Summary
Transmitochondrial cybrids er hybridceller oppnådd ved å fusjonere mitokondrie-DNA (mtDNA)-utarmede celler (rho0 celler) med cytoplaster (enucleated celler) avledet fra pasienter som er rammet av mitokondrieforstyrrelser. De tillater bestemmelse av sykdommens kjernefysiske eller mitokondrieopprinnelse, evaluering av biokjemisk aktivitet og bekreftelse av den patogenetiske rollen til mtDNA-relaterte varianter.
Abstract
Mangel på mitokondrie respiratoriske kjedekomplekser som utfører oksidativ fosforylering (OXPHOS) er den biokjemiske markøren for menneskelige mitokondriesykdommer. Fra et genetisk synspunkt representerer OXPHOS et unikt eksempel fordi det er et resultat av komplementering av to distinkte genetiske systemer: kjernefysisk DNA (nDNA) og mitokondrie-DNA (mtDNA). Derfor kan OXPHOS-defekter skyldes mutasjoner som påvirker kjernefysiske og mitokondriekodede gener.
Det banebrytende arbeidet til King og Attardi, publisert i 1989, viste at menneskelige cellelinjer utarmet av mtDNA (kalt rho0) kunne fylles opp av eksogene mitokondrier for å oppnå de såkalte "transmitochondrial cybrids". Takket være disse cybridene som inneholder mitokondrier avledet fra pasienter med mitokondriesykdommer (MD) og kjerner fra rho0-celler , er det mulig å verifisere om en defekt er mtDNA- eller nDNA-relatert. Disse cybridene er også et kraftig verktøy for å validere patogenisiteten til en mutasjon og studere dens innvirkning på et biokjemisk nivå. Dette dokumentet presenterer en detaljert protokoll som beskriver cybridgenerering, -utvalg og -karakterisering.
Introduction
Mitokondriesykdommer (MD) er en gruppe multisystemsyndromer forårsaket av en svekkelse i mitokondriefunksjoner på grunn av mutasjoner i enten kjernefysisk (nDNA) eller mitokondrie (mtDNA) DNA1. De er blant de vanligste arvelige metabolske sykdommene, med en prevalens på 1:5,000. mtDNA-assosierte sykdommer følger reglene for mitokondriegenetikk: mors arv, heteroplasma og terskeleffekt, og mititotisk segregering2. Human mtDNA er en dobbeltstrenget DNA-sirkel på 16,6 kb, som inneholder en kort kontrollregion med sekvenser som trengs for replikasjon og transkripsjon, 13 proteinkodingsgener (alle underenheter av luftveiene), 22 tRNA og 2 rRNA-gener3.
Hos friske individer er det en enkelt mtDNA genotype (homoplasmy), mens mer enn en genotype sameksisterer (heteroplasma) i patologiske forhold. Skadelige heteroplasmatiske mutasjoner må overvinne en kritisk terskel for å forstyrre OXPHOS og forårsake sykdommer som kan påvirke ethvert organ i alle aldre4 år. Den doble genetikken til OXPHOS dikterer arv: autosomal recessiv eller dominerende og X-koblet for nDNA-mutasjoner, mors for mtDNA-mutasjoner, pluss sporadiske tilfeller både for nDNA og mtDNA.
I begynnelsen av mitokondriemedisin-epoken etablerte et landemerkeeksperiment av King og Attardi5 grunnlaget for å forstå opprinnelsen til en mutasjon som er ansvarlig for en MD ved å lage hybridceller som inneholder kjerner fra tumorcellelinjer der mtDNA var helt utarmet (rho0 celler) og mitokondrier fra pasienter med MDs. Neste generasjons sekvensering (NGS) teknikker var ikke tilgjengelige på den tiden, og det var ikke lett å avgjøre om en mutasjon var tilstede i det kjernefysiske eller mitokondriegenomet. Metoden, beskrevet i 1989, ble deretter brukt av flere forskere som jobbet innen mitokondriemedisin 6,7,8,9; en detaljert protokoll har nylig blitt publisert10, men ingen video er laget ennå. Hvorfor skal en slik protokoll være relevant i dag når NGS nøyaktig og raskt kan identifisere hvor en mutasjon befinner seg? Svaret er at cybridgenerasjonen fortsatt er den toppmoderne protokollen for å forstå den patogene rollen til enhver ny mtDNA-mutasjon, korrelere prosentandelen av heteroplasma med alvorlighetsgraden av sykdommen, og utføre en biokjemisk undersøkelse i et homogent atomsystem der bidraget fra pasientens autochthonous kjernefysiske bakgrunn er fraværende11, 12,13.
Denne protokollen beskriver hvordan du får cytoplaster fra konfluente, pasientavledede fibroblaster dyrket i 35 mm Petri-retter. Sentrifugering av oppvasken i nærvær av cytochalasin B tillater isolering av enukleerte cytoplaster, som deretter smeltes sammen med rho0 celler i nærvær av polyetylenglykol (PEG). De resulterende cybridene dyrkes deretter i selektivt medium til kloner oppstår. Den representative resultatseksjonen viser et eksempel på molekylær karakterisering av de resulterende cybridene for å bevise at mtDNA er identisk med donorpasientenes fibroblaster, og at nDNA er identisk med kjerne-DNA-et til tumoral rho 0-cellelinjen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Bruk av menneskelige fibroblaster kan kreve etisk godkjenning. Fibroblaster som ble brukt i denne studien ble avledet fra MD-pasienter og lagret i institutional biobank i samsvar med etiske krav. Informert samtykke ble gitt for bruk av cellene. Utfør alle cellekulturprosedyrer under et sterilt laminært strømningsskap ved romtemperatur (RT, 22-25 °C). Bruk sterilfiltrerte løsninger som er egnet for cellekultur og sterilt utstyr. Voks alle cellelinjer i en fuktet inkubator ved 37 °C med 5 % CO2. Mycoplasma tester bør utføres ukentlig for å sikre mykoplasmafrie kulturer. 143BTK- rho0 celler kan genereres som tidligere beskrevet5.
1. Kultur av celler
- Før du starter en prosedyre, må du kontrollere tilstedeværelsen av mutasjonen i fibroblaster avledet fra MD-pasient(er) og kvantifisere prosentandelen av heteroplasma eller homoplasmi ved begrensning fragmentlengde polymorfisme (RFLP) og / eller hele mtDNA sekvensering analyser14.
- Frøfibroblaster i fire 35 mm Petri-retter, som hver inneholder 2 ml komplett kulturmedium (tabell 1). La cellene vokse til 80% samløp (48 h).
- Vokse 143BTK- rho0 celler i 8 ml supplert kulturmedium (tabell 1) i en 100 mm Petri-tallerken.
- Vedlikehold cellene i en inkubator ved 37 °C med 5 % CO2.
- Kontroller fraværet av mtDNA i rho0 celler ved sekvenseringsteknikker14.
2. Enucleation av fibroblaster
- Steriliser fire 250 ml sentrifuge-egnede flasker ved autoklavsterilisering ved 121 °C i en syklus på 20 minutter. Tørk dem i en laboratorieovn eller på RT.
- Forvarsling sentrifugen ved 37 °C.
- Vask de 35 mm rettene som inneholder fibroblaster to ganger, ved hjelp av 2 ml 1x fosfatbufret saltvann (PBS) uten (w / o) kalsium og magnesium.
- Rengjør den ytre overflaten av oppvasken med 70% etanol og vent til alkoholen fordamper.
- Fjern lokkene fra oppvasken og skruehettene fra flaskene. Legg hver tallerken, uten lokket, opp ned på bunnen av hver 250 ml sentrifugeflaske.
- Tilsett sakte 32 ml enukleasjonsmedium til hver flaske (tabell 1), slik at mediet kan komme inn i parabolen og komme i kontakt med cellene. Fjern eventuelle bobler fra oppvasken ved hjelp av en lang glass Pasteur pipette, bue spissen i en Bunsen flamme.
MERK: Det er viktig å fjerne boblene slik at mediet kan komme inn i parabolen og komme i kontakt med cellene. - Lukk hver flaske med skruehetten og overfør dem til sentrifugen.
- Sentrifuge i 20 min ved 37 °C og 8000 × g, akselerasjon maks, retardasjon sakte. Vær oppmerksom på å balansere sentrifugen: motvekt hver flaske. Juster om nødvendig vekten ved å legge til et passende volum av Enucleation Medium.
- Under sentrifugering, bruk vakuum eller en 10 ml serologisk pipette for å aspirere og kaste mediet fra 143BTK- rho0 kulturplater og vask dem to ganger ved hjelp av 4 ml 1x PBS m / o kalsium og magnesium.
- Tilsett 2 ml trypsin for å dekke cellemonolayeren helt.
- Plasser rettene i en 37 °C inkubator i ca. 2 min.
- Fjern oppvasken fra inkubatoren, observer celleavløsning ved hjelp av et invertert mikroskop for levende celler (mål 4x eller 10x), og hemm enzymaktiviteten ved å legge til 2 ml supplert kulturmedium.
- Aspirer 4 ml av cellefjæringen i parabolen med en 10 ml pipette og overfør den til et 15 ml konisk rør.
- Tell cellene ved hjelp av et Burker hemocytometerkammer eller en automatisert teller.
- På slutten av sentrifugering (trinn 2.8), aspirer mediet fra flaskene og kast det.
- Fjern oppvasken ved å invertere flaskene på en steril gasbind som tidligere ble sprayet med 70% etanol. Rengjør den ytre overflaten av oppvasken og lokkene med 70% etanol. Vent til alkoholen fordamper, og lukk deretter oppvasken.
- Før du fortsetter, sjekk for cytoplast (spøkelse) formasjon ved hjelp av et invertert mikroskop for levende celler (objektiv 4x eller 10x). Se etter ekstremt langstrakte fibroblaster på grunn av ekstrudering av deres kjerner indusert av cytochalasin B.
- Til hver 35 mm tallerken tilsettes 1 × 106 av 143BTK- rho0 celler resuspendert i 2 ml 143BTK- rho0 kulturmedium supplert med 5% foster bovint serum (FBS).
- La rettene stå i 3 timer i en fuktet inkubator ved 37 °C og 5 % CO2 og la cellene på 143BTK-rho0 slå seg ned på spøkelsene. Ikke forstyrr oppvasken.
3. Fusjon av de enuklede fibroblaster med rho 0 celler
- Etter 3 timers inkubasjon aspirerer du og kaster mediet fra oppvasken.
- Vask tilhengercellene to ganger med 2 ml Dulbeccos Modifiserte Eagle Medium (DMEM) høy glukose m/o serum eller med Minimum Essential Medium (MEM).
- Aspirer og kast mediet.
- Tilsett 500 μL PEG-oppløsning (se materialtabellen) i cellene og inkuber i nøyaktig 1 min.
- Aspirer og kast PEG-oppløsningen.
- Vask cellene tre ganger med 2 ml DMEM høy glukose m/o serum eller med MEM.
- Tilsett 2 ml Fusion Medium (tabell 1) og inkuber over natten i inkubatoren ved 37 °C med 5 % CO2.
4. Cybrid utvalg og utvidelse
- Etter inkubering over natten, fjern platene fra inkubatoren, prøv cellene som beskrevet ovenfor (trinn 2,9-2,13), og overfør innholdet i hver 35 mm tallerken til en 100 mm tallerken.
- Tilsett 8 ml seleksjonsmedium (tabell 1) og plasser platene i inkubatoren ved 37 °C med 5 % CO2.
- Bytt medium hver 2-3 dager.
- Vent i ~10-15 dager med merking til kolonier av celler vises.
- Frys en av de fire Petri-rettene ved å samle alle klonene og generere en "massiv" kultur som en sikkerhetskopi av cybridene, som til slutt kan gjenvinnes og brukes til videre undersøkelser.
- Prøv cellene i de resterende kulturrettene, tell og frø i en eller flere Petri-retter ved 50-100 celler/tallerken i det ekstra kulturmediet (tabell 1) til klonene vises. La dem vokse i noen dager.
- Pellet de resterende cellene ved sentrifugering ved 1200 × g i 3 minutter ved RT og kast supernatanten.
- Trekk ut DNA fra pelletsen (se materialtabellen).
- Utfør genotyping ved variabelt antall tandemly gjentatte (VNTR) analyser som tidligere rapportert15.
- Plukk opp kloner fra Petri-fatet med kloningssylindere eller en pipettespiss, bruk et stereomikroskop for å unngå sammenslåing av forskjellige kloner, og overfør dem til en 96-brønns plate, hver brønn som inneholder 200 μL ekstra kulturmedium (tabell 1).
- Utvid hver klone til det er nok celler til frysing og ekstrakt av DNA.
- Kontroller mutasjonsprosenten for hver klone ved hjelp av RFLP eller andre sekvenseringsmetoder. Ideelt sett, prøv å oppnå både kloner med wild-type mtDNA (0% mutasjon) og kloner med forskjellige mutasjonsprosenter, begge legger opp til homoplasmatisk mutant mtDNA (100% mutasjon). Se figur 1 hvis du vil se et skjematisk diagram over cybridgenereringsprotokollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Generering av cybrider krever 3 dagers laboratoriearbeid pluss en utvelgelsesperiode (~ 2 uker) og ytterligere 1-2 uker for vekst av kloner. De kritiske trinnene er kvaliteten på cytoplaster og utvelgelsesperioden. Morfologien til cybrider ligner på rho0 donorceller. Tildeling av riktig mtDNA og nDNA i cybridene er obligatorisk for å bekrefte identiteten til cellene. Et eksempel er angitt i figur 2. I dette tilfellet genererte vi cybrider fra fibroblaster avledet fra en pasient som bærer den heteroplasmatiske m.3243A>G, en av de vanligste mtDNA-mutasjonene forbundet med mitokondriemyopati, encefalopati, melkesyreose og slaglignende episoder (MELAS). Analyse av VNTR viste at cybrid nDNA er identisk med rho0-cellene (figur 2A), som bekrefter utskifting av pasientens nDNA med 143B-genomet. RFLP- og/eller sekvenseringsanalyser kan brukes til å vurdere tilstedeværelsen av mtDNA-mutasjonen og heteroplasmaprosenten (figur 2B, C).
Figur 1: Skjematisk diagram over cybridgenereringsprotokollen. Pasientavledede fibroblaster behandles med cytochalasin B og sentrifugeres for å oppnå cytoplaster (enukserte celler). Cytoplasmatisk fusjon av cytoplaster og mtDNA-utarmede celler (143BTk- rho0) tillater generering av cybrider som kan isoleres etter valg i riktig medium. Plukking og forsterkning av enkeltkloner gir forskjellige heteroplasmaprosenter, som i teorien kan variere fra 100% villtype til 100% mutert. Forkortelse: mtDNA = mitokondrie-DNA. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Molekylær karakterisering av cybrids. (A) Analyse av Apo-B-mikrosatellitter viser at nDNA hentet fra de genererte cybridene er identisk med atom-DNA-et til rho0-cellelinjen . (B) HaeIII-begrensningskart over PCR-produktet som spenner over melas-assosiert m.3243A>G, som brukes til å kvantifisere mengden WT) og Mut mtDNA-arter. (C) Representative resultater fra RFLP-analyse som viser m.3243A>G heteroplasmy nivåer i ulike cybrid kloner (c1, c2, c3). Forkortelser: M = markør; bp = basispar; WT = wild-type; Dempet = mutant; RFLP = begrensning fragment lengde polymorfisme; MELAS = mitokondriemyopati, encefalopati, melkesyreose og hjerneslaglignende episoder. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Mediesammensetning | |
| Komplett kulturmedium | Siste innrømmelse. |
| DMEM høy glukose (m/o L-glutamin M/natriumpyuvatt) | [1:1] |
| FetalClone III (Bovint serumprodukt) | 10% |
| Natrium Pyruvat 100 mM | 1 mM |
| Penicillin-Streptomycin (oppløsning 100x) | 1% |
| L-Glutamin 200 mM (100x) | 2 mM |
| Supplert kulturmedium | Siste innrømmelse. |
| DMEM høy glukose (m/o L-glutamin M/natriumpyuvatt) | [1:1] |
| FetalClone III (Bovint serumprodukt) | 10% |
| Natrium Pyruvat 100 mM | 1 mM |
| Penicillin-Streptomycin (oppløsning 100x) | 1% |
| L-Glutamin 200 mM (100x) | 4 mM |
| Uridin | 50 μg/ml |
| Enukleasjonsmedium | Siste innrømmelse. |
| DMEM høy glukose (m/o L-glutamin M/natriumpyuvatt) | [1:1] |
| FetalClone III (Bovint serumprodukt) | 5% |
| Natrium Pyruvat 100 mM | 1 mM |
| Penicillin-Streptomycin (oppløsning 100x) | 1% |
| L-Glutamin 200 mM (100x) | 2 mM |
| Cytochalasin B fra Drechslera dematioidea | 10 μg/ml |
| Fusjonsmedium | Siste innrømmelse. |
| DMEM høy glukose (m/o L-glutamin M/natriumpyuvatt) | [1:1] |
| FetalClone III (Bovint serumprodukt) | 5% |
| Natrium Pyruvat 100 mM | 1 mM |
| Penicillin-Streptomycin (oppløsning 100x) | 1% |
| L-Glutamin 200 mM (100x) | 2 mM |
| Merket områdemedium | Siste innrømmelse. |
| DMEM høy glukose (m/o L-glutamin M/natriumpyuvatt) | [1:1] |
| Dialysert FBS | 5% |
| Natrium Pyruvat 100 mM | 1 mM |
| Penicillin-Streptomycin (oppløsning 100x) | 1% |
| L-Glutamin 200 mM (100x) | 2 mM |
| 5-Bromo-2'-Deoksyuridin | 100 μg/ml |
Tabell 1: Detaljer om medier som brukes til cybridgenerering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MtDNA har en svært høy mutasjonsrate sammenlignet med nDNA på grunn av mangel på beskyttende histoner og dens plassering nær luftveiene, noe som utsetter molekylet for skadelige oksidative effekter som ikke effektivt motvirkes av reparasjonssystemene16. De første patogene mtDNA-mutasjonene ble identifisert i 1988 17,18, og siden da har et stort antall mutasjoner blitt beskrevet. NGS-teknologi er en relevant tilnærming for å screene hele mitokondriegenomet og enkelt identifisere varianter14. Imidlertid kan det være utfordrende å vurdere den patogene rollen til en aldri beskrevet mtDNA-mutasjon og er fortsatt avhengig av "gammeldagse" metoder som generering av cybridceller beskrevet i denne protokollen 11,12,13. Cybrid-generasjonen som er beskrevet her, oppsummerer de opprinnelige metodene beskrevet av King og Attardi5. Imidlertid inneholder andre protokoller mindre modifikasjoner hovedsakelig relatert til systemer for celle enucleation10. I andre tilfeller er enukleasjon unødvendig, for eksempel når det pasientavledede biologiske materialet består av blodplater, som ikke inneholder en kjerne19.
Transmitochondrial cybrids har flere viktige funksjoner, noe som gjør dem til et relevant forskningsverktøy selv når molekylær teknologi med høy gjennomstrømning kan profilere DNA og RNA på encellet nivå. I banebrytende arbeider ble cybrider brukt til å etablere eller bekrefte den genetiske opprinnelsen til lidelser klinisk og biokjemisk definert som mitokondrieforstyrrelser 6,7,8,9,20. Faktisk tillater systemet utelukkende studiet av bidraget fra mtDNA-mutasjonen uten påvirkning av probandets kjernegener og i en homogen kjernefysisk bakgrunn av rho0-cellene.
I tillegg kan en kvantitativ genotype-til-fenotype korrelasjon utføres, takket være isolering av forskjellige cybrid kloner som bærer forskjellige prosentandeler av mutasjonene. De forskjellige klonene ble valgt ved hjelp av Selection Medium (Tabell 1) supplert med dialysert FBS og inneholder ikke uridin og pyruvat, slik at veksten av rho0 celler smeltet sammen med cytoplaster bare. Dermed elimineres rho0 celler som ikke hadde smeltet sammen eller hadde smeltet sammen med intakte fibroblaster (bi- eller polynukleerte celler), samt eventuelle gjenværende ikke-enuklede intakte fibroblaster. Faktisk er rho0 celler helt utarmet av mtDNA ved langvarig eksponering for lave konsentrasjoner av ethidiumbromid, en potent hemmer av mitokondrie gammapolymerase21.
Uten en funksjonell åndedrettskjede er rho0 celler utelukkende avhengige av glykolyse for deres energibehov og blir pyruvatavhengige. I tillegg har rho0 celler blitt auxotrofiske for pyrimidiner (uridin er en pyrimidinforløper) på grunn av mangel på dihydrorotat dehydrogenase, et enzym som fungerer innen mitokondrier og involvert i pyrimidinbiosyntesen. Mens rho0 celler er avledet fra humane osteosarcoma 143B thymidine kinase-mangelfulle (TK-) celler, fibroblaster, cytoplaster, og polynukleerte hybrider er TK +. TK+- celler fjernes derfor på grunn av eksponering for 5-bromo-2'-deoksyuridin. Faktisk er denne uridinanalogen anerkjent av TK katalyserer fosforylering av deoksytymidin, som deretter brukes i DNA-biosyntese. Denne prosessen resulterer i dødelige mutasjoner som forårsaker celledød. En annen fordel med cybrids er muligheten til å fryse og / eller gjenbruke dem i lange kulturtider uten endringer. Videre, som tumorceller, reduserer deres høye vekstrate den eksperimentelle studievarigheten.
Den molekylære forutsetningen for å gjøre dette systemet nyttig og pålitelig er å verifisere riktig genetisk bidrag fra kjernefysisk og mitokondrie-DNA og mtDNA-mengden i de repopulerte cybridene. I dag kan dette enkelt utføres ved hjelp av NGS-teknikker som gjør det mulig å analysere hele mtDNA-molekylet for å definere haplogrupper og kontinuerlig verifisere tilstedeværelsen av andre uønskede patogene varianter i tillegg til varianten som undersøkes. Ved heteroplasmatiske forhold kan isolasjon av kloner med forskjellige mutasjonsbelastninger, som ideelt sett spenner fra 0% til 100%, brukes til å korrelere mutasjonsprosenten med alvorlighetsgraden av mitokondriehemmingen.
Mulige fallgruver skjult i disse cybrid generasjonsprosedyrene er knyttet til svulstopprinnelsen til rho0-cellene som brukes som atomdonorer. Disse cellene er aneuploid, og det er ikke klart hvordan dette til slutt kan påvirke mitokondriefunksjoner og oversettelsen og monteringen av de forskjellige respiratoriske kjedeunderenhetene som er kodet av henholdsvis det kjernefysiske og mitokondrie-DNA- Generelt ville det være tilrådelig å generere cybrider ved hjelp av rho0 celler av forskjellig opprinnelse og verifisere at klonene oppnådd viser sammenlignbare fenotyper. Enda en begrensning er at tumorceller hovedsakelig er glykolytiske, mens mitokondrieforstyrrelser er avhengige av OXPHOS. Derfor må virkningen av en glykolytisk kjerne (rho0 celler) på konsekvensene av en mtDNA-mutasjon være nøye etablert.
Til tross for de ovennevnte begrensningene har genereringen av cybrider revolusjonert mitokondriemedisinfeltet og brukes fortsatt til å etablere den patogene rollen til nye mtDNA-mutasjoner. Videre brukes cybridteknologi til å undersøke mitokondriebidraget til forskjellige sykdommer, alt fra vanlige nevrodegenerative lidelser som Parkinsons, Alzheimers og Huntingtons sykdom 22,23,24,25,26, til kreft- og anticancerbehandling 27,28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble utført i Center for the Study of Mitokondrie Pediatric Diseases (http://www.mitopedia.org), finansiert av Mariani Foundation. VT er medlem av European Reference Network for Rare Neuromuscular Diseases (ERN EURO-NMD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Bromo-2'-Deoxyuridine | Sigma-Aldrich (Merck) | B5002-500MG | |
| 6 well Plates | Corning | 3516 | |
| 96 well Plates | Corning | 3596 | |
| Blood and Cell Culture DNA extraction kit | QIAGEN | 13323 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 | 7,200 rcf, 37 °C |
| Centrifuge bottles, 250 mL | Beckman Coulter | 356011 | |
| Cytochalasin B from Drechslera dematioidea | Sigma-Aldrich (Merck) | C2743-200UL | |
| Dialyzed FBS | Gibco | 26400-036 100mL | |
| DMEM High Glucose (w/o L-Glutamine W/Sodium Pyruvate) | EuroClone | ECB7501L | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline - PBS (w/o Calcium w/o Magnesium) | EuroClone | ECB4004L | |
| Ethanol Absolute Anhydrous | Carlo Erba | 414601 | |
| FetalClone III (Bovine Serum Product) | Cytiva - HyClone Laboratories | SH30109.03 | |
| Glass pasteur pipettes | VWR | M4150NO250SP4 | |
| Inverted Research Microscope For Live Cell Microscopy | Nikon | ECLIPSE TE200 | |
| JA-14 Fixed-Angle Aluminum Rotor | Beckman Coulter | 339247 | |
| Laboratory autoclave Vapormatic 770 | Labotech | 29960014 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | EuroClone | ECB 3000D | |
| Minimum Essential Medium MEM | Euroclone | ECB2071L | |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-318 | |
| PEG (Polyethylene glicol solution) | Sigma-Aldrich (Merck) | P7181-5X5ML | |
| Penicillin-Streptomycin (solution 100x) | EuroClone | ECB3001D | |
| Primo TC Dishes 100 mm | EuroClone | ET2100 | |
| Primo TC Dishes 35 mm | EuroClone | ET2035 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM | EuroClone | ECM0542D | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Trypsin 2.5% in HBSS | EuroClone | ECB3051D | |
| Uridine | Sigma-Aldrich (Merck) | U3003-5G |
References
- Gorman, G. S., et al.
- DiMauro, S., Davidzon, G.
- El-Hattab, A. W., Craigen, W. J., Scaglia, F.
- Stewart, J. B., Chinnery, P. F. The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease. Nature Reviews Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).
- King, M. P., Attardi, G. Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 246 (4929), 500-503 (1989).
- Trounce, I., Neill, S., Wallace, D. C. Cytoplasmic transfer of the mtDNA nt 8993 T-->G (ATP6) point mutation associated with Leigh syndrome into mtDNA-less cells demonstrates cosegregation with a decrease in state III respiration and ADP/O ratio. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (18), 8334-8338 (1994).
- Jun, A. S., Trounce, I. A., Brown, M. D., Shoffner, J. M., Wallace, D. C. Use of transmitochondrial cybrids to assign a complex I defect to the mitochondrial DNA-encoded NADH dehydrogenase subunit 6 gene mutation at nucleotide pair 14459 that causes Leber hereditary optic neuropathy and dystonia. Molecular and Cellular Biology. 16 (3), 771-777 (1996).
- Dunbar, D. R., Moonie, P. A., Zeviani, M., Holt, I. J. Complex I deficiency is associated with 3243G:C mitochondrial DNA in osteosarcoma cell cybrids. Human Molecular Genetics. 5 (1), 123-129 (1996).
- Pye, D., et al. Production of transmitochondrial cybrids containing naturally occurring pathogenic mtDNA variants. Nucleic Acids Research. 34 (13), 95 (2006).
- Bacman, S. R., Nissanka, N., Moraes, C. T. Chapter 18 - Cybrid technology. Methods in Cell Biology. 155, 415-439 (2020).
- Rucheton, B., et al. Homoplasmic deleterious MT-ATP6/8 mutations in adult patients. Mitochondrion. 55, 64-77 (2020).
- Xu, M., et al. Identification of a novel variant in MT-CO3 causing MELAS. Frontiers in Genetics. 12, 638749 (2021).
- Habbane, M., et al. Human Mitochondrial DNA: Particularities and diseases. Biomedicines. 9 (10), 1364 (2021).
- Legati, A., et al. Current and new Next-Generation Sequencing approaches to study mitochondrial DNA. The Journal of Molecular Diagnostics. 23 (6), 732-741 (2021).
- Boerwinkle, E., Xiong, W. J., Fourest, E., Chan, L. Rapid typing of tandemly repeated hypervariable loci by the polymerase chain reaction: application to the apolipoprotein B 3' hypervariable region. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (1), 212-216 (1989).
- Lawless, C., Greaves, L., Reeve, A. K., Turnbull, D. M., Vincent, A. E. The rise and rise of mitochondrial DNA mutations. Open Biology. 10 (5), 200061 (2020).
- Wallace, D. C., et al. Mitochondrial DNA mutation associated with Leber's hereditary optic neuropathy. Science. 242 (4884), 1427-1430 (1988).
- Holt, I. J., Harding, A. E., Morgan-Hughes, J. A. Deletions of muscle mitochondrial DNA in patients with mitochondrial myopathies. Nature. 331 (6158), 717-719 (1988).
- Chomyn, A. Platelet-mediated transformation of human mitochondrial DNA-less cells. Methods in Enzymology. 264, 334-339 (1996).
- Sazonova, M. A., et al. Cybrid models of pathological cell processes in different diseases. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 4647214 (2018).
- Tarrago-Litvak, L., et al. The inhibition of mitochondrial DNA polymerase gamma from animal cells by intercalating drugs. Nucleic Acids Research. 5 (6), 2197-2210 (1978).
- Swerdlow, R. H., et al. Mitochondria, cybrids, aging, and Alzheimer's disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 146, 259-302 (2017).
- Ghosh, S. S., et al. Use of cytoplasmic hybrid cell lines for elucidating the role of mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease and Parkinson's disease. Annals of the New York Academy of Sciences. 893, 176-191 (1999).
- Buneeva, O., Fedchenko, V., Kopylov, A., Medvedev, A. Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease: focus on mitochondrial DNA. Biomedicines. 8 (12), 591 (2020).
- Weidling, I. W., et al. Mitochondrial DNA manipulations affect tau oligomerization. Journal of Alzheimer's disease: JAD. 77 (1), 149-163 (2020).
- Ferreira, I. L., et al. Bioenergetic dysfunction in Huntington's disease human cybrids. Experimental Neurology. 231 (1), 127-134 (2011).
- Cruz-Bermúdez, A., et al. Spotlight on the relevance of mtDNA in cancer. Clinical & Translational Oncology. 19 (4), 409-418 (2017).
- Patel, T. H., et al. European mtDNA variants are associated with differential responses to cisplatin, an anticancer drug: implications for drug resistance and side effects. Frontiers in Oncology. 9, 640 (2019).
