Método de coloração dupla para detectar pectina na interação planta-fungo

Resumo

Este protocolo descreve um método microscopical para detectar pectina na interação café-fungo.

Resumo

As células vegetais utilizam diferentes mecanismos estruturais, constitutivos ou induíveis, para se defenderem da infecção fúngica. Encapsulamento é um mecanismo indutível eficiente para isolar a haustoria fúngica do protoplasto celular vegetal. Por outro lado, a pectina, um dos componentes poliméricos da parede celular, é alvo de várias enzimas pecotólicas em interações necrotróficas. Aqui, é apresentado um protocolo para detectar pectina e hifas fúngicas através de microscopia óptica. O encapsulamento rico em pectina nas células das folhas de café infectadas pelo fungo ferrugem Hemileia vastatrix e a modificação da parede celular mesófila induzida pelo Cercospora coffeicola são investigados . As amostras de folhas lesionadas foram fixadas com a solução Karnovsky, desidratadas e embutidas em metacrilato glicol por 2-4 dias. Todas as etapas foram seguidas pelo bombeamento a vácuo para remover o ar nos espaços intercelulares e melhorar o processo de incorporação. Os blocos incorporados foram seccionados em seções de 5-7 μm de espessura, que foram depositados em um toboágua de vidro coberto com água e, posteriormente, aquecidos a 40 °C por 30 minutos. Em seguida, os slides foram duplamente manchados com 5% de algodão azul em lactofenol para detectar o fungo e 0,05% vermelho rutênio na água para detectar pectina (grupos ácidos de ácidos poliurônicos de pectina). Haustoria fúngica de Hemileia vastatrix foram encontrados encapsulados por pectina. Na cercosporiose do café, foram observadas células de mesofílico exibindo dissolução de paredes celulares, e hifas intercelulares e conidioforos. O método aqui apresentado é eficaz para detectar uma resposta associada à pectina na interação planta-fungo.

Introdução

Mecanismos de defesa de parede celular nas plantas são cruciais para conter a infecção fúngica. Estudos têm relatado mudanças na espessura e composição da parede celular desde o século^{XIX 1,2}. Essas alterações podem ser induzidas por um patógeno fúngico que estimula a formação de uma papila, que impede que fungos entrem na célula ou possam ser usados para encapsular a hifa para isolar o protoplasto celular hospedeiro da haustoria fúngica. A produção de uma barreira dinâmica de parede celular (ou seja, papila e um haustorium totalmente envolto) é importante para promover a resistência à planta

Protocolo

1. Preparação da solução de tamponamento e reagentes

1. Prepare 2 M tampão de cacodilato adicionando 4,28 g de cacodilato de sódio a 100 mL de água destilada e ajuste o pH para 7,25 com 0,2 N HCl.
2. Prepare 100 mL da solução fixada Karnovsky misturando 10 mL de glutaraldeído aquoso de 25%, 10 mL de formaldeído aquoso de 10%, 25 mL de tampão de cacodilato de 2 M e 0,5 mL de 0,5 M CaCl₂²⁶. Coma o volume até 100 mL com água destilada.
   NOTA: A solução pode ser mantida em uma geladeira por 6 meses.
   ATENÇÃO: A solução de tamponamento de cacodilato é tóxica; portanto, manuseie a solução fixativa em um c....

Resultados

A coloração de lactofenol azul de algodão na seção incorporada pela GMA revelou a presença de várias estruturas fúngicas entre e dentro de células de mesófilo de café em interações fúnequias biotróficas e nefróficas.

No pathosystem biotrófico, quando manchado usando o método de coloração dupla, hemileia vastatrix hiphae contendo paredes celulares e o denso teor de protoplasto aparecem em azul escuro em parenchyma esponjoso e palisade (Figura 4A,B<.......

Discussão

O presente trabalho introduz um teste histoquímico alternativo de dupla coloração para investigar a composição da pectina das paredes celulares que encapsula a haustoria em um pathosystem biotrófico. O objetivo também é demonstrar a eficácia do método para detectar fungos necrotróficos e alterações na parede celular induzidas por ele. Aqui, a pectina das paredes celulares do café parenchyma pode encapsular tanto o pescoço quanto o haustorium do fungo ferrugem Hemileia vastatrix. Silva et al. também descreveram e.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Lâminas DB80 HS	Leica	14035838383	Seccionamento
Cacodilato tampão	EMS	# 11652	Fixação
Algodão Azul Lactofenol	Metaquí mica	70SOLSIG024629	Coloração
Formaldeído	EMS	# 15712	Fixação
Glutaraldeído	EMS	# 16216
Fixação Historesin Kit	Technovit / EMS	# 14653	Historesin para incorporação
Placa quente	Dubesser	SSCD25X30-110V	Microscopia de coloração
	Zeiss	# 490040-0030-000	Captura de imagem
Micrótomo (Leica RM 2540)	Leica	149BIO000C1 14050238005	Seccionamento
Bandeja de copo de moldagem de plástico	EMS	10176-30	Coloração
Vermelho de rutênio	LABHouse	#006004	Software de coloração
Axion Vision	Zeiss	#410130-0909-000 Captura de	imagem
Bomba de vácuo	Prismatec	131 TIPO 2 V.C.	fixação