Artigo de método

Remoção de um local de início de tradução interna do mRNA enquanto retém a expressão da proteína de comprimento completo

DOI:

10.3791/63405

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16 de março de 2022

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1Nora Eccles Harrison Cardiovascular Research and Training Institute, University of Utah, 2Department of Biomedical Sciences, Cedars-Sinai Medical Center

Neste artigo

Resumo

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O presente protocolo descreve uma única mutação M213L em Gja1 que retém a geração Connexin43 em comprimento completo, mas impede a tradução do isoforme traduzido internamente GJA1-20k.

Resumo

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O sistema de edição de genes CRISPR-Cas9, baseado em mecanismos de reparação de genomas, permite a geração de modelos de camundongos modificados por genes de forma mais rápida e fácil em relação à recombinação homologous tradicional. O sistema CRISPR-Cas9 é particularmente atraente quando uma mutação de um ponto é desejada. A proteína de junção de lacunas, Connexin 43 (Cx43), é codificada pelo gene Gja1, que tem um único exon de codificação e não pode ser emendado. No entanto, Gja1 produz não apenas proteína Cx43 de comprimento completo, mas até seis isoformas truncados N-terminus por um processo conhecido como tradução interna, o resultado da iniciação da tradução ribossômica em locais de partida internos de AUG (Methionine). GJA1-20k é o isóforme truncado mais comumente gerado do Cx43 iniciado no codon AUG na posição 213 de Gja1 mRNA. Como o resíduo 213 ocorre no final do último domínio transmembrano de Cx43, GJA1-20k é efetivamente a cauda C-terminus de 20 kDa C de Cx43 como uma proteína independente. Investigadores anteriores identificaram, em células, que um papel crítico do GJA1-20k é facilitar o tráfico de hemicanais de junção de lacunas Cx43 de comprimento completo à membrana plasmática. Para examinar esse fenômeno in vivo, foi gerado um rato mutante com mutação de ponto Gja1 que substitui o ATG (Methionine) no resíduo 213 por TTA (leucemia, mutação M213L). O resultado do M213L é que Gja1 mRNA e Cx43 de comprimento completo ainda são gerados, mas a tradução de Gja1-20k é significativamente reduzida. Este relatório se concentra na escolha do local da enzima de restrição para desenvolver um modelo de mouse de um aminoácido mutado (Gja1M213L/M213L). Este protocolo descreve camundongos geneticamente modificados pelo sistema CRISPR-Cas9 e genotipagem rápida combinando tratamentos de PCR e enzimas de restrição.

Introdução

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O Connexin 43 (Cx43) e o isoforme truncado N-terminus, GJA1-20k, codificados pelo mesmo GJA1 mRNA, mas utilizam códons de início diferentes1 para iniciar a tradução. A tradução Cx43 ocorre no primeiro códon de início de AUG, enquanto a tradução GJA1-20k inicia-se no AUG no resíduo 213. Foi previamente constatado que o GJA1-20k tem funções essenciais para o tráfico de Cx43 em comprimento total, estabilização de actin e regulação da morfologia mitocondrial in vitro 1,2,3.

Para entender o papel do GJA1-20k in vivo, foi gerado um modelo de mouse "knock-out" GJA1-20k que manteve a capacidade de criar Cx43 de comprimento completo. A abordagem foi utilizar o sistema CRISPR-Cas9 para substituir o resíduo único em 213 de uma methionina (M) a uma leucina (L) (Gja1M213L/M213L)4. Uma mutação interna de M a L diminui drasticamente a probabilidade de a tradução interna ocorrer, mas mantém a tradução e a função da proteína de comprimento total4. Como o tipo selvagem (WT) e o alelo mutado têm tamanhos idênticos e produtos mRNA quase idênticos, há uma dificuldade considerável em confirmar genótipo nos camundongos. O sequenciamento de DNA pode identificar a mutação, mas é muito caro e demorado para uso rotineiro. Em geral, vários métodos de genotipagem mais rápido foram estabelecidos, como reação de cadeia de polimerase em tempo real (RT-PCR), minisequenciamento-ligation, análise de fusão de alta resolução e sistema de mutação refratário tetra-primer PCR (ARMS-PCR)5,6,7,8. No entanto, esses métodos alternativos requerem múltiplas etapas, recursos exclusivos e/ou vários conjuntos de primer específicos que podem induzir produtos PCR não específicos.

Este protocolo introduz uma abordagem detalhada de segmentação e edição de genes pelo CRISPR-Cas9 para criar uma única mutação de aminoácidos, e genotipagem rápida é apresentada para confirmar a mutação. A identificação do genótipo envolve o uso criativo de enzimas de restrição utilizando apenas um único conjunto de primers para identificar o gene alvo. Os leitores são encaminhados à Referência4 para observar o profundo efeito eletrofisiológico da morte cardíaca súbita causada por uma mutação de substituição Gja1M213L/M213L que ainda gera proteína de comprimento total e não consegue gerar uma isoforma de truncação ingenuamente traduzida internamente menor. Este protocolo ajudará a fazer com que outros modelos de camundongos usem uma mutação pontual para diminuir a tradução interna de uma isoforme de interesse, mantendo a expressão da proteína endógena de comprimento total.

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Protocolo

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Todos os protocolos de cuidados e estudos para animais foram aprovados pelos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais do Cedars-Sinai Medical Center e da Universidade de Utah. Camundongos fêmeas C57BL/6J obtidos de fontes comerciais com 8-9 semanas de idade (ver Tabela de Materiais) foram utilizados para os experimentos.

1. Preparação para direcionamento genético

  1. Selecione a sequência de destino guia em torno do site de mutação alvo codificando M213 usando o algoritmo web CRISPOR 4,9,10 (ver Tabela de Materiais).
    NOTA: Uma sequência de guia de 20 bases (ATTCAGAGCGAGACACCA), no fio oposto da sequência de codificação GJA1, com uma pontuação do MIT11 de 62 foi selecionada na qual o potencial local de decote está localizado após 16 bases a jusante do códon a ser mutado (ATG) (Figura 1; toda a sequência de crRNA é mostrada na Tabela 1).
  2. Sintetizar o crRNA e tracrRNA que interagem com o Cas9 como guia RNA12.
    NOTA: Embora a pontuação do MIT do RNA guia seja de 62, há apenas uma mutação potencial fora do alvo com quatro incompatibilidades a mais de 12 bases do PAM. Portanto, este guia RNA é considerado seguro.
  3. Projetar um oligo doador complementar à sequência guia para introduzir uma única substituição de aminoácido (ATG para TTA; M213L) com 60 e 48 bases de armas de ílogo nos lados de 5'e 3', respectivamente.
    NOTA: Este oligo doador inclui uma mutação pontual para interrupção do PAM (AGG to ACG) introduzindo uma mutação silenciosa (TCC to TCG; S217S) para evitar a reeditação após o reparo direcionado à bralogia crispr (HDR)13 para a introdução das mutações pretendidas (Figura 1 e Tabela 1).
  4. Use NaCl (concentração final de 200 mM) para precipitar 10 μg de oligos para minimizar o transporte de sal em tampão de microinjeção pronuclear (10 mM de Tris-HCl, pH 7,5; 0,1 mM de EDTA, e 100 mM de NaCl sem espermatozoide e espermidina14).
    NOTA: Não lave a pelota de DNA com 70% de etanol, pois a pelota pode ser dissolvida na solução.
  5. Misture 50 ng/μL de oligo doador, 60 ng/μL de mistura de crRNA/tracrRNA (razão molar 1:1) (a partir da etapa 1,2) e 50 ng/μL de proteína eSpCas9 (ver Tabela de Materiais) para fazer mistura CRISPR no volume final 20 μL (Tabela 2). Diminua a concentração do oligo doador se for observada alta toxicidade (por exemplo, 25 ng/μL).

2. Indução de superovulação, colheita de ovos, microinjeção pronuclear de mistura CRISPR e triagem de blastocisto

NOTA: Este procedimento segue um protocolo geral publicado anteriormente14.

  1. Injete 5 UI de PMSG (gonadotropina soro da égua grávida) (ver Tabela de Materiais) em 100 μL de água estéril a 5-10 camundongos com 8 semanas de idade por uma abordagem intraperitoneal por volta das 3:00 p.m. (dia 1).
  2. Injete 5 UI de hCG (gonadotropina coriônica humana) (ver Tabela de Materiais) em 100 μL de água estéril aos doadores de óvulos por uma abordagem intraperitoneal 46-48 h após a injeção de PMSG (dia 3). Configurar 1:1 reprodução com machos garanhão.
  3. Colher ovos fertilizados em m2 médio com hialuronidase, lavar três vezes em 100 μL de m2 médio por volta das 10:00 a.m., em seguida, manter em mWM15 ou KSOM16 médio (dia 4) (ver Tabela de Materiais).
  4. Introduza a mistura CRISPR (passo 1.3) em embriões de estágio 1 colhidos dos camundongos pela microinjeção pronuclear14 em 100 μL de M2 coberto com óleo de parafina em um prato plástico em um microscópio invertido com uma óptica que melhora o contraste no início da tarde (Vídeo 1).
    NOTA: A microinjeção pronuclear da mistura CRISPR foi realizada em embriões de estágio de 1 células em 14-16 h póscoitum (p.c.). Os embriões injetados foram cultivados em uma incubadora de CO2 de 5% por algumas horas e transferidos cirurgicamente a 18-20 h p.c. para camundongos receptores ICR que tinham um plugue de copulação na mesma manhã.
  5. Transfira 20-30 embriões de 2 células para cada receptor para produzir animais recombinantes.
    NOTA: Siga o protocolo geral14 ou cultue os embriões no mWM ou no meio KSOM por 4 dias para validar a eficiência e examinar a toxicidade. A toxicidade da mistura CRISPR é aceitável quando pelo menos um terço dos embriões injetados chegam cedo ao estágio blastocisto totalmente expandido com múltiplos recombinantes entre eles. Ao mesmo tempo, mais de 90% dos embriões não domesticados atingem o mesmo estágio blastocisto em uma cultura paralela. Siga o passo 2.6-2.9 para a triagem do blastcyst que não é essencial, mas pode ser feito se preferir quantificar a taxa de sucesso do HDR.
  6. Captar individualmente blastocistos totalmente expandidos com 2 μL de meio de cultura usando uma ponta de pipeta fina plugada com uma micropipetter em tubos PCR únicos (dia 8; Vídeo 2).
  7. Blastocistos de lyse em 8 μL de mistura de digestão (mesmo que passo 3.2; ver Tabela de Materiais) e processo a 75 °C por 10 min, 95 °C por 5 min, depois esfrie até 4 °C para armazenamento. Use 2 μL do lysate como modelo para PCR em uma mistura total de 15 μL PCR (passo 3).
  8. Examine a eficácia do HDR por eletroforese de gel agarose17 das amostras pcr após a digestão de restrição com NlaIII (passo 3-5).
  9. Confirme o estado da recombinação direcionada sequenciando o amplicon17 de 668 bp nos fundadores e prole subsequente para confirmar a integridade da mutação.

3. Extração de DNA

NOTA: Camundongos no pós-natal dia 10 foram usados para este experimento devido à morte súbita do rato nocaute GJA1-20k cerca de 2-4 semanas após o nascimento4. Um protocolo mais geral também pode ser aplicado após o relatório publicado anteriormente18.

  1. Corte 1-3 mm do dedo do dedo ou da ponta da cauda com uma tesoura limpa e transfira-a para um tubo PCR de 0,2 mL de 8 Tiras. Para evitar contaminação entre as amostras do dedo do pé ou da cauda, use uma tesoura pré-limpa ou uma lâmina por mouse ou limpe antes de cada amostra usando 70% de etanol ou 10% de alvejante. Se a cauda sangrar após a amostragem, aplique uma breve pressão com gaze para parar o sangramento. Armazene as amostras da cauda a -20 °C até a extração por até cerca de uma semana.
  2. Adicione a solução de lise tecidual (ver Tabela de Materiais) em um tubo de 100 μL/e misture bem, seguido de spin-down com uma minicentrífuda de mesa (2.200 x g para 10 s à temperatura ambiente). Certifique-se de que as amostras da cauda estão submersas na solução.
  3. Coloque os tubos em um cicloviário térmico definido pelo programa a seguir; 75 °C para 10 min (lise tecidual), 95 °C para 5 min (inativação) e 4 °C (segurando). Armazene o tecido a 4 °C por até uma semana se os PCRs não puderem ser realizados imediatamente.

4. Amplificação de DNA por PCR

  1. Prepare uma solução PCR contendo 5 μL de H2O sem nuclease, 0,75 μL de 10 μM para frente e primers invertidos e 7,5 μL de mix mestre PCR (ver Tabela de Materiais) por amostra em novo tubo PCR (ver Tabela 1 para sequências de primer). Se houver várias amostras, dimensione o conteúdo para alíquota de 14 μL por tubo.
  2. Adicione 1 μL do tecido à solução PCR preparada na etapa 3.1. Tenha cuidado para não tocar na cauda.
  3. Misture bem e gire para baixo com uma mini centrífuga de mesa (2.200 x g para 10 s em temperatura ambiente).
  4. Coloque os tubos em um cicloviário térmico definido pelo programa abaixo mencionado. Armazene os produtos PCR a 4 °C por 1-2 meses ou ~1 ano a -20 °C.
    NOTA: 95 °C por 3 min (etapa 1, Denaturação inicial), 95 °C para 15 s (etapa 2, Denaturação), 60 °C para 15 s (etapa 2, Annealing), 72 °C para 45 s (etapa 2, Extensão), repetição do passo 2 para 35 ciclos, 72 °C para 10 min (etapa 3, Extensão Final) e 4 °C (etapa 4, Holding).

5. Incubação com enzima de restrição

  1. Prepare a solução enzimápica contendo 7 μL de H2O sem nuclease, 2 μL de tampão CutSmart de 10x e 1 μL de enzima de restrição NlaIII (ver Tabela de Materiais). Se houver várias amostras, multiplique cada conteúdo para fazer a mistura e alíquota de 10 μL por tubo.
  2. Adicione 10 μL de produto PCR obtido na etapa 3 à solução enzimápica por tubo.
  3. Misture bem e gire para baixo com uma mini centrífuga de mesa (2.200 x g para 10 s em temperatura ambiente).
  4. Coloque os tubos em um cicloviário térmico ou bloco de calor definido pelo programa abaixo mencionado. Armazene o produto após a incubação a 4 °C por 1-2 meses ou ~1 ano a -20 °C.
    NOTA: 37 °C para 16 h (pelo menos 2 h; tempo curto de incubação pode resultar em decote insuficiente) e 4 °C para realização.

6. Detecção de banda de DNA

  1. Prepare um gel de 1,5% de agarose contendo mancha de gel de DNA para eletroforese.
    1. Adicione 0,75 g de agarose em 50 mL de tampão TAE 1x seguido de mistura e calor no micro-ondas até que a agarose se dissolva completamente. Depois de esfriar, adicione 5 μL de mancha de DNA e misture suavemente.
    2. Despeje no molde de gel (25 mL por molde) e deixe o gel solidificar. Para obter melhor resolução e separação, aumente a concentração de ágarose para 2,5%-4% conforme necessário.
  2. Carregue 10 μL do produto PCR digerido até o poço. Misture 6x tampão de carregamento, se necessário.
  3. Execute o gel com 100 V por 35 min.
    NOTA: Esses parâmetros podem precisar de otimização.
  4. Imagem sob luz UV (comprimento de onda de 302 nm).

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Resultados

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O sistema de edição de genes CRISPR/Cas9 produz uma mutação ATG para TTA e uma mutação silenciosa de TCC para TCG entre 56.264.279 a 56.264.281 e de 56.264.291 a 56.264.293 no cromossomo do rato 10, ou em 869 a 871 e 881 a 883 em Gja1 mRNA, respectivamente. Essa mutação resulta em uma mutação de Methionina 213 a Leucina (M213L) na proteína GJA1 e a mutação TTC para TTG interrompe uma sequência PAM próxima para evitar edição genética indesejada (Figura 1). Os detalhes da mutação estão descrit...

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Discussão

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Um modelo de rato modificado por genes é uma abordagem comum para entender a função genética. No entanto, uma vez que o isoform traduzido internamente GJA1-20k é traduzido do mesmo Gja1 mRNA como Cx43 de comprimento completo, uma estratégia criativa foi concebida para manter a expressão Cx43 de comprimento completo, mas suprimir a expressão GJA1-20k. A abordagem é baseada em uma mutação do códon inicial interno de GJA1-20k. Com uma mutação de um único ponto, M213 foi trocado para L em Gja1 mRNA, que con...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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O projeto foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (R01HL152691, R01HL138577 e R01HL159983) à RMS.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubo de PCR de 8 tiras de 0,2 mLThomas Scientific1148A28
0,5 M EDTA pH 8,0Invitrogen15575-038Para tampão de micorinjection pronuclear
10x CutSmart bufferNew England BiolabsB7204STampão de digestão para NlaIII
1 M Tris-HCl pH 7,5Invitrogen15567-027Para tampão de micorinjection pronuclear
50x TAE TampãoInvitrogen24710-030
Termociclador de 96 poçosApplied BiosystemsModelo # 9902
AgaroseSigma-AldrichA9539
C57BL/6JO Laboratório Jackson664cepa de camundongo
Chemidoc MP imaging systemBio-radPara tirar a imagem do gel pela
proteínaeSpCas9 de luz UV de 302 nmMilliporeSigmaESPCAS9PRO-50UG
Gel Lading Dye Purple (6x)New England BiolabsB7024STampão de carregamento para eletroforese
Luvas
hCG (gonadotrofina coriônica humana)MilliporeSigma23-073-425G
HialuronidaseMilliporeSigmaH3884-100MG
Image Lab softwareBio-radPara analisar a imagem
do gel Microscópio estéreo invertido com plasDICZeissAxiovert A1
KAPA Kits de genotipagem de camundongosRoche DiagnosticsKK7352Para lise de tecidos ou células, extração de DNA e mistura mestre de PCR
KSOMLifeGlobalZEKS-050meio de cultura de embriões
Laboratório coart
M2 meioMilliporeSigmaMR015D
NlaIIINew England BiolabsR0125SPara digerir o produto de PCR
Água Livre de NucleaseAmbion AM9937Para diluir reagentes
Óleo de parafinaNacalai EUA2613785
Plugged 20 μ L ponta de pipeta finaFisherScientific02-707-171Para pegar blastócitos
PMSG (égua grávida' s gonadotrofina sérica)ProSpec-TanyHOR-272
Cloreto de sódioInvitrogenAM9760GPara tampão de micorinjection pronuclear
SYBR Safe DNA Gel StainInvitrogenS33102Para detectar bandas em gel
tracrRNADharmaconU-002000-120Guid RNA

Referências

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