Artigo de método

Um método passo-a-passo para detectar anticorpos neutralizantes contra a AAV usando um ensaio baseado em células coloridas

DOI:

10.3791/63419

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7 de dezembro de 2021

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1Baker Heart and Diabetes Institute, 2Department of Physiology, Anatomy and Microbiology, La Trobe University, 3Florey Institute of Neuroscience and Mental Health, University of Melbourne, 4Department of Physiology, Centre for Muscle Research (CMR), The University of Melbourne, 5Department of Diabetes, Central Clinical School, Monash University, 6Baker Department of Cardiometabolic Health, The University of Melbourne, 7Department of Physiology and Department of Medicine Alfred Hospital, Monash University

Neste artigo

Resumo

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Um protocolo de laboratório abrangente e um fluxo de trabalho de análise são descritos para um ensaio rápido, econômico e simples baseado em células coloridas para detectar elementos neutralizantes contra o AAV6.

Resumo

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Os vírus associados à adeno recombinante (rAAV) provaram ser um vetor seguro e bem sucedido para a transferência de material genético para tratar várias condições de saúde tanto no laboratório quanto na clínica. No entanto, anticorpos neutralizantes pré-existentes (NAbs) contra capsídeos AAV representam um desafio contínuo para a administração bem sucedida de terapias genéticas em grandes modelos experimentais animais e populações humanas. A triagem preliminar para a imunidade do hospedeiro contra a AAV é necessária para garantir a eficácia das terapias genéticas baseadas em AAV como ferramenta de pesquisa e como um agente terapêutico clinicamente viável. Este protocolo descreve um ensaio in vitro colorimétrico para detectar fatores neutralizantes contra o sorotipo AAV 6 (AAV6). O ensaio utiliza a reação entre um gene repórter de fosfatase alcalina (AP) e seu substrato NBT/BCIP, que gera uma mancha roxa quantificável insolúvel após a combinação.

Neste protocolo, as amostras de soro são combinadas com um AAV expressando AP e incubadas para permitir que possíveis atividades de neutralização ocorram. A mistura de soro do vírus é posteriormente adicionada às células para permitir a transdução viral de quaisquer AAVs que não tenham sido neutralizados. O substrato NBT/BCIP é adicionado e sofre uma reação cromogênica, correspondendo à transdução viral e atividade neutralizante. A proporção de área colorida é quantitatada usando uma ferramenta de software livre para gerar titulações neutralizadoras. Este ensaio mostra uma forte correlação positiva entre coloração e concentração viral. A avaliação de amostras de soro de ovelhas antes e depois da administração de um AAV6 recombinante levou a um aumento dramático na atividade neutralizante (aumento de 125 a >10.000 vezes). O ensaio apresentou sensibilidade adequada para detectar atividade neutralizante em diluições de soro >1:32.000. Este ensaio fornece um método simples, rápido e econômico para detectar NAbs contra AAVs.

Introdução

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Os vírus associados ao Adeno (AAV) são cada vez mais utilizados como vetores para a entrega de terapias genéticas para tratamentos experimentais para várias condições de saúde que impactam os sistemas nervosos cardiovascular, pulmonar, circulatório, ocular e central1,2,3,4,5. A popularidade dos vetores AAV como uma plataforma líder de terapia genética decorre de seu perfil positivo de segurança, expressão transgênica de longo prazo e tropismos específicos de tecido amplo1,6

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Protocolo

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Todos os aspectos do cuidado e experimentação animal foram conduzidos seguindo as diretrizes do Instituto Florey de Neurociência e Saúde Mental e o Código Australiano para o Cuidado e Uso de Animais para Fins Científicos após a Referência25. Foram utilizadas no estudo ovelhas Merino de 1,5 a 3 anos. Uma visão geral esquemática do protocolo de ensaio é fornecida na Figura 1.

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Resultados

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Ensaio de transdução para estabelecer a dose viral ideal para cobertura de placas
Células HT1080, uma linha celular fibrossarcoma bem estabelecida, foram selecionadas para este ensaio. Uma concentração de 1 x 104 células HT1080/bem fornecida ~50% de confluência celular em cada poço de uma placa de 96 poços. Para determinar a concentração viral ideal para o ensaio, um rAAV codificando um gene de repórter hPLAP (alcalina alcalina da placenta humana) (AAV6-hPLAP)31 foi .......

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Discussão

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Este relatório descreve um ensaio colorimétrico que avalia a extensão da neutralização da AAV em uma determinada amostra de soro, avaliando uma reação cromogênica correspondente ao grau de transdução viral in vitro. O desenvolvimento do protocolo foi baseado na reação cromogênica conhecida entre a enzima fosfatista e nbt/BCIP, que tem sido amplamente utilizada como ferramenta de coloração para a detecção de alvos proteicos em aplicações como a imunohistoquímica e como ferramenta repórter para avaliação da transd.......

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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Este estudo foi financiado por um Projeto do Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica para a JRM e CJT (ID 1163732) e, em parte, pelo Programa de Apoio à Infraestrutura Operacional do Governo Vitoriano. A SB é apoiada por uma bolsa conjunta de doutorado do Baker Heart and Diabetes Institute-La Trobe University. A KLW é apoiada pela The Shine On Foundation e uma Future Leader Fellowship da National Heart Foundation of Australia (ID 102539). A JRM é apoiada por uma Bolsa Sênior de Pesquisa do Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica (ID 1078985).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,05% Trypsin / EDTAGibco25300-054
50 mL tubo de centrífuga cônicoFalcon14-432-22Ou equivalente
75 cm2 < / sup>square frascosFalcon353136 Ou equivalente
96 placa de fundo plano Falcon353072
AAV6-CMV-hPLAP VectorPesquisa Muscular & Laboratório de Terapêutica (Universidade de Melbourne, Austrália) AAV6-CMV-hPLAP pode ser fornecido mediante solicitação.
Anticorpo monoclonal de camundongo anti-AAV6 (partícula intacta) de folha
de alumínio
BCIP/NBTSIGMAFASTB5655
Gabinete
Pipeta5 e 10 mL inserções de
stripetteHemocitômetro de soro
Glicose alta Meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM)Gibco11965118
HT1080 Software
ImageJDisponível gratuitamente: Incubadora https://imagej.nih.gov/ij/download.html
37 &graus; C, microscópio de 5% CO2
Light com câmeraCapaz de tirar fotos com uma lente objetiva 4x
FornoPara um microscópio de 65 ° C incubação
ParaformaldeídoMERCK30525-89-4
Penicilina EstreptomicinaGibco15140-122
Fosfato tamponado salina
Pipetas e pontas20 μ L, 200 μ L & Pipetas individuais de 1 mL e pontas & 200 μ Pipeta multicanal L
Filtro de liberação rápida StericupMilliporeS2GPU10REUsado para combinar reagentes de mídia
Solução de azul de tripanoSigma-AldrichT8154
VACUETTE TUBE 8 ml CAT Separador de soro Ativador de coáguloGreiner BIO-ONE455071Usado para coleta e processamento de soro de ovelhas
Banho-maria
, (ADK6)PROGEN 610159 Anticorpo monoclonal de controle positivo de segurança para cultura de células e tecidos eletrônica bovino fetal Gibco 10099-141 ATCC

Referências

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  1. Bass-Stringer, S., et al. Adeno-associated virus gene therapy: Translational progress and future prospects in the treatment of heart failure. Heart, Lung and Circulation. 27 (11), 1285-1300 (2018).
  2. Casey, G. A., Papp, K. M., MacDonald, I. M.

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