Bioensaio de aplicação tópico para quantificar toxicidade de inseticida para mosquitos e moscas de frutas

Os mosquitos são responsáveis por mais de 700.000 mortes por ano devido às doenças que transmitem aos seres humanos, com mais da metade dessas mortes por malária apenas¹. O principal método preventivo contra a transmissão da malária e outras doenças transmitidas por vetores é o uso de inseticidas, muitas vezes na forma de redes de inseticidas de longa duração ou pulverização residual^{interna 2}. No entanto, a resistência a inseticidas é generalizada entre mosquitos e outros vetores de insetos, bem como pragas agrícolas ^3,4. Para gerenciar efetivamente a resistência, a vigilância é de fundamental importância⁵. Para isso, são necessários métodos de detecção de resistência altamente precisos e de alto rendimento. Atualmente, as ferramentas de vigilância de resistência a inseticidas mais difundidas para mosquitos são o teste de tubo da OMS⁶ e o bioensaio de garrafa CDC⁷. Para moscas de frutas, o método de aplicação de contato residual (semelhante ao bioensaio da garrafa CDC) é um bioensaio deseticida comumente usado ^8,9,10. No entanto, a variabilidade nos dados desses métodos é tipicamente alta, com medidas da mesma cepa de mosquitos de laboratório variando de ~20-70% de mortalidade em ensaios de garrafas CDC e 0-50% em testes de tubos da OMS quando expostos a dosagens subletaras¹¹. Tal variação é surpreendente porque espera-se que a variação genética limitada na maioria das cepas laboratoriais leve a uma variação limitada de suscetibilidade de inseticidas na população. No entanto, ainda há um alto nível de variação observado nos resultados do bioensaio.

Fontes potenciais dessa variação podem ser resultado da exposição heterogênea de inseticida entre espécimes dentro do bioensaio devido à exposição indireta de inseticidas através da superfície, efeitos ambientais heterogêneos, variação biológica normal entre indivíduos do mesmo genótipo e variação na massa de espécimes da mesma população¹² . Um método pouco utilizado com maior replicabilidade é o bioensaio de aplicação tópico. Neste ensaio, o inseticida é diretamente aplicado a cada inseto^13,14, removendo o fator de exposição heterogênea de diferentes espécimes dentro do mesmo ensaio. No entanto, devido à natureza de rendimento lento deste método, ele não é usado rotineiramente como ferramenta de vigilância de suscetibilidade de inseticidas para populações de mosquitos. Este artigo apresenta um protocolo modificado para o bioensaio de aplicação tópica que permite exposições de maior rendimento, ao mesmo tempo em que corrige a variação da massa de insetos, parâmetro que se correlaciona com alterações na suscetibilidade de inseticida¹². A redução do ruído e da variação de massa nos dados de mortalidade por exposição variável a inseticidas permitiria uma vigilância de resistência técnica mais precisa^11,15. Esses dados poderiam ser usados para associar com mais precisão a resistência fenotípica com marcadores genéticos, parâmetros de aptidão e/ou competência vetorial. Além disso, demonstramos como este ensaio poderia ser facilmente adaptado a outras espécies de insetos usando o bioensaio de aplicação tópica em moscas frutíferas, uma espécie de inseto de menor corpo.

A principal limitação das aplicações de contato residual acima mencionadas é que a exposição a inseticidas pode variar de espécime para espécime dentro do mesmo ensaio. No caso de bioensações de garrafas CDC e do método de contato, a exposição a inseticidas pode variar entre as réplicas do mesmo ensaio. Os insetos são expostos a inseticida que é distribuída no interior de uma garrafa de vidro (bioensaio de garrafa CDC e método de contato) ou em papéis impregnados (teste de tubo da OMS). A concentração de inseticida em ambas as superfícies (vidro e papel) é conhecida e predeterminada pela triagem de diferentes espécies de genótipos conhecidos. No entanto, a quantidade disponível para potencialmente ser absorvida pelo inseto pode variar muito dependendo da superfície utilizada, dos componentes da mistura de inseticidas e de quão homogêneo o inseticida é distribuído através do material superficial^16,17. No bioensaio da garrafa CDC, o revestimento de inseticida no interior da garrafa depende dos procedimentos empregados por cada laboratório e usuário. No teste do tubo da OMS, os papéis tratados com inseticida são produzidos centralmente e, portanto, provavelmente bastante homogêneos entre os laboratórios. No entanto, no teste do tubo da OMS, o tubo de exposição permite que as amostras aterrissem e repousem sobre a malha metálica não exposta a inseticidas, levando a uma exposição potencial heterogênea de inseticida entre as amostras dentro de cada teste. A quantidade real de inseticida captada e absorvida por espécimes através de cada método ainda precisa ser explorada mais¹⁸.

Além disso, o bioensaio de garrafa CDC, o teste do tubo da OMS e o método de contato são mais comumente usados como ensaios limiares testando apenas uma concentração de inseticida pré-determinada. Essa abordagem pode detectar com precisão a presença de resistência e é valiosa para a vigilância de resistência (especialmente quando a resistência está se espalhando). No entanto, os ensaios limiares não podem quantificar a força da resistência, o que pode ser mais preditivo da eficácia das ferramentas de intervenção. Se múltiplas concentrações de inseticidas forem usadas com esses métodos, elas podem ser usadas como ensaios de intensidade. Ensaios de intensidade para o bioensaio de garrafas CDC e o teste do tubo da OMS foram introduzidos através do teste de 5x e 10x as doses discriminantes predeterminadas para resolver essa lacuna na vigilância ^6,19. Ao mesmo tempo em que proporciona maior capacidade de diferenciar entre populações resistentes, as doses de 3-5 (predeterminadas) fornecem resolução limitada para calcular concentrações letais. Além disso, mosquitos de vários tamanhos são usados em tais ensaios. No entanto, a massa é importante de medir, pois espécimes maiores podem precisar de uma dose maior para serem mortos, pois a dose eficaz por unidade de massa será muito menor do que a de um organismo menor¹². Calcular uma dose letal relativizada em massa (quantidade de inseticida por massa de insetos) seria uma métrica mais útil do que a concentração letal mais comum (por exemplo, quantidade de inseticida por área de superfície) pois considera a variação da massa de insetos entre sexos, populações e genótipos. Tais dados ajudariam a preencher a lacuna entre a resistência genotípica e fenotípica dentro do laboratório e do campo e também poderiam fornecer uma maneira fácil de calcular a concentração de aplicação necessária para tratar uma população de insetos de uma massa média conhecida.

O uso de doses letais relativizadas em massa que matam 50% dos espécimes (LD₅₀) também incorpora vários outros benefícios. A avaliação da toxicidade de um composto específico em mg/kg (= ng/mg) é padrão na toxicologia humana e veterinária¹⁴, e os valores de LD₅₀ são encontrados nas folhas de dados de segurança do material. As doses letais também permitem a comparação direta da toxicidade entre diferentes produtos químicos em relação a uma determinada espécie ou o mesmo produto químico para diferentes espécies²⁰, bem como avaliação de alta qualidade de novos inseticidas e produtos químicos¹³. Além disso, o LD₅₀ pode fornecer razões de resistência mais significativas e precisas do que aquelas derivadas dos resultados de mortalidade por dose diagnóstica, o que pode resultar em uma superestimação do nível de resistência presente em uma população. Portanto, este ensaio seria adequado para programas de vigilância de rotina, fornecendo um monitoramento de resistência mais rigoroso com base em doses letais relativizadas em massa derivadas de mais espécimes do que o recomendado para outros bioensasseos²¹.

O método de aplicação tópica tem sido usado na vigilância de suscetibilidade de inseticidas para mosquitos e moscas como alternativa para os bioensitárias de suscetibilidade de inseticidas padrão quando a resistência já é conhecida ou suspeita^{de 22,23}, bem como para vigilância em alguns insetos^{de pragas 24} para avaliar com mais precisão perfis de resistência e toxicidade intrínseca intrínsecnica²¹ . Em bioensações de aplicação tópica, o inseticida é aplicado a cada organismo, resultando em variação mínima na exposição a inseticidas. Este artigo apresenta um método ligeiramente adaptado e aprimorado que permite que a exposição a inseticidas seja aplicada a um grande número de insetos em um curto período, ao mesmo tempo em que controla a massa de insetos²². Este método de maior rendimento com bons níveis de replicabilidade pode ser uma ferramenta adicional útil para a vigilância de suscetibilidade de inseticidas de rotina.

NOTA: Inseticidas podem causar riscos humanos, animais e ambientais²⁵. Cuidados, treinamento e equipamentos de proteção individual são altamente aconselhados. Certifique-se de seguir as folhas de dados de segurança do material para todos os inseticidas e solventes utilizados.

1. Espécimes traseiros

1. Mosquitos adultos de 3 a 5 dias.
   NOTA: O protocolo abaixo reflete as condições para a criação do Aedes aegypti , seguindo de perto a Organização das Nações Unidas para a Alimentação e a Agricultura das Diretrizes²⁶.
   1. Mosquitos traseiros de todas as etapas da vida a 27 ± 1 °C e 75 ± umidade relativa de 5% com 12:12 h de ciclismo claro e escuro.
   2. Eclode os ovos do mosquito submergindo-os em água deionizada e adicionando levedura²⁶, ou coloque os ovos submersos dentro de uma câmara de vácuo por 30 minutos.
      NOTA: Ambos os métodos diminuem o teor de oxigênio dentro da água e aumentam a eclosão²⁷.
   3. Alimente os alimentos de peixes larvas recém-eclodidos (ou uma dieta equivalente, como kibble de gato moído) dentro de bandejas e mantenha a densidade larval o mais semelhante possível entre bandejas como a densidade larval impacta o desenvolvimento¹² (por exemplo, 200-250 larvas por bandeja contendo um total de 1,5 L de água).
   4. Alimente as larvas a cada dois dias até chegarem ao estágio pupal (aproximadamente 7-10 dias), aumentando a quantidade de comida conforme necessário.
      NOTA: Quando alimentados muito pouco, o crescimento larval será atrofiado, e as larvas podem comer umas às outras. Quando alimentadas demais, as larvas podem morrer, fazendo com que a água se esvaa.
   5. Uma vez que as pupas se desenvolvam, transfira-as diariamente para uma bacia de água em gaiolas de mosquitos adultos e forneça 10% de solução de sacarose ad libitum.
   6. Regisso primeiro dia de emergência adulta. Remova as pupas restantes da gaiola 2 dias após o início do surgimento.
      NOTA: Mosquitos machos emergem mais rápido. Observe o surgimento de machos e fêmeas separadamente e garanta que machos e fêmeas suficientes estejam disponíveis para cada teste.
   7. Aguarde 3 dias depois de remover a pupa para alcançar mosquitos de 3 a 5 dias para testes.
2. Moscas de frutas traseiras (seguindo livremente protocolos da Universidade de Zurique²⁸).
   1. A Drosophila traseira se esforça em garrafas de caldo a 23 ± 1 °C e 60 ± umidade relativa de 5% com 12:12 h de ciclismo claro e escuro.
      NOTA: As garrafas de caldo de drosophila devem conter 75 mL de um meio de mosca padrão, que é primeiro derramado como um líquido no fundo das garrafas e, em seguida, permitido solidificar durante a noite.
   2. Transfira colônias para novas garrafas de estoque com alimentos frescos a cada duas semanas para evitar a superpopulação e o crescimento do molde. Para fazer isso, derrube moscas usando um distribuidor de dióxido de carbono portátil (CO₂), transfira as moscas anestesiadas para um papel de pesagem em uma bolsa de gelo ou mesa de frio, e escove as moscas em uma garrafa de estoque fresco usando um pincel de ponta fina. Certifique-se de manter as garrafas em seus lados durante este processo para evitar que moscas caiam na comida e se afogem.

2. Prepare formulações de inseticidas usando a abordagem gravimétrica

1. Faça a primeira solução de estoque seguindo a abordagem gravimétrica usando uma escala analítica com precisão de 0,1 mg dentro de um capô de fumaça.
   NOTA: A abordagem gravimétrica utiliza massa para medir as quantidades de inseticida e solvente adicionados. A prática padrão (abordagem volumétrica) exigirá uma escala analítica para medir a quantidade de inseticida (sólido) adicionada quando a primeira solução de estoque for preparada; no entanto, a quantidade de solvente adicionado e todas as diluições seguintes são medidas apenas pelo volume. A abordagem gravimétrica tem um nível mais alto de precisão e, portanto, é preferida.
   1. Determine a concentração de inseticida alvo e o volume alvo (no máximo 10 mL é recomendado se usar tubos cônicos de 15 mL para evitar derramamento ao armazenar em um congelador) para a primeira solução de estoque e calcular quanto ingrediente ativo de inseticida (IA) adicionar usando Eq (1):
        (1)
   2. Prepare um tubo de armazenamento (tubo cônico de 15 mL recomendado para volumes maiores, tubos de tampa de parafuso microcentrifuuge de 1,5 mL recomendados para volumes de 1 mL ou menos) e rotule com inseticida e nome de solvente, concentração de alvo e data de preparação. Coloque o tubo e a tampa na balança dentro de um rack ou suporte e coloque a balança.
   3. Pese a quantidade desejada de inseticida sólida ou líquida AI determinada a partir da etapa 2.1.1. (por exemplo, deltametrina usada para os dados representativos) no tubo e registro da massa.
   4. Coloque a balança e adicione o volume desejado de solvente (equivalente ao volume de destino) ao tubo, feche a tampa imediatamente e grave a massa. Feche a tampa do tubo imediatamente após adicionar o solvente (acetona usado aqui) para evitar a evaporação e misture a solução.
   5. Registo da temperatura ambiente. Alguns solventes, como a acetona, podem ter mudanças significativas no volume (e consequentemente densidade) dependendo da temperatura.
   6. Se armazenar imediatamente, enrole a tampa do tubo em parafilme (para reduzir a evaporação), coloque-a em um rack/suporte de tubo (para manter a vertical e evite vazamentos), cubra em papel alumínio (para evitar a exposição uv), coloque-a em um saco plástico ressealável (para reduzir a evaporação) e coloque o saco em um congelador de -20 °C. Se não for armazenado imediatamente, certifique-se de que a tampa está presa e cubra em papel alumínio ou em um recipiente protegido pela luz.
   7. Calcule a concentração real da solução de estoque (mg/mL) dividindo a massa de IA inseticida adicionada pelo volume de solvente adicionado (e o volume de inseticida adicionado se em forma líquida). Para calcular o volume de solvente adicionado (ou inseticida líquido), divida a massa adicionada pela densidade conhecida que é apropriada para a temperatura registrada.
   8. Calcule a densidade (g/mL) da solução de estoque dividindo a massa total adicionada (inseticida e solvente) pelo volume total adicionado (solvente e inseticida, se em forma líquida). Consulte o passo 2.1.7 para converter massa líquida em volume.
2. Diluir em série a solução inicial de ações através de diluições de 10%. Se necessário, use essas diluições seriais para criar uma curva inicial de dose-resposta para identificar a faixa de alvo de concentrações de inseticidas para o bioensaio.
   1. Calcule o volume de solução de estoque de inseticidas e o solvente para adicionar a cada tubo (por exemplo, 1 mL de solução de estoque de inseticida diluída em 9 mL de solvente para uma diluição de 10 mL de 10% da concentração anterior).
   2. Vortex a solução de ações para 10 s. Tare um primeiro tubo de diluição pré-rotulado na escala. Adicione o volume necessário de solução de estoque ao primeiro tubo de diluição usando uma pipeta. Feche imediatamente a tampa de ambos os tubos e grave a massa no primeiro tubo de diluição.
   3. Regue novamente o primeiro tubo de diluição e adicione o volume necessário de solvente. Feche a tampa imediatamente, registe a massa do solvente adicionado e o vórtice a primeira diluição para 10 s.
   4. Repita as etapas 2.2.2 e 2.2.3 para as diluições restantes.
   5. Armazene todas as diluições descritas acima na etapa 2.1.6.
   6. Calcule as concentrações reais das diluições seguindo o passo 2.1.7.
   7. Calcule a densidade de cada diluição de inseticida dividindo a massa total adicionada (solução de inseticida e solvente) pelo volume total adicionado (solução de inseticida e solvente). Para cada diluição serial, use a densidade de diluição do estoque de inseticidas anterior para calcular a densidade da nova diluição após eq (2):
      (2)
3. Opcional: Criar diluições de inseticidas com incrementos menores por diluição serial.
   1. Selecione as concentrações e volumes de cada nova solução a fazer com o auxílio de uma curva dose-resposta das diluições seriais iniciais, ensaios anteriores ou literatura publicada.
      NOTA: As concentrações escolhidas devem resultar em uma faixa de mortalidade de 0 a 100%, com um mínimo de três concentrações dessa faixa para permitir a análise do Probit.
   2. Use as diluições seriais como soluções de estoque para fazer cada nova diluição e siga o passo 2.2 para criar as novas diluições entre as diluições de 10 vezes.
4. Opcional: Aliquot a solução de inseticida. Se forem feitos volumes maiores das soluções de inseticida, aconteça as soluções em tubos de tampa de parafuso de 1,5 mL para evitar contaminação, evaporação e degradação das soluções de estoque de manuseio frequente e exposição à luz.
   1. Alíquotar as soluções, partindo da menor concentração e trabalhar para a maior concentração para reduzir a contaminação potencial. Misture cada solução de estoque por vórtice por 10 s antes de abrir e encanar o volume desejado (por exemplo, 0,5 mL) em um tubo de tampa de parafuso pré-rotulado.
   2. Guarde as alíquotas em um recipiente resistente à luz em um congelador de -20 °C.
      NOTA: Recomenda-se substituir regularmente (mensalmente) as alíquotas por pequenas alíquotas novas retiradas diretamente das diluições de pesticidas. Isso limitará o potencial de contaminação a ser transportada para outros experimentos ou alterações devido à evaporação ou degradação uv enquanto as amostras são usadas no banco. O protocolo pode ser pausado aqui e reiniciado mesmo anos depois, desde que as soluções de inseticida sejam armazenadas adequadamente (ver passo 2.1.6) e mantidas no congelador de -20 °C.
5. Use uma caneta marcadora permanente para marcar o menisco antes de armazenar para monitorar a evaporação do solvente. Ao remover a solução de inseticidas para fazer alíquotas, marque o menisco toda vez que a solução for removida.

3. Prepare o espaço de trabalho de bioensa de ensaio de aplicação tópica

NOTA: Recomenda-se trabalhar em uma tenda de manuseio de insetos no topo do banco para facilitar a captura de mosquitos ou moscas que escapam. Consulte Figura Suplementar S1 para imagens de uma tenda de manuseio de insetos.

1. Remova as soluções de inseticidas necessárias do congelador, vórtice imediatamente, e coloque-as em um recipiente resistente à luz à temperatura ambiente para deixar os inseticidas aquecerem à temperatura ambiente antes de usar.
   NOTA: As IA de inseticida podem separar-se do solvente a temperaturas mais frias. Além disso, o volume de acetona muda com a temperatura, o que pode alterar a dose de inseticida aplicada. Misturar as soluções e permitir que elas aqueçam à temperatura ambiente ajuda a garantir consistência ao usar as soluções de inseticidas.
2. Coloque todas as ferramentas e materiais necessários para o ensaio de aplicação atual na tenda de manuseio de insetos como referenciado na Tabela de Materiais.
3. Limpe o barril de seringa e a agulha com acetona de grau analítico completando 5 lavagens por alíquota de acetona. Complete isso com 5 alíquotas separadas para um total de 25 lavagens. Consulte figura suplementar S2 para obter peças de tubulação de seringa e repetição.
   1. Coloque 5 tubos de microcentrífuga com 0,5 mL de acetona cada.
   2. Encha o barril de seringa com 0,025 mL de acetona do primeiro tubo e, em seguida, expulse a acetona em um recipiente de resíduos empurrando rapidamente para baixo no êmbolo. Repita mais quatro vezes para completar um total de cinco lavagens de acetona da mesma alíquota de acetona. Em seguida, encha o barril de seringa completamente com ar e expulse o ar e potenciais restos de acetona para dentro do recipiente de resíduos. Repita mais duas vezes para completar três "lavagens" com ar.
   3. Repita o passo 3.3.2 para os 4 tubos restantes de acetona.
   4. Crie um bolsão de ar dentro do cano entre o êmbolo da seringa e o topo da agulha puxando o êmbolo ligeiramente para dentro do barril (~5 mm).
      NOTA: Esta bolsa de ar protege o êmbolo de entrar em contato com as soluções de inseticida e reduz a transferência de inseticidas.
   5. Reserve a seringa até estar pronta para uso para aplicação atual.
4. Crie uma chave contendo as doses a serem aplicadas e atribua identidades aleatórias seguindo geradores de números aleatórios ou letras (consulte Arquivo Suplementar 1).
5. Rotule os copos de plástico com a ID aleatória para avaliação de mortalidade cega.
   NOTA: Se necessário, o protocolo pode ser pausado aqui e reiniciado em um dia e hora posteriores. Se mais de algumas horas passarem durante a pausa, é encorajado a repetir o passo 3.3 para garantir que a seringa esteja limpa e colocar as soluções de inseticida de volta no congelador até cerca de uma hora antes de dosar os insetos e, em seguida, repetir o passo 3.1.

4. Prepare os espécimes para o bioensaio tópico. Consulte a Figura 1 para uma visão geral processual

1. Classificar e pesar os mosquitos
   1. Usando um aspirador alimentado por sucção por inalação, aspire o número desejado de mosquitos adultos de 3 a 5 dias de idade necessários para o ensaio, incluindo um excesso para contabilizar indivíduos danificados. Transfira os mosquitos para um tubo cônico (até 100 mosquitos por tubo) colocando a ponta do aspirador no tubo com algodão enrolado na ponta e exale suavemente e bata no aspirador. Use o algodão para tampar o tubo quando a ponta do aspirador for removida e, em seguida, tampar com a tampa. Evite encher o aspirador e os tubos com muitos mosquitos ao mesmo tempo, pois isso adiciona estresse adicional aos mosquitos e pode causar a morte.
   2. Derrube brevemente os mosquitos nos tubos, colocando-os por um mínimo de 10 min a 4 °C ou enterrando-os sob gelo em uma bandeja de gelo.
      NOTA: Os mosquitos podem ser mantidos a 2 °C por várias horas com mortalidade mínima²⁹; no entanto, é melhor minimizar a duração para a qual os mosquitos estão no gelo para reduzir potenciais efeitos negativos.
   3. Transfira os mosquitos derrubados para a tenda de manuseio de insetos e coloque cuidadosamente os mosquitos em uma bandeja de plástico (por exemplo, placa de Petri) colocada no gelo. Despeje apenas cerca de 50 mosquitos por vez para garantir que cada um toque na bandeja fria abaixo dela e permaneça derrubado.
   4. Classifique os mosquitos por sexo, pegando-os suavemente pelas pernas (ou asas) com fórceps e coloque cada sexo em um copo de retenção separado. Conte o número de mosquitos de cada sexo durante a triagem e pare quando o número desejado for atingido. Durante a triagem, remova todos os mosquitos que estejam feridos (por exemplo, pernas faltando) ou sejam extra-grandes (por exemplo, abdômen anormalmente aumentado) ou pequenos (facilmente distinguidos a olho nu como menores do que o tamanho médio do mosquito dessa população).
      NOTA: O manuseio dos mosquitos pelos apêndices reduz os danos estruturais aos seus corpos primários macios (por exemplo, abdômen).
   5. Registo o peso de cada xícara de mosquitos utilizando uma escala analítica com precisão de 0,1 mg.
      1. Coloque um copo vazio com uma placa de Petri como uma tampa na balança e renas na balança. Despeje os mosquitos no recipiente, coloque a tampa em cima e coloque o recipiente na balança.
      2. Registo o peso combinado e o número de espécimes na folha de pontuação (ver Arquivo Suplementar 2). Coloque imediatamente a xícara de espécimes de volta no gelo para mantê-los imobilizados.
      3. Repetição de passos 4.1.5.1-4.1.5.2 até que todas as xícaras de espécimes sejam pesadas.
   6. Divida os mosquitos preparados em grupos de 20-25 em copos separados colocados no gelo rotulados com as identidades aleatórias. Ao transferir mosquitos, procure reduzir o estresse e os danos físicos causados pelas fórceps. Idealmente, pegue os mosquitos usando fórceps apenas 1-2 vezes: uma para classificação/pesagem e uma segunda vez potencial para transferência para os copos experimentais.
      NOTA: Um número ideal de mosquitos por xícara é de 20-25, o que é suficiente para uma replicação, é razoável para avaliar a mortalidade, e não deve resultar em estresse/morte induzidos por densidade no copo.
2. Classificar e pesar as moscas das frutas
   1. Anestesiar as moscas usando CO₂ por 7 s.
      NOTA: Se as moscas forem expostas ao CO₂ por mais de 7 s, elas podem ter problemas para rastejar e voar quando acordarem³⁰.
   2. Despeje as moscas em uma bolsa de gelo embrulhada em papel de banco e use um pincel fino para separar e contar os machos e fêmeas.
   3. Use o pincel para pegar suavemente as moscas escolhidas e colocá-las em uma garrafa de estoque limpa e vazia. Escolha o mesmo número de moscas de frutas machos e fêmeas (por exemplo, 15 machos e 15 fêmeas) e rotule as garrafas de caldo com o nome da cepa e o total da mosca-das-frutas (por exemplo, Canton-S, 30 moscas).
      NOTA: É importante ter um número igual de moscas fêmeas e fêmeas de frutas, pois moscas de frutas machos podem experimentar maior agressividade uns contra os outros após serem removidas da presença de fêmeas³¹. Portanto, para evitar mortalidade ou lesões por não inseticidas, é melhor ter um número igual de machos e fêmeas (ou omitir moscas de frutas machos completamente).
   4. Registo o peso de cada garrafa de moscas de frutas usando uma escala analítica.
      1. Coloque um frasco vazio (rotulado com um ID aleatório, consulte a etapa 3.4) com uma placa de Petri como tampa na balança e tare a balança.
         NOTA: Os frascos de vidro são recomendados para uso com moscas frutíferas, pois reduzem significativamente a estática.
      2. Anestesiar a garrafa de moscas de frutas correspondente ao ID aleatório do frasco usando CO₂ para 7 s.
      3. Despeje as moscas das frutas sobre o papel de pesagem e use o papel como funil para introduzir as moscas no frasco. Coloque a tampa da placa de Petri em cima do frasco de moscas de frutas e coloque-a na balança.
      4. Regissuço o peso combinado e o número de espécimes na folha de pontuação e, em seguida, coloque imediatamente o frasco de moscas de frutas em uma bandeja de gelo, com a tampa ainda em cima para evitar que as moscas escapem.
      5. Repita os passos 4.2.4.1-4.2.4.4 para cada garrafa de moscas de frutas.
3. Quando as etapas acima estiverem completas, passe imediatamente para a próxima seção.

5. Amostras de dose

1. Carregue a seringa com a concentração adequada de inseticida. Comece com a dose menos concentrada e trabalhe para a dose mais concentrada com cada grupo de organismos. Para evitar desperdícios, carregue somente a seringa com o volume necessário de inseticida mais um extra recomendado de 2 μL.
2. Coloque os espécimes sobre papel de pesagem em cima de uma bandeja no gelo. Separe os espécimes que estão próximos usando um pincel limpo, sem inseticidas ou um cotonete de algodão para permitir fácil acesso a cada espécime para dosagem. Para mosquitos, use o pincel também para garantir que cada espécime esteja deitado em seu dorso e sua superfície ventral esteja virada para cima.
3. Utilizando a seringa, aplique uma gota de solução de inseticida (ou acetona para o controle) na área do tórax e abdômen ventral para mosquitos e o dorso para moscas frutíferas. Aplique uma gotícula de 0,2 μL (que requer uma seringa de 10 μL) para insetos de tamanho menor, como moscas de frutas e uma gotícula de 0,5 μL (que requer uma seringa de 25 μL) para mosquitos.
   NOTA: A sensibilidade ao inseticida não difere significativamente entre partes primárias do corpo (como cabeça, tórax e abdômen) em comparação com apêndices (como asas, pernas ou proboscis)³². Portanto, o local de aplicação não precisa ser exato, desde que a gota de dose seja aplicada ao corpo primário. O tórax ventral e a área do abdômen são escolhidos para mosquitos porque muitas vezes se deitam em seu lado dorsal quando derrubados, enquanto o dorso é escolhido para moscas frutíferas porque muitas vezes deitam em seu lado ventral quando derrubados. Essa diminuição da especificidade do site de aplicação ajuda a aumentar o throughput deste método.
4. Despeje imediatamente os espécimes de volta no copo de plástico rotulado e cubra o copo com redes e um elástico. Coloque o copo em uma bandeja de retenção e note no copo quaisquer espécimes que foram mortos, danificados ou escaparam neste processo (para excluí-los na contagem final de espécimes naquele copo). Para a primeira xícara, registo o tempo em que a dosagem é concluída.
5. Substitua os papéis de pesagem sobre os quais as amostras são colocadas para evitar a contaminação por inseticidas entre as doses.
6. Repita a dosagem para cada xícara até que todos os espécimes tenham sido dosados com as concentrações adequadas de inseticidas e regise o tempo final quando todos os espécimes tiverem sido dosados.
7. Forneça 10% de solução de sacarose para cada xícara através de uma bola de algodão encharcada e reserve os copos até que a mortalidade seja avaliada no dia seguinte. Armazene os mosquitos a 27 ± 1 °C com 75 ± 5% de umidade relativa⁵ e a fruta voa a 23 ± 1°C com 60 ± 5% de umidade relativa.
   NOTA: Tenha cuidado ao apertar as bolas de algodão para evitar a sobresaturação ou subsaturação. As bolas de algodão devem estar úmidas, mas não pingando. O gotejamento de água de açúcar no copo pode levar à mortalidade dos espécimes e, assim, impactar a avaliação da mortalidade do inseticida.

6. Avaliar a mortalidade

1. Recorde de mortalidade por espécimes às 24h após o início da exposição a inseticidas. Classificar os mosquitos como vivos se eles podem voar e se segurar em pé; como mortos se eles são imóveis ou ataxicos (incapazes de ficar em pé ou decolar para voar), como descrito pela OMS⁶. Siga a mesma avaliação de mortalidade para moscas-das-frutas ^8,33.
   NOTA: Para avaliar a mortalidade retardada, a mortalidade pode ser avaliada adicionalmente após 48 e 72 h com alterações diárias de água açucarada.
2. Após o registro da mortalidade, coloque todos os copos de espécimes em um saco contido em um congelador por pelo menos 1h para garantir que todas as amostras estejam mortas antes do descarte ou uso subsequente (por exemplo, análise molecular ou química).

7. Executar réplicas

1. Repita as etapas 3-6 em um novo conjunto de espécimes, tomando o cuidado de realizar réplicas ao mesmo tempo todos os dias, pois a suscetibilidade de inseticidas pode mudar dependendo da hora do dia³⁴.
2. Assegure-se de um mínimo de 3 réplicas para cada concentração para uma estimativa precisa da dose letal que mata 50% dos espécimes (LD₅₀). Inclua mais réplicas se um alto nível de variabilidade for observado.
3. Complete a análise após a coleta de todos os dados.

8. Analisar os resultados

1. Registo dados em um programa de planilha e use a chave de ID aleatória para desmascarar os dados (etapa de referência 3.4). Salve os dados como um arquivo de texto (veja os dados do exemplo no Arquivo Suplementar 3) para análise no programa estatístico R³⁵ (ver código R exemplo no Arquivo Suplementar 4) ou outro software de escolha³⁶.
2. Dentro do programa de software, complete a seguinte análise. Consulte o Arquivo Suplementar 4 para obter um código R de exemplo.
   1. Calcule a dose de inseticida (ng) por massa de espécime (mg) seguindo Eq (3) abaixo:
      (3)
   2. Calcule a mortalidade e aplique a fórmula³⁷ de Abbott para corrigir a mortalidade em relação à mortalidade observada em cada controle³⁷. Alternativamente, use a fórmula Schneider-Orelli (1947) para corrigir a mortalidade³⁸. Com qualquer fórmula, aplique a correção a todos os dados, independentemente da mortalidade em cada controle, como descrito anteriormente³⁷ e implementado³⁹, a menos que os dados de controle sejam extraordinariamente altos (ver discussão abaixo).
      NOTA: A fórmula de Abbott e alternativas equivalentes, como a fórmula Schneider-Orelli, ajustam os valores de mortalidade proporcionalmente à medida da mortalidade não observada nos controles e não causarão uma diminuição da mortalidade por copos que tiveram 100% de mortalidade. Para obter mais informações, consulte as referências citadas para essas fórmulas.
   3. Transformar dados de mortalidade corrigidos em valores de probit (unidade de probabilidade)⁴⁰ e realizar regressão linear entre a dose de inseticida e os dados de mortalidade transformados. Use um teste qui-quadrado para avaliar o ajuste do modelo linear(s).
      NOTA: Os valores de mortalidade de 0 (0% de mortalidade) ou 1 (100% de mortalidade) são retirados dos dados antes de completar a transformação do próbit. Isso é necessário devido à natureza da transformação do próbit. Como tal, os dados gráficos não incluirão controles positivos ou negativos ou quaisquer outros dados que resultaram em mortalidade de 0% ou 100% (após a aplicação da correção de Abbott).
   4. Calcular os intervalos de confiança de_{LD 50} e 95% (CIs) por cepa, população e/ou sexo após métodos publicados anteriormente 39,41,42.
   5. NOTA: Se os 95% de CIs de duas cepas não se sobreporem, as cepas têm respostas de dose significativamente diferentes.
   6. Se aplicável, calcule as razões de resistência (RRs) dividindo o LD₅₀ da tensão de juros pelo LD₅₀ da cepa de referência/controle.

Figura 1: Diagrama do protocolo de ensaio de aplicação atual. O protocolo de ensaio de aplicação tópica começa com (A) triagem de espécimes no gelo, seguido por (B) amostras de pesagem em escala analítica, (C) amostras de dosagem com solução de inseticida(s) e (D) período de espera de 24 horas pós exposição a inseticidas com acesso a 10% de solução de sacarose ad libitum (através de uma bola de algodão encharcada), seguida de avaliação de mortalidade. As setas vermelhas indicam o local de aplicação de inseticida alvo para mosquitos (esquerda) e moscas frutíferas (direita). Note que a imagem não é para escalar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Estes resultados representativos apresentam duas cepas diferentes de Ae. aegypti, Rockefeller (ROCK), e uma cepa de campo isolada da Flórida com mutações conhecidas de resistência ao knockdown F1534C e V1016I (genótipo IICC). Além disso, drosophila melanogaster (cepa Canton: S) é destaque.

As figuras 2 e figura 3 ilustram a resposta da dose de cada organismo por cepa e sexo testados seguindo o protocolo acima. Como não foram observadas diferenças entre as curvas dose-resposta dos mosquitos machos e fêmeas dentro de cada cepa (t = 1,70, p = 0,098 para ROCHA e t = 0,64, p = 0,527 para IICC), foram agrupados dados de ambos os sexos dentro de cada cepa de mosquito. Os LD50 relativizados em massa para ROCK e IICC são de 0,008 ng/mg (IC 95%: 0-0,104) e 0,336 ng/mg (IC 95%: 0,235-0,438), respectivamente. Os 95% de CIs desses valores não se sobrepõem, indicando respostas de dose significativamente diferentes das cepas. A RR da cepa IICC (em relação à cepa ROCK) é de 41,7, que segundo a OMS, é considerada altamente resistente5. Para as moscas de frutas Canton-S, o LD50 relativizado em massa é de 0,213 ng/mg (IC 95%: 0-0,490).

Figura 2: Dados representativos de mosquitos utilizando bioensaio de aplicação tópica. Dados representativos de dose-resposta do bioensaio de aplicação tópica seguindo o protocolo acima utilizando deltametrina e mosquitos: (A) fêmea Ae. aegypti ROCK (n = 880) e IICC (n = 550) cepas, (B) variedades macho Ae. aegypti ROCK (n = 880) e IICC (n = 569). As concentrações de teste de deltametrina variaram de 0,00075 ng/μL a 9,68705 ng/μL, e a dose de deltametrina aplicada (ng) por massa média de mosquito (mg) é refletida no eixo x. A mortalidade é mostrada como proporção no eixo y. A linha preta através de cada cluster de ponto de dados representa a tensão e a regressão linear específica do sexo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Dados representativos de moscas-das-frutas usando bioensaio de aplicação tópica. Dados representativos de dose-resposta do bioensaio de aplicação tópica seguindo o protocolo acima usando deltametrina e moscas de frutas: cepa D. melanogaster Canton-S (n = 1014). As concentrações de teste de deltametrina variaram de 0,00499 a 5,02876 ng/μL, e a dose de deltametrina aplicada (ng) por massa média de mosca de fruta (mg) é refletida no eixo x. A mortalidade é mostrada como proporção no eixo y. A linha preta representa a regressão linear. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar S1: Tenda de manuseio de insetos benchtop. A tenda de manuseio de insetos benchtop é usada para facilitar a captura de mosquitos ou moscas durante o ensaio de aplicação atual. Estrutura é fechada em A e aberta em B. Esta estrutura foi construída com tubo de PVC e tecido de malha fina. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura Suplementar S2: Unidade aplicadora de seringa e repetidor. Unidade aplicadora de seringa e repetidor usada para dosar insetos. As peças principais incluem agulha 1), 2) cano de seringa, 3) êmbolo, 4) repetidor e 5) botão repetidor. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Arquivo suplementar 1: script de randomização: Script de randomização para criar rótulos não tendenciosos para todas as xícaras de cada experimento. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Arquivo Suplementar 2: Folha de pontuação de mortalidade: Folha de pontuação de mortalidade para auxiliar na avaliação da mortalidade. A folha também inclui locais para registrar todas as outras informações importantes para registrar, como referenciado no protocolo, como o início e o fim da aplicação de inseticida. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Arquivo suplementar 3: Exemplos de dados de mortalidade: Exemplo arquivo de dados usado para criar Figura 2. As descrições de títulos da coluna são as seguintes: "id" = código de identificação de cada ponto de dados; "espécies" = nome da espécie (por exemplo, Aedes aegypti); "inseticida" = nome do inseticida topicamente aplicado (por exemplo, Deltametrina); "cepa" = nome da cepa de mosquito (por exemplo, ROCK); "data" = aplicação atual da data de início; "sexo" = sexo de mosquitos; "idade" = idade dos mosquitos (jovem = 3-5 dias de idade; velho = 4 semanas de idade); "total.mosq" = número total de mosquitos pesados em lote; "peso" = peso (mg) de todos os mosquitos dentro do lote; "concentração" = concentração de inseticida (μg/mL); "seringa" = volume de gotícula (mL) de seringa; "dose" = quantidade de ingrediente ativo de inseticida aplicado a cada mosquito (ng); "total" = número de mosquitos em cada xícara; "morto" = número de mosquitos mortos em cada xícara. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Arquivo suplementar 4: Código de análise R: Exemplo R código que pode ser usado para completar a análise Probit (conforme descrito na etapa 8 do protocolo). Os resultados representativos (acessíveis através do arquivo de dados de exemplo suplementar) podem ser usados com este código R. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Os autores não declaram conflitos de interesse.