Summary
I cibridi transmitocondriali sono cellule ibride ottenute fondendo cellule impoverite di DNA mitocondriale (mtDNA) (cellule rho0 ) con citoplasti (cellule enucleate) derivati da pazienti affetti da disturbi mitocondriali. Consentono la determinazione dell'origine nucleare o mitocondriale della malattia, la valutazione dell'attività biochimica e la conferma del ruolo patogenetico delle varianti correlate al mtDNA.
Abstract
La carenza dei complessi della catena respiratoria mitocondriale che effettuano la fosforilazione ossidativa (OXPHOS) è il marcatore biochimico dei disturbi mitocondriali umani. Da un punto di vista genetico, l'OXPHOS rappresenta un esempio unico perché deriva dalla complementazione di due sistemi genetici distinti: il DNA nucleare (nDNA) e il DNA mitocondriale (mtDNA). Pertanto, i difetti di OXPHOS possono essere dovuti a mutazioni che colpiscono i geni codificati nucleari e mitocondriali.
Il lavoro pionieristico di King e Attardi, pubblicato nel 1989, ha dimostrato che le linee cellulari umane impoverite di mtDNA (chiamato rho0) potrebbero essere ripopolate dai mitocondri esogeni per ottenere i cosiddetti "cibridi transmitocondriali". Grazie a questi cibridi contenenti mitocondri derivati da pazienti con disturbi mitocondriali (MD) e nuclei da cellule rho0 , è possibile verificare se un difetto è correlato al mtDNA o all'nDNA. Questi cibridi sono anche un potente strumento per convalidare la patogenicità di una mutazione e studiarne l'impatto a livello biochimico. Questo documento presenta un protocollo dettagliato che descrive la generazione, la selezione e la caratterizzazione dei cibridi.
Introduction
I disturbi mitocondriali (MD) sono un gruppo di sindromi multisistemiche causate da una compromissione delle funzioni mitocondriali a causa di mutazioni nel DNA1 nucleare (nDNA) o mitocondriale (mtDNA). Sono tra le malattie metaboliche ereditarie più comuni, con una prevalenza di 1:5.000. Le malattie associate al mtDNA seguono le regole della genetica mitocondriale: ereditarietà materna, eteroplasmia ed effetto soglia e segregazione mitotica2. Il mtDNA umano è un cerchio di DNA a doppio filamento di 16,6 kb, che contiene una breve regione di controllo con sequenze necessarie per la replicazione e la trascrizione, 13 geni codificanti proteine (tutte le subunità della catena respiratoria), 22 tRNA e 2 geni rRNA3.
Negli individui sani, esiste un singolo genotipo di mtDNA (omoplasmia), mentre più di un genotipo coesiste (eteroplasmia) in condizioni patologiche. Le mutazioni eteroplasmatiche deleterie devono superare una soglia critica per interrompere OXPHOS e causare malattie che possono colpire qualsiasi organo a qualsiasi etàdi 4 anni. La duplice genetica di OXPHOS determina la trasmissione: autosomica recessiva o dominante e legata all'X per le mutazioni del nDNA, materna per le mutazioni del mtDNA, più casi sporadici sia per nDNA che per mtDNA.
All'inizio dell'era della medicina mitocondriale, un esperimento storico di King e Attardi5 ha stabilito le basi per comprendere l'origine di una mutazione responsabile di una MD creando cellule ibride contenenti nuclei da linee cellulari tumorali in cui il mtDNA era completamente impoverito (cellule rho0) e mitocondri da pazienti con MD. Tecniche di sequenziamento di nuova generazione (NGS) non erano disponibili in quel momento, e non è stato facile determinare se una mutazione fosse presente nel genoma nucleare o mitocondriale. Il metodo, descritto nel 1989, è stato poi utilizzato da diversi ricercatori che lavorano nel campo della medicina mitocondriale 6,7,8,9; un protocollo dettagliato è stato recentemente pubblicato10, ma nessun video è stato ancora realizzato. Perché un tale protocollo dovrebbe essere rilevante al giorno d'oggi quando NGS potrebbe identificare in modo preciso e rapido dove si trova una mutazione? La risposta è che la generazione di cibridi è ancora il protocollo all'avanguardia per comprendere il ruolo patogenetico di qualsiasi nuova mutazione del mtDNA, correlare la percentuale di eteroplasmia con la gravità della malattia ed eseguire un'indagine biochimica in un sistema nucleare omogeneo in cui il contributo del background nucleare autoctono del paziente è assente11, 12,13.
Questo protocollo descrive come ottenere citoplasti da fibroblasti confluenti derivati dal paziente coltivati in piastre di Petri da 35 mm. La centrifugazione delle piastre in presenza di citocalasina B consente l'isolamento di citoplasti enucleati, che vengono poi fusi con cellule rho0 in presenza di polietilenglicole (PEG). I cibridi risultanti vengono quindi coltivati in mezzo selettivo fino a quando non sorgono cloni. La sezione dei risultati rappresentativi mostra un esempio di caratterizzazione molecolare dei cibridi risultanti per dimostrare che il mtDNA è identico a quello dei fibroblasti dei pazienti donatori e che l'nDNA è identico al DNA nucleare della linea cellulare tumorale rho0 .
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Protocol
NOTA: L'uso di fibroblasti umani può richiedere l'approvazione etica. I fibroblasti utilizzati in questo studio sono stati derivati da pazienti con MD e conservati nella biobanca istituzionale in conformità con i requisiti etici. È stato fornito il consenso informato per l'uso delle cellule. Eseguire tutte le procedure di coltura cellulare in un armadio a flusso laminare sterile a temperatura ambiente (RT, 22-25 °C). Utilizzare soluzioni filtrate sterili adatte per colture cellulari e apparecchiature sterili. Far crescere tutte le linee cellulari in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO2. I test del micoplasma dovrebbero essere condotti settimanalmente per garantire colture prive di micoplasma. 143BTK- rho0 celle possono essere generate come descritto in precedenza5.
1. Coltura delle cellule
- Prima di iniziare qualsiasi procedura, verificare la presenza della mutazione nei fibroblasti derivati da pazienti MD e quantificare la percentuale di eteroplasmia o omoplasmia mediante restriction fragment length polymorphism (RFLP) e/o analisi di sequenziamento dell'intero mtDNA14.
- Fibroblasti di semi in quattro piastre di Petri da 35 mm, ciascuna contenente 2 ml di terreno di coltura completo (Tabella 1). Lasciare che le cellule crescano fino all'80% confluenti (48 h).
- Coltivare 143 celluleBTK- rho0 in 8 mL di terreno di coltura integrato (Tabella 1) in una capsula di Petri da 100 mm.
- Mantenere le cellule in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO2.
- Controllare l'assenza di mtDNA nelle cellule rho0 mediante tecniche di sequenziamento14.
2. Enucleazione dei fibroblasti
- Sterilizzare quattro flaconi da 250 mL adatti alla centrifuga mediante sterilizzazione in autoclave a 121 °C per un ciclo di 20 minuti. Asciugali in un forno da laboratorio o a RT.
- Preriscaldare la centrifuga a 37 °C.
- Lavare due volte i piatti da 35 mm contenenti i fibroblasti, utilizzando 2 ml di 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) senza (senza) calcio e magnesio.
- Pulire la superficie esterna dei piatti con etanolo al 70% e attendere che l'alcol evapori.
- Rimuovere i coperchi dai piatti e i tappi a vite dalle bottiglie. Posizionare ogni piatto, senza coperchio, a testa in giù sul fondo di ogni flacone da 250 ml di centrifuga.
- Aggiungere lentamente 32 ml di Enucleation Medium a ciascun flacone (Tabella 1), permettendo al mezzo di entrare nel piatto e di entrare in contatto con le cellule. Rimuovere eventuali bolle dai piatti utilizzando una lunga pipetta Pasteur di vetro, curvando la punta in una fiamma Bunsen.
NOTA: È importante rimuovere le bolle per consentire al mezzo di entrare nel piatto e venire a contatto con le cellule. - Chiudere ogni flacone con il tappo a vite e trasferirle nella centrifuga.
- Centrifuga per 20 min a 37 °C e 8.000 × g, accelerazione max, decelerazione lenta. Attenzione al bilanciamento della centrifuga: contrappeso ogni bottiglia. Se necessario, regolare il peso aggiungendo un volume adeguato di Enucleation Medium.
- Durante la centrifugazione, utilizzare sottovuoto o una pipetta sierologica da 10 mL per aspirare e scartare il mezzo dalle piastre di coltura 143BTK- rho0 e lavarle due volte utilizzando 4 mL di 1x PBS senza calcio e magnesio.
- Aggiungere 2 ml di tripsina per coprire completamente il monostrato cellulare.
- Mettere i piatti in un'incubatrice a 37 °C per ~ 2 min.
- Rimuovere le piastre dall'incubatrice, osservare il distacco cellulare utilizzando un microscopio invertito per cellule vive (obiettivi 4x o 10x) e inibire l'attività enzimatica aggiungendo 2 ml di terreno di coltura integrato.
- Aspirare i 4 mL della sospensione cellulare nel piatto con una pipetta da 10 mL e trasferirla in un tubo conico da 15 mL.
- Contare le cellule utilizzando una camera emocitometrica Burker o un contatore automatico.
- Al termine della centrifugazione (fase 2.8), aspirare il mezzo dalle bottiglie ed eliminarlo.
- Rimuovere i piatti invertendo le bottiglie su una garza sterile precedentemente spruzzata con etanolo al 70%. Pulire la superficie esterna dei piatti e i loro coperchi con il 70% di etanolo. Attendere che l'alcol evapori, quindi chiudere i piatti.
- Prima di procedere, verificare la formazione di citoplasti (fantasma) utilizzando un microscopio invertito per cellule vive (obiettivo 4x o 10x). Cerca fibroblasti estremamente allungati a causa dell'estrusione dei loro nuclei indotta dalla citocalasina B.
- Ad ogni piatto da 35 mm, aggiungere 1 × 106 di 143BTK- rho0 cellule risospese in 2 mL di terreno di coltura 143BTK- rho0 integrato con siero bovino fetale al 5% (FBS).
- Lasciare le piastre per 3 ore in un incubatore umidificato a 37 °C e 5% co2 e lasciare che le cellule 143BTK- rho0 si depositino sui fantasmi. Non disturbare i piatti.
3. Fusione dei fibroblasti enucleati con cellule rho 0
- Dopo 3 ore di incubazione, aspirare e scartare il mezzo dai piatti.
- Lavare le cellule aderenti due volte con 2 mL di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ad alto contenuto di glucosio senza siero o con Minimum Essential Medium (MEM).
- Aspirare e scartare il mezzo.
- Aggiungere 500 μL di soluzione PEG (vedere la tabella dei materiali) alle cellule e incubare per esattamente 1 minuto.
- Aspirare ed eliminare la soluzione PEG.
- Lavare le cellule tre volte utilizzando 2 ml di DMEM ad alto contenuto di glucosio senza siero o con MEM.
- Aggiungere 2 ml di Fusion Medium (Tabella 1) e incubare durante la notte nell'incubatore a 37 °C con il 5% di CO2.
4. Selezione ed espansione di Cybrid
- Dopo l'incubazione notturna, rimuovere le piastre dall'incubatrice, tripsinizzare le cellule come descritto sopra (passaggi 2.9-2.13) e trasferire il contenuto di ciascun piatto da 35 mm in un piatto da 100 mm.
- Aggiungere 8 mL di Selection Medium (Tabella 1) e posizionare le piastre nell'incubatore a 37 °C con il 5% di CO2.
- Cambia il mezzo ogni 2-3 giorni.
- Attendere ~ 10-15 giorni di selezione fino a quando non compaiono colonie di cellule.
- Congela una delle quattro piastre di Petri raccogliendo tutti i cloni e generando una cultura "massiccia" come backup dei cibridi, che può essere eventualmente ricollocata e utilizzata per ulteriori indagini.
- Tripsinizzare le cellule nei restanti piatti di coltura, contare e seminare in una o più piastre di Petri a 50-100 cellule / piatto nel terreno di coltura integrato (Tabella 1) fino a quando non compaiono cloni. Lasciateli crescere per alcuni giorni.
- Pellet le celle rimanenti per centrifugazione a 1.200 × g per 3 min a RT ed scartare il surnatante.
- Estrarre il DNA dal pellet (vedi tabella dei materiali).
- Eseguire la genotipizzazione mediante un numero variabile di analisi a ripetizione tandem (VNTR) come precedentemente riportato15.
- Prelevare i cloni dalla capsula di Petri con cilindri di clonazione o una punta di pipetta, utilizzando uno stereomicroscopio per evitare il raggruppamento di diversi cloni e trasferirli in una piastra a 96 pozzetti, ciascuno contenente 200 μL di terreno di coltura integrato (Tabella 1).
- Espandi ogni clone fino a quando non ci sono abbastanza cellule per congelare ed estrarre il DNA.
- Verificare la percentuale di mutazione di ciascun clone mediante RFLP o altri metodi di sequenziamento. Idealmente, cerca di ottenere sia cloni con mtDNA wild-type (mutazione 0%) che cloni con diverse percentuali di mutazione, entrambi sommati al mtDNA mutante omoplasmatico (mutazione 100%). Vedere la Figura 1 per un diagramma schematico del protocollo di generazione cybrid.
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Representative Results
La generazione di cybrid richiede 3 giorni di lavoro di laboratorio più un periodo di selezione (~ 2 settimane) e ulteriori 1-2 settimane per la crescita dei cloni. I passaggi critici sono la qualità dei citoplasti e il periodo di selezione. La morfologia dei cibridi assomiglia a quella delle cellule donatrici rho0. L'assegnazione del mtDNA e dell'nDNA corretti nei cibridi è obbligatoria per confermare l'identità delle cellule. Un esempio è riportato nella Figura 2. In questo caso, abbiamo generato cibridi a partire da fibroblasti derivati da un paziente portatore dell'eteroplasmatico m.3243A>G, una delle mutazioni più comuni del mtDNA associate a miopatia mitocondriale, encefalopatia, acidosi lattica ed episodi simili a ictus (MELAS). L'analisi della VNTR ha mostrato che l'nDNA cibridi è identico a quello delle cellule rho0 (Figura 2A), confermando la sostituzione dell'nDNA del paziente con il genoma 143B. Le analisi RFLP e/o di sequenziamento possono essere utilizzate per valutare la presenza della mutazione del mtDNA e la percentuale di eteroplasmia (Figura 2B,C).
Figura 1: Diagramma schematico del protocollo di generazione cybrid. I fibroblasti derivati dal paziente vengono trattati con citocalasina B e centrifugati per ottenere citoplasti (cellule enucleate). La fusione citoplasmatica di citoplasti e cellule impoverite di mtDNA (143BTk- rho0) consente la generazione di cibridi che possono essere isolati dopo la selezione nel mezzo appropriato. La raccolta e l'amplificazione di singoli cloni produce diverse percentuali di eteroplasmia, che in teoria possono variare dal 100% wild-type al 100% mutato. Abbreviazione: mtDNA = DNA mitocondriale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Caratterizzazione molecolare dei cibridi. (A) L'analisi dei microsatelliti Apo-B mostra che l'nDNA estratto dai cibridi generati è identico al DNA nucleare della linea cellulare rho0 . (B) Mappe di restrizione HaeIII del prodotto PCR che coprono le specie m.3243A>G associate a MELAS, utilizzate per quantificare la quantità di WT) e Mut mtDNA. (C) Risultati rappresentativi dell'analisi RFLP che mostrano livelli di eteroplasmia m.3243A>G in diversi cloni di cibridi (c1, c2, c3). Abbreviazioni: M = marcatore; bp = coppie di basi; WT = wild-type; Mut = mutante; RFLP = polimorfismo di lunghezza del frammento di restrizione; MELAS = miopatia mitocondriale, encefalopatia, acidosi lattica ed episodi simili a ictus. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Composizione multimediale | |
| Terreno di coltura completo | Finale conc. |
| DMEM ad alto glucosio (senza L-glutammina con piruvato di sodio) | [1:1] |
| FetalClone III (Prodotto siero bovino) | 10% |
| Piruvato di sodio 100 mM | 1 mM |
| Penicillina-streptomicina (soluzione 100x) | 1% |
| L-Glutammina 200 mM (100x) | 2 mM |
| Terreno di coltura integrato | Finale conc. |
| DMEM ad alto glucosio (senza L-glutammina con piruvato di sodio) | [1:1] |
| FetalClone III (Prodotto siero bovino) | 10% |
| Piruvato di sodio 100 mM | 1 mM |
| Penicillina-streptomicina (soluzione 100x) | 1% |
| L-Glutammina 200 mM (100x) | 4 mM |
| Uridina | 50 μg/mL |
| Mezzo di enucleazione | Finale conc. |
| DMEM ad alto glucosio (senza L-glutammina con piruvato di sodio) | [1:1] |
| FetalClone III (Prodotto siero bovino) | 5% |
| Piruvato di sodio 100 mM | 1 mM |
| Penicillina-streptomicina (soluzione 100x) | 1% |
| L-Glutammina 200 mM (100x) | 2 mM |
| Citocalasina B di Drechslera dematioidea | 10 μg/mL |
| Mezzo di fusione | Finale conc. |
| DMEM ad alto glucosio (senza L-glutammina con piruvato di sodio) | [1:1] |
| FetalClone III (Prodotto siero bovino) | 5% |
| Piruvato di sodio 100 mM | 1 mM |
| Penicillina-streptomicina (soluzione 100x) | 1% |
| L-Glutammina 200 mM (100x) | 2 mM |
| Mezzo di selezione | Finale conc. |
| DMEM ad alto glucosio (senza L-glutammina con piruvato di sodio) | [1:1] |
| FBS dializzato | 5% |
| Piruvato di sodio 100 mM | 1 mM |
| Penicillina-streptomicina (soluzione 100x) | 1% |
| L-Glutammina 200 mM (100x) | 2 mM |
| 5-Bromo-2'-Deossiuridina | 100 μg/ml |
Tabella 1: Dettagli dei supporti utilizzati per la generazione di cybrid.
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Discussion
Il mtDNA ha un tasso di mutazione molto elevato rispetto all'nDNA a causa della mancanza di istoni protettivi e della sua posizione vicino alla catena respiratoria, che espone la molecola a dannosi effetti ossidativi non efficacemente contrastati dai sistemi di riparazione16. Le prime mutazioni patogenetiche del mtDNA sono state identificate nel 198817,18 e da allora è stato descritto un gran numero di mutazioni. La tecnologia NGS è un approccio rilevante per lo screening dell'intero genoma mitocondriale e identificare facilmente le varianti14. Tuttavia, valutare il ruolo patogenetico di una mutazione del mtDNA mai descritta può essere difficile e si basa ancora su metodi "vecchio stile" come la generazione di cellule cibride descritte in questo protocollo 11,12,13. La generazione di cibridi qui descritta ricapitola i metodi originali descritti da King e Attardi5. Tuttavia, altri protocolli contengono modifiche minori principalmente relative ai sistemi per l'enucleazione cellulare10. In altri casi, l'enucleazione non è necessaria, ad esempio, quando il materiale biologico derivato dal paziente è costituito da piastrine, che non contengono un nucleo19.
I cibridi transmitocondriali possiedono diverse caratteristiche importanti, che li rendono uno strumento di ricerca rilevante anche quando le tecnologie molecolari ad alto rendimento possono profilare DNA e RNA a livello di singola cellula. In lavori pionieristici, i cibridi sono stati utilizzati per stabilire o confermare l'origine genetica di disturbi clinicamente e biochimicamente definiti come disturbi mitocondriali 6,7,8,9,20. Infatti, il sistema permette esclusivamente lo studio del contributo della mutazione del mtDNA senza l'influenza dei geni nucleari del proband e in un background nucleare omogeneo delle cellule rho0.
Inoltre, è possibile eseguire una correlazione quantitativa genotipo-fenotipo, grazie all'isolamento di diversi cloni di cibridi portatori di diverse percentuali delle mutazioni. I diversi cloni sono stati selezionati utilizzando Selection Medium (Tabella 1) integrato con FBS dializzato e non contenente uridina e piruvato, consentendo la crescita di cellule rho0 fuse solo con citoplasti. Pertanto, le cellule rho0 che non si erano fuse o si erano fuse con fibroblasti intatti (cellule bi- o polinucleate), così come eventuali fibroblasti intatti non enucleati residui, vengono eliminati. Infatti, le cellule rho0 sono completamente impoverite di mtDNA dall'esposizione a lungo termine a basse concentrazioni di bromuro di etidio, un potente inibitore della gamma-polimerasimitocondriale 21.
Prive di una catena respiratoria funzionale, le cellule rho0 si affidano esclusivamente alla glicolisi per il loro fabbisogno energetico e diventano dipendenti dal piruvato. Inoltre, le cellule rho0 sono diventate auxotrofiche per le pirimidine (l'uridina è un precursore della pirimidina) a causa della carenza della diidrorotato deidrogenasi, un enzima che funziona all'interno dei mitocondri e coinvolto nella biosintesi della pirimidina. Mentre le cellule rho0 sono derivate da cellule umane osteosarcoma 143B carenti di timidina chinasi (TK-), fibroblasti, citoplasti e ibridi polinucleati sono TK +. Pertanto, le cellule TK + vengono rimosse a causa dell'esposizione a 5-bromo-2'-deossiuridina. Infatti, questo analogo dell'uridina è riconosciuto da TK catalizzando la fosforilazione della desossitimidina, che viene poi utilizzata nella biosintesi del DNA. Questo processo provoca mutazioni letali che causano la morte cellulare. Un altro vantaggio dei cibridi è la possibilità di congelarli e/o riutilizzarli per lunghi periodi di coltura senza alterazioni. Inoltre, come le cellule tumorali, il loro alto tasso di crescita riduce la durata dello studio sperimentale.
Il prerequisito molecolare per rendere questo sistema utile e affidabile è verificare il corretto contributo genetico del DNA nucleare e mitocondriale e la quantità di mtDNA nei cibridi ripopolati. Al giorno d'oggi, questo può essere facilmente eseguito utilizzando tecniche NGS che consentono l'analisi dell'intera molecola di mtDNA per definire aplogruppi e verificando continuamente la presenza di eventuali altre varianti patogene indesiderate oltre alla variante in esame. Nel caso di condizioni eteroplasmatiche, l'isolamento di cloni con diversi carichi mutazionali, che vanno idealmente dallo 0% al 100%, può essere utilizzato per correlare la percentuale di mutazione con la gravità della compromissione mitocondriale.
Possibili insidie nascoste in queste procedure di generazione di cibridi sono legate all'origine tumorale delle cellule rho0 utilizzate come donatori nucleari. Queste cellule sono aneuploidi e non è chiaro come ciò possa eventualmente influenzare le funzioni mitocondriali e la traduzione e l'assemblaggio delle diverse subunità della catena respiratoria codificate rispettivamente dal DNA nucleare e mitocondriale. In generale, sarebbe consigliabile generare cibridi utilizzando cellule rho0 di diversa origine e verificare che i cloni ottenuti mostrino fenotipi comparabili. Ancora un'altra limitazione è che le cellule tumorali sono principalmente glicolitiche mentre i disturbi mitocondriali si basano massicciamente su OXPHOS. Pertanto, l'impatto di un nucleo glicolitico (cellule rho0 ) sulle conseguenze di una mutazione del mtDNA deve essere attentamente stabilito.
Nonostante le limitazioni di cui sopra, la generazione di cibridi ha rivoluzionato il campo della medicina mitocondriale ed è ancora utilizzata per stabilire il ruolo patogenetico di nuove mutazioni del mtDNA. Inoltre, la tecnologia cybrid viene utilizzata per studiare il contributo mitocondriale a diverse malattie, che vanno dalle comuni malattie neurodegenerative come il Parkinson, l'Alzheimer e la malattia di Huntington 22,23,24,25,26, al cancro e al trattamento antitumorale27,28.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Acknowledgments
Questo studio è stato condotto nel Centro per lo Studio delle Malattie Mitocondriali Pediatriche (http://www.mitopedia.org), finanziato dalla Fondazione Mariani. VT è membro dell'European Reference Network for Rare Neuromuscular Diseases (ERN EURO-NMD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Bromo-2'-Deoxyuridine | Sigma-Aldrich (Merck) | B5002-500MG | |
| 6 well Plates | Corning | 3516 | |
| 96 well Plates | Corning | 3596 | |
| Blood and Cell Culture DNA extraction kit | QIAGEN | 13323 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 | 7,200 rcf, 37 °C |
| Centrifuge bottles, 250 mL | Beckman Coulter | 356011 | |
| Cytochalasin B from Drechslera dematioidea | Sigma-Aldrich (Merck) | C2743-200UL | |
| Dialyzed FBS | Gibco | 26400-036 100mL | |
| DMEM High Glucose (w/o L-Glutamine W/Sodium Pyruvate) | EuroClone | ECB7501L | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline - PBS (w/o Calcium w/o Magnesium) | EuroClone | ECB4004L | |
| Ethanol Absolute Anhydrous | Carlo Erba | 414601 | |
| FetalClone III (Bovine Serum Product) | Cytiva - HyClone Laboratories | SH30109.03 | |
| Glass pasteur pipettes | VWR | M4150NO250SP4 | |
| Inverted Research Microscope For Live Cell Microscopy | Nikon | ECLIPSE TE200 | |
| JA-14 Fixed-Angle Aluminum Rotor | Beckman Coulter | 339247 | |
| Laboratory autoclave Vapormatic 770 | Labotech | 29960014 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | EuroClone | ECB 3000D | |
| Minimum Essential Medium MEM | Euroclone | ECB2071L | |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-318 | |
| PEG (Polyethylene glicol solution) | Sigma-Aldrich (Merck) | P7181-5X5ML | |
| Penicillin-Streptomycin (solution 100x) | EuroClone | ECB3001D | |
| Primo TC Dishes 100 mm | EuroClone | ET2100 | |
| Primo TC Dishes 35 mm | EuroClone | ET2035 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM | EuroClone | ECM0542D | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Trypsin 2.5% in HBSS | EuroClone | ECB3051D | |
| Uridine | Sigma-Aldrich (Merck) | U3003-5G |
References
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