. A concentração aproximada de cada eluente será em torno de 80-90 ng/μL com um volume total de 30 μL.

8. Sequenciamento e análise de dados de última geração

1. Sequencie o produto purificado em gel a partir da etapa 7.13. em um sequenciador de próxima geração (por exemplo, Illumina) para obter a contagem de leitura para os shRNAs esgotados.
2. Aparar as sequências adaptadoras do FastQ gerados usando o kit de ferramentas Fastx (versão 0.7).
3. Alinhe as leituras filtradas às sequências de referência usando um alinhador Bowtie com o parâmetro de permitir dois desencontros. Certifique-se de que o comprimento de leitura após o corte do adaptador é de cerca de 21 bp.
4. Carregue os arquivos usando o programa Samtools (versão 1.9). Use a opção Flagstat e calcule o resumo de alinhamento.
5. Carregue os arquivos fastQ aparados no software CRISPRCloud2 (CC2) (https://crispr.nrihub.org/) juntamente com as sequências de shRNA de referência na forma de arquivos FASTA e realize a análise de acordo com as instruções.
   1. Clique no link Análise de Início no CC2.
   2. Selecione o tipo de tela como telas de sobrevivência e abandono. Defina o número de grupos e digite o nome de cada grupo.
   3. Faça upload da biblioteca de referência no formato de arquivo FASTA. Os dados carregados são processados. Clique na URL de saída para obter os resultados.
      NOTA: Este software usa um modelo beta-binomial com um teste t-t de um aluno modificado para medir diferenças nos níveis de sgRNA/shRNA, seguido pelo teste combinado de probabilidade de Fisher para estimar a significância do nível genético. Ele calcula alterações de log₂ vezes (Log2Fc) estimadas para os fatores epigenéticos entre os tratados (enriquecidos/esgotados) e as amostras não tratadas (linha de base) com "valores p" e "valores FDR".
6. Certifique-se de que o valor FDR seja "Negativo" para uma tela dropout e "Positive" para uma tela Survival.
   NOTA: CC2 é uma plataforma de análise para contar as leituras e calcular a representação da dobra (enriquecimento ou esgotamento) de shRNAs entre as amostras.
7. Identificar os shRNAs significativamente enriquecidos e esgotados (FDR <0,05) dos resultados do CC2.
   NOTA: Existem 5-24 shRNAs contra cada fator. Verifique os valores fdr para cada um dos shRNAs; considere o FDR, que é <0,01, e tome uma média para os shRNAs selecionados. Considere os 40 melhores hits. Plote o gráfico para os fatores selecionados com base nos valores negativos do Log2Fc ou FDR. Certifique-se de que os shRNAs não direcionados também tenham valores FDR significativos para garantir a autenticidade dos dados à medida que servem como shRNAs de controle.

O fluxo de trabalho de triagem geral é retratado na Figura 1A. A citotoxicidade in vitro do MV4-11 AraC R (48 h) revelou o IC50 para a citarabina no MV4-11 AraC R a ser maior que o MV4-11 P (Figura 1B). Esta linha celular foi utilizada no estudo como modelo para triagem dos fatores epigenéticos responsáveis pela resistência à cytarabina.

A Figura 2A mostra os mapas vetoriais pZIP linearizados com três promotores diferentes: hEF1α (fator de alongamento humano 1α), hCMV (citomegalovírus humano) e SSFV (vírus formador de foco de baço), com o shRNA mexido dentro da sequência UltramiR. A Figura 2B ilustra o mapa vetorial pZIP usado no experimento da biblioteca e o shRNA visando o fator epigenético com Zsgreen e puromicina como o marcador selecionável impulsionado pelo promotor hEF1a. Esses vetores foram utilizados na seleção do experimento de promotor mais potente.

A seleção do promotor mais potente para obter uma expressão consistente e prolongada nas células-alvo é ilustrada na Figura 3. A quantificação do GFP medido pelo MFI mostrou mais de 90% de eficiência de transdução no final de 72 h em MV4-11 AraC R para os três promotores. O histograma para expressão GFP mostra uma população heterogênea para o HCMV, mas homogênea no caso de hEF1a e SFFV no dia 3 da transdução (Figura 3A). O gráfico da barra mostra a expressão GFP impulsionada por três promotores diferentes (hEF1α, hCMV e SFFV) no dia 3 da transdução em MV4-11 AraC R (Figura 3B). O GFP orientado pelo SFFV apresentou redução da FIM no quinto dia de transdução (Figura 3C). Não foi observada diminuição da IFA no pós-classificação da linha parental MV4-11 transduzida por HEF1a. Assim, o promotor hEF1a foi identificado como promotor adequado para a linha celular (Figura 3D).

A Figura 4A ilustra a eficiência de transfecção dos plasmídeos de biblioteca shRNA agrupados em células 293T após 48 h de transfecção. A expressão GFP era brilhante, indicando boa eficiência de transfecção. Após a coleta de vírus, a eficiência de transdução do vírus agrupado preparado foi verificada em células 293T em três concentrações diferentes (2 μL, 4 μL e 8 μL). Observamos que mesmo o vírus 2 μL resultou na mesma eficiência do vírus de 8 μL, confirmando assim o alto título viral (Figura 4B).

A Figura 5 ilustra a transdução da biblioteca agrupada na linha celular MV4-11 AraC R e a determinação do titer lentiviral. O lentivírus da biblioteca shRNA agrupado foi diluído 100x e, em seguida, adicionado à linha de células MV4-11 AraC R em diferentes volumes (1 μL, 1,5 μL, 2 μL e 2,5 μL). A eficiência foi verificada no final das 72 h. A eficiência da transdução foi de 30% para 2-2,5 μL do vírus, confirmando uma integração shRNA por célula (Figura 5A). A transdução com 2,5μl de vírus de biblioteca agrupada em células R 1,1 x 107 MV4-11 resultou em 30% de eficiência de transdução. Foram classificadas células GFP positivos, representando a biblioteca shRNA agrupada (Figura 5B).

Após a transdução de lentivírus epigenético shRNA agrupado na linha celular MV4-11 AraC R, as células GFP positivos foram classificadas no dia 5 ou dia 7 (Figura 6). Estas células classificadas foram submetidas à exposição prolongada à citarabina por 9 dias. A viabilidade foi verificada no 9º dia, e as células foram coletadas para DNA. (Figura 6A). O gráfico da barra mostra a redução da taxa de proliferação das células transduzidas na presença de citarabina (Figura 6B).

O DNA extraído das amostras foi submetido a duas rodadas de PCR, e o produto final elucido em gel representou os shRNAs enriquecidos quantificados por NGS. A Figura 7A mostra as regiões de ligação do primer usado na 1ª e 2ª rodada do PCR, onde os primers da 1ª rodada se ligam às regiões de flanqueamento do shRNA integrado, e o primer 2º dianteiro se liga à sequência de loop. O primer reverso se liga a uma região do vetor amplificado na 1ª rodada do PCR. A Figura 7B e a Figura 7C ilustram o tamanho da banda do produto PCR no final de 1º (397 bp) e a 2ª rodada pcr (399 bp), que foi eluida, purificada e submetida à análise de NGS.

Após submeter o DNA a um procedimento padrão de controle de qualidade, as amostras foram processadas para análise de NGS. Usamos o CRISPRCloud2, uma plataforma de análise baseada em nuvem para identificar shRNAs enriquecidos e esgotados na triagem de shRNA agrupada. A Figura 8 ilustra a representação de shRNAs enriquecidos ou esgotados visando fatores epigenéticos que poderiam mediar a resistência à cytarabina na LMA.

Figura 1: Contorno e modelo do estudo. (A) Ilustração da visão geral do fluxo de trabalho. (B) Células parentais e resistentes a AraC tratadas com concentrações crescentes de cytarabina (0,1 μM a 1000 μM) e avaliadas viabilidade pelo ensaio MTT. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Ilustração dos vetores linearizados. (A) Os três mapas vetoriais com três promotores diferentes, hEF1α (fator de alongamento humano 1α), hCMV (citomegalovírus humano) e SSFV (vírus formador de foco de baço), com o shRNA mexido dentro da sequência UltramiR. (B) Ilustração do mapa vetorial utilizado no experimento da biblioteca com o promotor hEF1α e o shRNA visando o fator epigenético com Zsgreen e puromicina como marcador selecionável. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Seleção do promotor mais potente para obter expressão persistente e prolongada dos shRNAs. (A) Parcelas de fluxo representativas para GFP quantificadas por citometria de fluxo no final de 72 h para os promotores hEF1a, hCMV e SFFV. hCMV mostra um pico heterogêneo, enquanto hEF1a e SFFV mostram um único pico homogêneo. (B) Eficiência do promotor na linha de células AraC R MV4-11. (C) O GFP orientado pelo SFFV mostra o silenciamento do GFP na cultura prolongada. (D) células GFP orientadas por hEF1a mostram a classificação sustentada da postura das células. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Verificar a eficiência do shRNA lentivírus de piscina preparado. (A) Imagens de microscopia de fluorescência mostram a eficiência de transfecção da biblioteca shRNA agrupada transfeccionada em 293T no final de 48 h usando a ampliação de 10x. (B) A eficiência de transdução do vírus agrupado foi avaliada em células 293T com volumes de vírus variados (2μL, 4μL e 8μL) utilizando ampliação de 10x. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Transdução de biblioteca agrupada na linha celular alvo e determinação da linha celular lentiviral( A) MV4-11 AraC R transduzida com volumes variados de vírus (1μL, 1,5μL, 2μL e 2,5μL). A eficiência foi verificada no final de 72 h. (B) Transdução do vírus da biblioteca agrupada em 1 x 107 MV4-11 Células AraC R para alcançar 30% de eficiência de transdução, em seguida, classificação de células GFP positivos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Rastreamento de abandono para identificar fatores epigenéticos que mediam a resistência medicamentosa. (A) Ilustração esquemática do tratamento medicamentoso para o enriquecimento de células resistentes. As células infectadas pela biblioteca foram submetidas à exposição prolongada à cytarabina por 9 dias, seguidas pela verificação da viabilidade e coleta das células para extração de DNA. (B) Redução da viabilidade à exposição prolongada da cytarabina em linhas celulares resistentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Preparação dos amplicons representando o shRNA integrado. (A) As regiões de ligação do primer utilizadas na 1ª e 2ª rodada do PCR, onde os primers da 1ª rodada se ligam às regiões de flanqueamento do shRNA integrado e o segundo primer dianteiro se liga à sequência de loop. O inverso se liga a uma região da região vetorial amplificada no 1º PCR. (B) Ilustração do tamanho da banda do produto PCR no final da 1ª rodada pcr (397 bp). (C) O produto PCR da 2ª rodada (399bp) foi elucido, purificado e dado para NGS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: Resultados de triagem na linha celular AML (linha celular Ara-C R MV-4-11). Após submeter o DNA a um procedimento padrão de controle de qualidade, as amostras foram processadas para análise de NGS. Usamos o CRISPRCloud2, uma plataforma de análise baseada em nuvem, para identificar shRNAs enriquecidos e esgotados na triagem de shRNA agrupada.  A figura representa shRNAs enriquecidos ou esgotados visando fatores epigenéticos que poderiam mediar a resistência à cytarabina na LMA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Preparação da Mistura de Plasmid transfecção (Cálculo para placa de 10cm) Clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 2: Mistura de reação PCR para1ª Rodada do PCR Clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 3: Cálculos para purificação dos produtos do 1º do PCR Clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 4: Mistura de reação PCR para 2ª Rodada do PCR Clique aqui para baixar esta Tabela.

Os autores não têm conflitos de interesse e nada a revelar.