Summary
Målet med detta protokoll är att karakterisera en ny modell för glaukomaös neurodegeneration baserad på 360° termisk kauterisering av limbal vaskulär plexus, vilket inducerar subakut okulär hypertoni.
Abstract
Glaukom, den näst vanligaste orsaken till blindhet i världen, är en heterogen grupp av ögonsjukdomar som kännetecknas av strukturell skada på synnerven och degeneration av retinala ganglieceller (RGC), vilket resulterar i syndysfunktion genom att avbryta överföringen av visuell information från ögat till hjärnan. Förhöjt intraokulärt tryck är den viktigaste riskfaktorn; Således har flera modeller av okulär hypertoni utvecklats hos gnagare genom antingen genetiska eller experimentella metoder för att undersöka orsakerna och effekterna av sjukdomen. Bland dessa har vissa begränsningar rapporterats, såsom kirurgisk invasivitet, otillräcklig funktionsbedömning, krav på omfattande utbildning och mycket varierande förlängning av näthinneskadan. Det aktuella arbetet karakteriserar en enkel, billig och effektiv metod för att inducera okulär hypertoni hos gnagare, baserat på lågtemperatur, fullcirkelkauterisering av limbal vaskulär plexus, en viktig komponent i kammardränering. Den nya modellen ger en tekniskt enkel, icke-invasiv och reproducerbar subakut okulär hypertension, associerad med progressiv RGC och synnervsdegeneration, och en unik postoperativ klinisk återhämtningsgrad som möjliggör in vivo funktionella studier med både elektrofysiologiska och beteendemässiga metoder.
Introduction
Medicinsk litteratur förstår glaukom som en heterogen grupp av optiska neuropatier som kännetecknas av progressiv degeneration av retinala ganglieceller (RGC), dendriter, soma och axoner, vilket resulterar i strukturell koppning (utgrävning) av synskivan och funktionell försämring av synnerven, vilket leder till amauros i okontrollerade fall genom att avbryta överföringen av visuell information från ögat till hjärnan1. Glaukom är för närvarande den vanligaste orsaken till irreversibel blindhet i världen och förutspås nå cirka 111,8 miljoner människor år 20402, vilket djupt påverkar patienternas livskvalitet (QoL) och leder till betydande socioekonomiska problem3.
Förhöjt intraokulärt tryck (IOP) är en av de viktigaste och enda modifierbara riskfaktorerna för utveckling och progression av glaukom. Bland de olika typerna av glaukom är alla, utom normal spänningsglaukom (NTG), förknippade med förhöjt IOP någon gång i sjukdomens kliniska historia. Trots anmärkningsvärda kliniska och kirurgiska framsteg för att rikta in sig på IOP och bromsa eller stoppa sjukdomsprogressionen, förlorar patienterna fortfarande synen på grund av glaukom 4,5. Därför är en grundlig förståelse av den komplexa och multifaktoriella patofysiologin för denna sjukdom absolut nödvändig för utvecklingen av mer effektiva behandlingar, särskilt för att ge neuroprotektion till RGC.
Bland en mängd olika experimentella metoder för att förstå sjukdomsmekanismer liknar djurmodeller baserade på okulär hypertoni (OHT) mest humant glaukom. Gnagarmodeller är särskilt användbara eftersom de är billiga, lätta att hantera, kan manipuleras genetiskt, har kort livslängd och har okulära anatomiska och fysiologiska egenskaper som är jämförbara med människors, t.ex. vattenproduktion och dränering 6,7,8,9,10,11,12,13 . Modeller som för närvarande används inkluderar skleros i det trabekulära nätet efter injektion av hyperton koksaltlösning i episklerala vener 14, intrakameral injektion av mikropärlor 15 eller viskoelastiska ämnen 16, kauterisering av virvelvener 17, fotokoagulering av det trabekulära nätet med argonlaser18, cirkumlimbal sutur 19 och användning av en transgen modell av åldersrelaterad OHT (DBA/2J-möss)8. Invasivitet, postoperativ opacifiering av hornhinnan, störningar i främre segmentet, omfattande inlärningskurvor, dyr utrustning och mycket varierande postoperativa IOPs är dock bland några av de rapporterade fallgroparna i samband med de nuvarande modellerna, vilket gör utvecklingen av en alternativ modell för OHT till ett krav för att övervinna dessa problem20,21,22.
Det nuvarande protokollet formaliserar ett nytt kirurgiskt ingrepp för att inducera OHT som en proxy för glaukom, baserat på limbal plexus cauterization (LPC) hos gnagare23. Detta är en enkel, reproducerbar, tillgänglig och icke-invasiv modell som ger hög effektivitet och låg variabilitet av IOP-höjning, förknippad med en unikt hög grad av fullständig klinisk återhämtning, vilket ger in vivo funktionell utvärdering i ett reducerat antal djur som används i varje försök. Operationstekniken inducerar subakut OHT med en gradvis återgång till baslinjenivåerna inom några dagar, vilket modellerar den hypertensiva attack som ses vid akut glaukom med vinkelstängning. Dessutom följs IOP-återhämtningen i modellen av kontinuerlig glaukomös neurodegeneration, vilket är användbart för framtida mekanistiska studier av sekundär degeneration av RGC, som förekommer i flera fall av humant glaukom trots adekvat kontroll av IOP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer utfördes i enlighet med uttalandet för användning av djur i oftalmisk och visuell forskning från Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) och godkändes av den etiska kommittén för användning av djur i vetenskapliga experiment från Health Sciences Center, Federal University of Rio de Janeiro (protokoll 083/17). I det aktuella arbetet användes Lister Hooded råttor av båda könen, 2-3 månader gamla och vägande 180-320 g. Förfarandet kan dock anpassas till olika råttstammar i olika åldersgrupper.
1. Ögonhypertonikirurgi och klinisk uppföljning
- Husdjur i en kontrollerad temperaturmiljö och 12 timmars ljus/mörkercykel (6: ljus på/6: ljus av) med standard pelleterat gammabestrålat foder (Nuvilab® CR-1, Quimtia S/A, Brasilien) och vatten (trippelfilter, med giftfritt aktivt kol) tillgängligt ad libitum.
- Bered en stambedövningscocktailblandning som består av tre delar 10 % ketaminhydroklorid och en del 2 % xylazinhydroklorid (spädningsmedel: sterilt vatten).
- Fixera försiktigt djuret genom att hålla i rygghuden och inducera anestesi genom intraperitoneal administrering av 1 μl/g kroppsvikt av blandningen (ketamin: 75 mg/kg; xylazin: 5 mg/kg). Kontrollera att bedövningen är korrekt efter cirka 5 minuter genom att utföra ett tånypningssvar.
- Bedöva båda ögonytorna lokalt genom att ingjuta proxymetakainhydroklorid 0,5 % ögondroppe. Vänta i 30-60 s och ta bort den återstående lösningen från den främre delen av globen genom att försiktigt röra vid den nasala eller laterala bulbära bindhinnan med en liten steril bomullspinne.
- Mät IOP vid baslinjen för både experimentella och kontralaterala kontrollögon genom att placera djuret i ett ventralt tryckläge på bänkskivan så att hornhinnans yta är lättillgänglig för tonometerns spets.
- Använd antingen applanation eller rebound handhållen tonometer (Figur 1A). Placera tonometerspetsen så att den nuddar den centrala hornhinnans zon vinkelrätt. Skaffa och beräkna medelvärdet av 3-5 tillförlitliga maskingenererade medelvärden. Varje medelvärde beräknas automatiskt av enheten efter sex lyckade individuella mätningar.
- Ladda rebound-tonometern med en sond och tryck på mätknappen en gång för att slå på den, samtidigt som du placerar enhetens spets uppåt för att undvika att sonden faller. Efter påslagning kommer displayen att visa 00 vilket indikerar att utrustningen är redo att mäta.
- Placera enheten med sondens spets på ett avstånd av 1-4 mm från hornhinnan och gör mätningar genom att snabbt och försiktigt trycka på mätknappen, utan att flytta utrustningen. Varje lyckad mätning identifieras med ett kort pip och efter sex gånger visas medelvärdet på enhetens skärm.
OBS: Trots en lång erfarenhet av applanationstonometer rekommenderar författarna att man använder en rebound-tonometer för att optimera hela proceduren, vilket gör det lättare att få tillförlitlig IOP-mätning.
- Placera djuret på en liten lateral decubitusposition under ett stereomikroskop och planera noggrant operationen genom att inspektera det experimentella ögat med 40x förstoring. Glöm inte att hålla det kontralaterala kontrollögat smort under proceduren genom att tillföra en droppe karmellosnatrium eller natriumhyaluronat.
- Med hjälp av en böjd pincett trycker du försiktigt fram den experimentella ögongloben för att exponera kärlen som omger 360° av limbus13. Med den andra handen bränner du försiktigt kärlen runt hornhinnan med en oftalmisk kauteri med låg temperatur (1 300 °F; Bovie Medical, Förenta staterna) (figur 1B-E).
OBS: Den nämnda kauteringen har en rund spets som ska beröra limbal vaskulatur längsgående. - Var försiktig så att du inte bränner hornhinnans periferi, eftersom detta kan resultera i postoperativ opacifiering av hornhinnan, vilket utesluter in vivo-bedömning av näthinnans funktion.
- Observera uppkomsten av små cirkulära märken av kauterisering på skleral limbus, utplåning av limbal vaskulatur och pupillvidgning i det opererade ögat, vilket är tecken på ett framgångsrikt kirurgiskt ingrepp.
OBS: Eftersom den limbala vaskulaturen hos råttor och möss är anatomiskt likartad13,24 och bränneriet som används har en mild liten spets, kan detta protokoll fungera även för musögat utan någon anpassning. - Efter operationen, kontrollera det omedelbara postoperativa IOP i båda ögonen, såsom beskrivs i steg 1.5.
- Applicera en droppe oftalmiskt prednisolonacetat (1,2 mg/ml) och håll detta i kontakt med den främre ytan av det experimentella ögat i cirka 40 sekunder, ersätt det sedan med en oftalmisk salva med antibiotika (oxytetracyklinhydroklorid 30 mg/g plus polymyxin B 10 000 E/g; eller ciprofloxacin 3,5 mg/g). Utför intramuskulär injektion av tramadolhydroklorid (engångsdos; 2 mg/kg) för att förhindra smärta efter ingreppet.
- Följ noga djurets återhämtning från anestesi, helst i en varm miljö som en värmedyna eller inne i buren med lämpligt strö. Var uppmärksam på andningsmönstret.
- Utför en daglig klinisk uppföljning av det experimentella ögat med topikala läkemedel som består av ett icke-steroidt antiinflammatoriskt läkemedel (NSAID, t.ex. ketorolak trometamol 0,5 % ögondroppe) och antibiotikasalva (helst samma som används omedelbart efter operationen).
OBS: Användning av NSAID snarare än steroida antiinflammatoriska ögondroppar rekommenderas eftersom de senare kan inducera OHT och används regelbundet för glukokortikoidinducerade glaukommodeller hos gnagare.- Vid lätt sedering (ketamin: 18,75 mg/kg; xylazin: 1,25 mg/kg), mät IOP företrädesvis vid samma period på dagen för att undvika bias på grund av fysiologisk cirkadisk IOP-fluktuation.
- Under ögonundersökningen, notera sällsynta kliniska intercurrences, såsom hyphema, hornhinnefibros eller skleral förtunning i samband med uveal prolaps. Hornhinneödem, kemos och konjunktival hyperemi är vanliga men tillfälliga.
- Lägg märke till fullständig klinisk återhämtning omkring postoperativ dag 7. Limbal revaskularisering börjar vanligtvis under de första två dagarna efter operationen, i linje med den förväntade gradvisa IOP-återgången till baslinjen.
2. Analys av optomotorisk respons (OMR)
OBS: För denna procedur användes ett specifikt system25.
- Arrangera fyra datorskärmar i en fyrkant, som avgränsar en arena med en plattform i mitten. På monitorerna visas bilden av en virtuell cylinder med vertikalt orienterade sinusvågsgaller (omväxlande svarta och vita ränder), som roterar runt plattformen med en fast hastighet (12 grader/s) och kontrast (100 %).
- Placera en videokamera ovanför plattformen, så att försöksledaren kan se djurets rörelser. Utför testet under fotopiska förhållanden och ställ in programvaran företrädesvis på manuellt/separat läge för att utvärdera varje öga separat.
- Låt djuren vänja sig i cirka 2 minuter på plattformen. Behåll den röda hårkorsmarkören på videoramen mellan ögonen på det fritt rörliga djuret, eftersom den indikerar mitten av den virtuella cylindern (Figur 1G)25.
- Observera OMR, som består av en reflexmässig spårning av djurets huvud och hals som framkallas av de roterande gallren. Testa de vänstra och högra visuella banorna genom att vrida riktningarna för sinusvågsgittern medurs respektive moturs.
- Presentera initialt ett stimulus med låg rumslig frekvens (0,042 cykler/grad). Öka sedan frekvensen progressivt tills spårningsrörelsen inte längre märks. Den högsta rumsliga frekvensen där en tydlig OMR framkallas motsvarar tröskelfrekvensen för det utvärderade ögat.
- Om djuret så småningom faller av plattformen under undersökningen, sätt omedelbart tillbaka det på plattformen och återuppta testet.
3. Registrering av mönsterelektroretinogram (PERG)
OBS: Elektroretinogrammet spelades in med hjälp av ett specifikt system för signalbehandling och tillhörande programvara för lagring och analys av vågformerna.
- Djupt bedöva djuren genom intramuskulär injektion av ketaminhydroklorid och xylazinhydroklorid (75 mg/kg respektive 5 mg/kg). Djup anestesi (kirurgiskt plan) minskar risken för artefakter genom ofrivilliga muskelrörelser eller alternativa ljudkällor under undersökningen. Kontrollera att bedövningen är korrekt genom att utföra ett tånypningssvar.
OBS: De nämnda anestesimedlen påverkar inte amplituden på svaret26. Eftersom en liten nål som förs in i hornhinnan användes som aktiv elektrod är intramuskulär anestesi att föredra framför intraperitoneal, eftersom det är lättare att återinjicera om råttan behöver en boosterdos (1/2 av den initiala dosen), med lägre chanser att ändra elektrodens position och därmed leda till mer reproducerbara registreringar under hela experimentet. som kan pågå i upp till 60 min. - Bedöva hornhinnan lokalt med en droppe proxymetakainhydroklorid 0,5 % och håll ögat fuktat med oftalmiska smörjmedel.
- För försiktigt in den aktiva elektroden (nål av rostfritt stål 0,25 mm × 15 mm) vid hornhinnans temporala periferi. För dessutom in referens- och jordelektroderna (nål av rostfritt stål 0,4 mm × 37 mm) i den subkutana vävnaden i den ipsilaterala temporala kantusen respektive i en av bakbenen (Figur 1I).
- För PERG, ställ in stimulus på ett svartvitt reserverande schackbräde, alternerande vid 15 omkastningar/s med konstant genomsnittlig luminans (250 cd/m2). Ställ in bandpassfiltret på 1 Hz-100 Hz.
OBS: Den snabba reverserande stimulansen genererar steady-state PERG, en stabil och reproducerbar sinusoid som samlar den vågkomponent som sannolikt är förknippad med RGC-bioelektrisk respons: NII-avböjning av transient-state PERG. - Placera djuret 20 cm från stimulusskärmen (LCD-skärm 0.58 m; Figur 1I), övervaka signalbaslinjen och starta PEREG-förvärv genom att trycka på analysknappen på förvärvssystemet.
- Under proceduren, håll djuren anpassade till omgivningsljus (vitt ljus på ~140 lux). Här presenterades sex distinkta rumsfrekvenser (i cykler per grad: 0,018, 0,037, 0,073, 0,146, 0,292, 0,585) i slumpmässig följd.
OBS: Programvaran som används för signalbehandling utför automatiskt medelvärdesbildning. Genomsnittet på 200-300 individuella vågor ansågs vara tillräckligt för att sticka ut från bruset och analysera vågamplituden.
4. Kvantifiering av retinala ganglieceller somas
OBS: Följande procedur är för kvantifiering av RGC-soma, baserat på immunhistokemisk färgning av retinala flat-mounts med en antikropp mot det hjärnspecifika homeobox/POU-domänproteinet 3A (Brn3a).
- Utsätt försöksdjur för avlivning av livmoderhalsluxation, som föregås av inandning av koldioxid för att framkalla medvetslöshet.
- Omedelbart efter avlivning dissekerar du båda ögonen under ett stereomikroskop med hjälp av en tandpincett och böjd sax.
- Utför noggrann dissektion så att både den distala delen av de extraokulära musklerna och karunkeln förblir fästa vid jordklotet, eftersom de är viktiga landmärken för topografisk orientering av näthinnan (beskrivs i steg 4.5). Försök att spara en sträcka av synnerven som är fäst vid jordklotet så länge som möjligt för framtida analys.
- Efter enukleation, placera ögonen i en 1 ml lösning av 4 % paraformaldehyd (4 % PFA) i 0,1 M fosfatbuffert (PBS) och håll den i 24 timmar för korrekt kemisk fixering.
- Separera näthinnan från resten av ögonvävnaderna.
- Under ett dissekerande mikroskop placerar du ögongloben i en petriskål täckt med 1x PBS och var uppmärksam på viktiga landmärken som näskarunkel, åderhinnesprickor och sklerala avtryck från virvelvener för korrekt topografisk orientering27.
- Penetrera den främre kammaren från den centrala hornhinnan med hjälp av en tandad pincett och böjd sax (westcott). Gör två radiella snitt till den övre (dorsala) aspekten av sklera, mot synnervens sklerala foramen, för att avgränsa ögonglobens dorsala kvadrant.
- Separera hornhinnan från resten av klotet genom ett längsgående 360° snitt vid scleral limbus. Ta bort linsen och iris och avgränsa den dorsala näthinnekvadranten med samma sklerala radiella avgränsningar som beskrivs ovan (steg 4.5.2).
- Lossa försiktigt näthinnevävnaden från åderhinnan och sklera, undvik både slumpmässiga rivsår i hela vävnaden och eventuell topografisk orienteringsförlust.
- Separera ciliarkroppen från retinal ora serrata. Ta försiktigt bort den återstående glaskroppen från näthinnans kopp med hjälp av både böjd icke-tandad pincett plus böjd sax (dra glaskroppen och dissekera den nära det inre begränsande membranet) och en liten borste.
OBS: Att ta bort glaskroppen är ett viktigt steg för att få en stark och ren immunhistokemisk signal.
- Överför isolerade näthinnor till en odlingsplatta med 24 brunnar (en näthinna per brunn) som innehåller 1 ml 1x PBS och håll den inre näthinnan uppåt.
- Permeabilisera vävnaden genom att tvätta 3 gånger i 10 minuter med ett nonjoniskt ytaktivt ämne 0,5 % utspätt i 1x PBS (0,3 ml). Skaka sedan vävnaden försiktigt i 5 % bovint serumalbumin (BSA) i nonjoniskt ytaktivt ämne 2 % och 1x PBS (blockerande lösning; 0,25 ml) i 60 minuter vid rumstemperatur.
- Under steg 4.7 bereds den primära antikroppslösningen Brn3a genom att späda 1:200 i nonjoniskt ytaktivt ämne 0,5 % och 1 x PBS plus 5 % BSA och förvara den vid 4 °C.
- Efter 60 minuters vävnadsblockering inkuberas näthinnan i 0,2 ml primär antikroppslösning vid 4 °C i 72 timmar med lätt skakning.
- Tvätta vävnaden 3 gånger i 10 minuter med 1 x PBS och inkubera sedan vävnaden i 2 timmar vid rumstemperatur i 0,2 ml sekundär antikroppslösning utspädd 1:750 i 1x PBS plus 5 % BSA.
- Inkubera sedan vävnaden i 10 minuter i nukleär motfärgningslösning för fluorescerande kärnfärgning. Avsluta immunhistokemin med ett sista tvättsteg med 1x PBS (0,3 ml) upprepat 3x.
- Överför näthinnor med hjälp av två små borstar till glasmikroskopglas, med glaskroppen uppåt. Placera den dorsala näthinnekvadranten uppåt på objektglasen (tidigare avgränsad i steg 4.5.3). Gör ytterligare två radiella snitt mot synnervshuvudet för att avgränsa de andra 3 kvadranterna (nasala, ventrala och temporala).
OBS: Klippmåtten är inte fasta. De bör inte vara för korta som försämrar en effektiv tillplattning av näthinnan på objektglaset och bör inte vara för långa så att den når synnerven foramen och helt separerar den avgränsade näthinnekvadranten från resten av vävnaden. - Applicera slutligen 0,2 ml antiblekningsmonteringsmedium på ett glasglas och placera detta på den plattmonterade näthinnan för vävnadsmikroskopisk analys. För att uppskatta RGCs densitet, undersök de platta fästena under ett konfokalt epifluorescensmikroskop med hjälp av ett 40x/1.3-objektiv.
- För varje kvadrant av näthinnan, ta åtta foton: två från den centrala näthinnan (~0,9 mm från optisk skiva), tre från mitten av näthinnan (~2,0 mm från optisk skiva) och tre från den perifera näthinnan (~3,7 mm från optisk skiva), totalt 32 foton per näthinna. Använd FIJI-programvaran för att räkna Brn3a-positiva celler och uppskatta den genomsnittliga celltätheten.
5. Undersökning av synnerven
- Efter eutanasi och ögonglobseukleation (steg 4.1-4.3), avlägsna det proximala segmentet av den intraorbitala delen av synnerven (1-2 mm), inklusive en del av den intraokulära delen, och placera omedelbart proverna i injektionsflaskor/rör som innehåller 0,2-0,3 ml kallt fixeringsmedel (2,5 % glutaraldehydlösning i 0,1 M natriumkakodylatbuffert (pH 7,4)) i 2 timmar.
OBS: Följande steg för bearbetning av synnerven utförs i samma injektionsflaskor/rör från steg 5.1 - Tvätta materialet 3 gånger i 5 minuter med kall 0,1 M natriumkakodylatbuffert. Efter fixering i 1 timme skakas försiktigt i en lösning av 1,0 % osmiumtetroxid i 0,8 % kaliumferrocyanid och 5 nM kalciumklorid utspädd i 0,1 M natriumkakodylatbuffert vid 4 °C (0,1-0,2 ml).
- Tvätta synnervsfragmenten 3x i 5 min med kall 0,1 M natriumkakodylatbuffert och därefter med kallt destillerat vatten, 3x i 1 min. Förvara materialet över natten under lätt skakning i en lösning av 1,0 % uranylacetat i destillerat vatten för färgning vid 4 °C (0,1-0,2 ml). Tvätta fragmenten 3 gånger med kallt destillerat vatten.
- Torka gradvis vävnaden med en graderad acetonserie (0,5 ml vardera), med efterföljande ersättning av följande utspädningar i destillerat vatten: 2x 7 min inkubation i 15 % iskall aceton; 2x 7 min inkubation i 30 % iskall aceton; 2x 7 minuters inkubation i 50 % iskall aceton; 2x 7 min inkubation i 70 % iskall aceton; 2x 7 min inkubation i 80 % iskall aceton; 2x 7 min inkubation i 90 % iskall aceton; 2x 15 min inkubation i 100% aceton vid rumstemperatur (RT).
- Utför 3 infiltrations-/inbäddningssteg, med efterföljande byte av följande lösningar: 1 del epoxiharts: 2 delar aceton (total volym: 0,5 ml), vid RT i 12 timmar; 1 del epoxiharts: 1 del aceton (total volym: 0,5 ml), vid RT i 12 timmar; 2 delar epoxiharts: 1 del aceton (total volym: 0,5 ml), vid RT i 12 timmar. Infiltrera slutligen vävnad i rent epoxiharts vid RT i 24 timmar.
- Ta bort proverna från provbäraren, överför dem till inbäddningsformar och låt dem polymerisera i 48 timmar vid 60 °C. Skär tvärgående halvtunna sektioner (300-400 nm) av synnervsfragmenten med hjälp av en ultramikrotom, samla in och överför dem till ett mikroskopglasglas. Färga sektioner med toluidinblått och avbilda med hjälp av optiskt mikroskop vid 100x förstoring.
- För ultrastrukturell analys, utför ultratunna tvärsnitt (70 nm), samla dem på koppargaller och färga dem med uranylacetat och blycitrat. Undersök snitten i ett transmissionselektronmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De kvantitativa variablerna uttrycks som medelvärde ± medelfel av medelvärdet (SEM). Med undantag för jämförelsen av IOP-dynamiken mellan OHT och kontrollgrupper (Figur 1F) utfördes statistisk analys med hjälp av tvåvägs ANOVA följt av Sidaks test för multipla jämförelser. Ett p-värde < 0,05 ansågs vara statistiskt signifikant.
Figur 1 illustrerar kirurgiska steg i LPC-modellen (limbal plexus cauterization) med viktiga milstolpar som 360° termiskt inducerad försvinnande av limbala kärl, samt mild till måttlig mydriasis i det opererade ögat i slutet av ingreppet.
I den aktuella serien av 131 råttor inducerade limbal plexus cauterization (LPC) IOP-höjning omedelbart efter operationen från 13,0 ± 0,2 mmHg vid baslinjen till 22,7 ± 0,4 mmHg. Maximalt postoperativt IOP observerades den första dagen efter operationen (25,3 ± 0,6 mmHg), följt av en gradvis återgång till baslinjenivåerna vid den 6:e postoperativa dagen (statistisk analys: multipelt t-test korrigerat för multipla jämförelser med Holm-Sidak-metoden; Figur 1F). Hornhinnefibros eller ödem var kliniska händelser som potentiellt kunde äventyra korrekt IOP-mätning. Den första, å ena sidan, var sällsynt, drabbade 3,92 % av djuren och upptäcktes sent under den postoperativa uppföljningen, vilket skonade de första 5 dagarna av okulär hypertoni och bevarade den subakuta OHT-profilen som beskrevs23. Hornhinneödem, å andra sidan, var en vanligare komplikation som sågs under de första dagarna efter operationen (1-3 dagar), men mestadels lindrigt och övergående, och påverkade därför inte IOP23 på ett robust sätt.
Näthinnans funktion utvärderades både beteendemässigt och elektrofysiologiskt med hjälp av den optomotoriska reflexen respektive mönster-ERG (Figur 1G-J). Båda parametrarna visade två faser av funktionsnedsättning: en akut fas med okulär hypertoni 3:e dagen efter operationen och en sekundär degenerationsfas 30:e dagen efter operationen (Figur 1H, Figur J och Tabell 1). Däremellan upptäcktes en period av funktionell återhämtning, som tidigare diskuterats på annat håll23.
Jämfört med kontrollgruppen visade axonala räkningar i halvtunna tvärgående synnervssnitt progressiv minskning efter operation (3:e dagen: 68,3 % ± 0,9 %; 7:e dagen: 59,2 % ± 2,6 %; 14:e dagen: 45,4 % ± 2,2 %; 30:e dagen: 28,2 % ± 3,0 %; tvåvägs ANOVA: p < 0,0001; Figur 2A). Ultrastrukturellt uppvisade synnerver från kontrollögon tätt packade myeliniserade fibrer, separerade av tunna gliacellsutskott, och tydliga axonala mikrotubuli och neurofilament (Figur 2B). Däremot, vid 3 dagar efter OHT, fann vi fokal störning av axonbuntar, några degenererade fibrer, cytoplasmatisk vakuolering i gliacellsprocesser och kondenserat kromatin i gliacellkärnor. Efter 7 dagars OHT-induktion sågs en ökning av degenererade axonala fibrer, hypertrofiska gliacellsprocesser och svullnad och hålrum i enskilda axonala fibrer. Efter 14 dagar var en av de mest framträdande förändringarna en större oordning i de optiska nervfibrerna, i samband med invasionen av gliacellsprocesser bland axonerna. Filamentknippen fyllde dessa processer och mörka degenererade fibrer, och nedbrytning av myelin var vanligare, associerad med lossnade och vakuoliserade lameller (Figur 2B).
Tätheten av Brn3a+-profiler minskade med tiden (Figur 2C), främst i de dorsala och temporala näthinnekvadranterna, ner till 32,4 % ± 9,6 % respektive 35,7 % ± 9,1 % efter 30 dagar (figur 2D-G och tabell 2).
Figur 1: Termisk kauterisering av limbal vaskulär plexus och konsekvenser för retinal funktion in vivo. (A) Alternativa metoder för att mäta IOP hos råttor: rebound-tonometri (överlägsen) och applanationtonometri (inferior). (B-E) Kirurgiskt ingrepp; pilspets: limbal vaskulär plexus; pil: böjd pincett som används för att exponera ögonglobens främre yta och optimera kirurgisk bedömning av limbala kärl; hash: den runda spetsen på den oftalmiska brännugnen vid låg temperatur; Asterisk: kauteriseringsmärke. Skalstreck: 2 mm. Infälld i (D) visar i högre förstoring den limbala vaskulatur som ska kauteriseras. (F) Tidsförlopp för IOP-mätningar i OHT (röda) och kontrollögon (svarta) (n = 131). Vertikal nedåtpil: LPC-kirurgi. * = p < 0,05 (G) Arena för optomotorisk responsanalys, bestående av fyra datorskärmar arrangerade i en fyrhörning, med en plattform i mitten. Monitorerna visar bilden av en virtuell cylinder som består av vertikala omväxlande svarta och vita ränder som rör sig runt djuret med konstant rotationshastighet och variabla rumsfrekvenser. Det röda hårkorset motsvarar mitten av den virtuella cylindern. (H) Optomotoriska svar. Två distinkta faser urskiljs vid kirurgisk uppföljning: OHT-fasen (0-5 dagar) och den sekundära degenerationsfasen (6-30 dagar). = p < 0,0001. I) Elektroder och djurpositionering för mönster-ERG (PERG): den aktiva elektroden vid hornhinnans temporala periferi och referens- och jordelektroderna i den subkutana vävnaden i den ipsilaterala temporala kantusen respektive en av bakbenen. Djuret är placerat 20 cm från stimulusskärmen. (J) PERG-amplitud vid stimuli med olika rumsfrekvenser. I likhet med det optomotoriska svaret visar PEREG-utvärderingen också två distinkta faser av svar efter operation: okulär hypertensiv 3 dagar efter operationen, följt av återhämtning vid dag 7 och 14, även om den fortfarande är statistiskt lägre än naiva svar, och en efterföljande minskning vid dag 30 efter operationen. c/d = cykler per grad. Naiv grupp: Ögon hos djur som inte utsatts för någon tidigare experimentell manipulation. (H) och (J) visar medelvärdet ± SEM, plus enskilda replikat i (H). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Strukturell bedömning av näthinnan och synnerven efter limbal vaskulär plexuskauterisering (LPC) med lågtemperaturoftalmisk kauteri. (A) Axonräkningar vid distinkta tidpunkter efter OHT (n = 3). = p = 0,0005, **** = p < 0,0001. (B) Elektronmikroskop av synnervsdegeneration efter OHT. Den vänstra bilden visar kontrollsynnerven, och följande bilder illustrerar den progressiva degenerationen efter 3, 7 och 14 dagars OHT. Pilspets: normala myeliniserade fibrer; tunna pilar: degenererade fibrer; asterisk: cytoplasmatisk vakuolering; hashar: gliaceller process; och Nu: gliacellkärna. C) Mikrofotografier av representativa räknefält för RGC-märkta kärnor märkta med en antikropp mot kärnorna Brn3a (röd) och TO-PRO3 (blå). Skalstapel: 50 μm. (D-G) Fördelning av genomsnittlig Brn3a+ celltäthet i näthinnans fyra kvadranter efter 3-30 dagars operation. Graferna visar individuella medelvärden av RGC-densiteter för 3-11 djur per gång efter försöket. * = p < 0,05; ** = p < 0,01; = p < 0,001; = p < 0,0001. Kvantitativ data är medelvärde ± SEM. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Statistisk analys av PEREG-data. Tvåvägs ANOVA följt av Sidaks test för multipla jämförelser. P-värde mindre än 0,05 ansågs vara statistiskt signifikant. c/d = cykler per grad. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 2: Regional förlust av RGC efter LPC. SEM: medelvärdets standardfel. Kontroll: medöga. P-värden mindre än 0,05 ansågs vara statistiskt signifikanta (*). Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Limbal plexus cauterization (LPC) är en ny posttrabekulär modell med fördelen att den riktar sig mot lättillgängliga vaskulära strukturer som inte kräver konjunktival eller tappdissektion17,28. Till skillnad från virvelvenernas kauteriseringsmodell, en välkänd OHT-modell baserad på den kirurgiska försämringen av koroid venöst dränage, förväntas venös trängsel inte påverka IOP-ökningen i LPC-modellen, eftersom limbala vener är belägna uppströms i vattenhaltigt utflöde. Dessutom är det tekniskt lätt att lära sig och billigt, vilket kräver mestadels ett termiskt bränneri med låg temperatur. Dessutom är det förknippat med en unik grad av OHT-induktion och fullständig klinisk återhämtning (> 90 %, som tidigare rapporterats)23, vilket minskar antalet djur som krävs för experiment och möjliggör både elektrofysiologisk och beteendeanalys. Slutligen är glaukomatös degeneration närvarande i både RGC-skiktet och synnerven inom en relativt kort tidsram efter operationen, vilket möjliggör antingen kortsiktig eller medellång experimentell design23. Framtida studier är nödvändiga för att ytterligare belysa effekten av limbal vaskulaturkauterisering på enskilda näthinnelager.
Kritiska steg i det kirurgiska protokollet är: (1) kauteriseringsspetsen måste försiktigt vidröra den sklerala limbus parallellt med kärlaxeln; (2) Hornhinnevävnad måste skonas, inte bara under kauterisering utan även under djurmanipulation. Utför regelbundet ögondroppsinstillation och avlägsnande av överflödig lösning från ögonytan med en bomullspinne (var försiktig så att du inte skrubbar bomullspinnen på hornhinnans yta medan du tar bort någon vätska, eftersom det leder till nötning av hornhinnans epitel och eventuella komplikationer efter operationen); (3) en hel cirkel av sammanhängande kauteriseringsmärken bör visualiseras; (4) Försumma inte postoperativ klinisk uppföljning med ett icke-steroidalt antiinflammatoriskt läkemedel och antibiotikasalva, åtminstone fram till den 5:e dagen efter operationen.
Den subakuta IOP-höjningen som ses i den beskrivna modellen skiljer sig från tryckdynamiken hos öppenvinkelglaukom men är besläktad med akut vinkelslutande glaukom, neovaskulärt glaukom eller flera typer av posttrabekulärt glaukom med förhöjt episkleralt venöst tryck29. Detta är en stor begränsning med denna metod, eftersom öppenvinkelglaukom är den vanligaste fenotypen av sjukdomen, som kännetecknas av kronisk OHT och långsamt progressiv RGC-degeneration. Icke desto mindre utgör sambandet mellan progressiv normalisering av IOP och kontinuerlig RGC-degeneration en unik möjlighet att i samma djurmodell studera både de biologiska mekanismer som kopplar okulär hypertoni till utveckling och progression av glaukom, samt den sekundära degenerativa process som oftast observeras i öppenvinkelglaukomfall, varpå patienter uppvisar glaukomprogression trots klinisk eller kirurgisk framgång med att nå mål-IOP30. Således representerar denna modell en möjlighet att bättre belysa detta fenomen genom kortsiktiga eller medellånga experimentella designer, och så småningom utveckla tryckoberoende neuroprotektiva terapier för att gynna patienter som fortfarande förlorar synen trots bästa IOP-kontrollbehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar våra laboratorietekniker José; Nilson dos Santos, Daianne Mandarino Torres, José Francisco Tibúrcio, Gildo Brito de Souza och Luciano Cavalcante Ferreira. Denna forskning finansierades av FAPERJ, CNPq och CAPES.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Isofar | 201 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Active electrode for electroretinography | Hansol Medical Co | - | Stainless steel needle 0.25 mm × 15 mm |
| Anestalcon | Novartis Biociências S/A | MS-1.0068.1087 | Proxymetacaine hydrochloride 0.5% |
| Calcium chloride | Vetec | 560 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Cautery Low Temp Fine Tip 10/bx | Bovie Medical Corporation | AA00 | Low-temperature ophthalmic cautery |
| Cetamin | Syntec do Brasil Ltda | 000200-3-000003 | Ketamine hydrochloride 10% |
| DAKO | Dako North America | S3023 | Antifade mounting medium |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 28718-90-3 | diamidino-2-phenylindole; blue fluorescent nuclear counterstain; emission at 452±3 nm |
| Ecofilm | Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda | MS-1.0298.0487 | Carmellose sodium 0.5% |
| EPON Resin | Polysciences, Inc. | - | Epoxy resin used for electron microscopy, composed of a mixture of four reagents: Poly/Bed 812 Resin (CAT#08791); DDSA - Dodecenylsuccinic Anhydride (CAT#00563); NMA - Nadic Methyl Anhydride (CAT#00886); DMP-30 - 2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol (CAT#00553) |
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16110 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Hyabak | União Química Farmacêutica Nacional S/A | MS-8042140002 | Sodium hyaluronate 0.15% |
| Icare Tonolab | Icare Finland Oy | TV02 (model number) | Rebound handheld tonometer |
| IgG donkey anti-mouse antibody + Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A31570 | Secondary antibody solution |
| LCD monitor 23 inches | Samsung Electronics Co. Ltd. | S23B550 | Model LS23B550, for electroretinogram recording |
| LSM 510 Meta | Carl Zeiss | - | Confocal epifluorescence microscope |
| Maxiflox | Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda | MS-1.0298.0489 | Ciprofloxacin 3.5 mg/g |
| MEB-9400K | Nihon Kohden Corporation | - | System for electroretinogram recording |
| monoclonal IgG1 mouse anti-Brn3a | MilliporeSigma | MAB-1585 | Brn3a primary antibody solution |
| Neuropack Manager v08.33 | Nihon Kohden Corporation | - | Software for electroretinogram signal processing |
| Optomotry | CerebralMechanics | - | System for optomotor response analysis |
| Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19100 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Potassium ferrocyanide | Electron Microscopy Sciences | 20150 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Reference and ground electrodes for electroretinography | Chalgren Enterprises | 110-63 | Stainless steel needles 0.4 mm × 37 mm |
| Sodium cacodylate buffer | Electron Microscopy Sciences | 12300 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Ster MD | União Química Farmacêutica Nacional S/A | MS-1.0497.1287 | Prednisolone acetate 0.12% |
| Terolac | Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda | MS-1.0497.1286 | Ketorolac trometamol 0.5% |
| Terramicina | Laboratórios Pfizer Ltda | MS-1.0216.0024 | Oxytetracycline hydrochloride 30 mg/g + polymyxin B 10,000 U/g |
| Tono-Pen XL | Reichert Technologies | 230635 | Digital applanation handheld tonometer |
| TO-PRO-3 | Thermo Fisher Scientific | T3605 | Far red-fluorescent nuclear counterstain; emission at 661 nm |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9036-19-5 | Non-ionic surfactant |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Xilazin | Syntec do Brasil Ltda | 7899 | Xylazine hydrochloride 2% |
| Carl Zeiss | - | Stereo microscope for surgery and retinal dissection |
References
- Weinreb, R. N., Aung, T., Medeiros, F. A. The Pathophysiology and Treatment of Glaucoma A Review. JAMA. 311 (8), 1901-1911 (2014).
- Tham, Y. C., et al. Global prevalence of glaucoma and projections of glaucoma burden through 2040: A systematic review and meta-analysis. Ophthalmology. 121 (11), 2081-2090 (2014).
- Quaranta, L., et al. Quality of Life in Glaucoma: A Review of the Literature. Advances in Therapy. 33 (6), 959-981 (2016).
- Heijl, A., et al. Reduction of intraocular pressure and glaucoma progression: results from the Early Manifest Glaucoma Trial. Archives of Ophthalmology. 120 (10), Chicago, Ill. 1268-1279 (2002).
- Susanna, R., De Moraes, C. G., Cioffi, G. A., Ritch, R. Why Do People (Still) Go Blind from Glaucoma. Translational Vision Science & Technology. 4 (2), 1 (2015).
- Fujikawa, K., et al. VAV2 and VAV3 as candidate disease genes for spontaneous glaucoma in mice and humans. PLoS One. 5 (2), 9050 (2010).
- Mao, M., Hedberg-Buenz, A., Koehn, D., John, S. W., Anderson, M. G. Anterior segment dysgenesis and early-onset glaucoma in nee mice with mutation of Sh3pxd2b. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2679-2688 (2011).
- John, S. W., et al. Essential iris atrophy, pigment dispersion, and glaucoma in DBA/2J mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (6), 951-962 (1998).
- Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N. Ocular hypertension in mice with a targeted type I collagen mutation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (4), 1581-1585 (2003).
- Chou, T. H., Tomarev, S., Porciatti, V. Transgenic mice expressing mutated Tyr437His human myocilin develop progressive loss of retinal ganglion cell electrical responsiveness and axonopathy with normal iop. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (9), 5602-5609 (2014).
- vander Zypen, E. Experimental morphological study on structure and function of the filtration angel of the rat eye. Ophthalmologica. 174 (5), 285-298 (1977).
- Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N.
- Morrison, J. C., Fraunfelder, F. W., Milne, S. T., Moore, C. G.
- Morrison, J. C., et al. A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage. Experimental Eye Research. 64 (1), 85-96 (1997).
- Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: A paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (1), 207-216 (2010).
- Zhu, M. D., Cai, F. Y. Development of experimental chronic intraocular hypertension in the rabbit. Australian and New Zealand Journal of Ophthalmology. 20 (3), 225-234 (1992).
- Shareef, S. R., Garcia-Valenzuela, E., Salierno, A., Walsh, J., Sharma, S. C. Chronic ocular hypertension following episcleral venous occlusion in rats. Experimental Eye Research. 61 (3), 379-382 (1995).
- Levkovitch-Verbin, H., et al. Translimbal laser photocoagulation to the trabecular meshwork as a model of glaucoma in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43 (2), 402-410 (2002).
- Zhao, D., et al. Characterization of the Circumlimbal Suture Model of Chronic IOP Elevation in Mice and Assessment of Changes in Gene Expression of Stretch Sensitive Channels. Frontiers in Neuroscience. 11, (2017).
- Biswas, S., Wan, K. H. Review of rodent hypertensive glaucoma models. Acta Ophthalmologica. 97 (3), 331-340 (2019).
- Pitha, I., et al. Sustained Dorzolamide Release Prevents Axonal and Retinal Ganglion Cell Loss in a Rat Model of IOP-Glaucoma. Translational Vision Science & Technology. 7 (2), 13 (2018).
- Grozdanic, S. D., et al. Temporary elevation of the intraocular pressure by cauterization of vortex and episcleral veins in rats causes functional deficits in the retina and optic nerve. Experimental Eye Research. 77 (1), 27-33 (2003).
- Lani, R., et al. A subacute model of glaucoma based on limbal plexus cautery in pigmented rats. Scientific Reports. 9 (1), 16286 (2019).
- vander Merwe, E. L., Kidson, S. H. The three-dimensional organisation of the post-trabecular aqueous outflow pathway and limbal vasculature in the mouse. Experimental Eye Research. 125, 226-235 (2014).
- Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (12), 4611-4616 (2004).
- Sasovetz, D. Ketamine hydrochloride: an effective general anesthetic for use in electroretinography. Annals of Ophthalmology. 10 (11), 1510-1514 (1978).
- Stabio, M. E., et al. A novel map of the mouse eye for orienting retinal topography in anatomical space. The Journal of Comparative Neurology. 526 (11), 1749-1759 (2018).
- Blanco, R., et al. A Chronic Ocular-Hypertensive Rat Model induced by Injection of the Sclerosant Agent Polidocanol in the Aqueous Humor Outflow Pathway. International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3209 (2019).
- Paranhos, A., Prata, J. A., de Mello, P. A., da Silva, F. A. Post-Trabecular Glaucomas with Elevated Episcleral Venous Pressure. Mechanisms of the Glaucomas. , Humana Press. 139-157 (2008).
- Ou, Y., Jo, R. E., Ullian, E. M., Wong, R. O. L., Della Santina, L. Selective Vulnerability of Specific Retinal Ganglion Cell Types and Synapses after Transient Ocular Hypertension. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of The Society for Neuroscience. 36 (35), 9240-9252 (2016).
