Summary
L'isolamento di microbi resistenti ai metalli pesanti dalle sorgenti geotermiche è un argomento caldo per lo sviluppo di biosistemi di biorisanamento e monitoraggio ambientale. Questo studio fornisce un approccio metodologico per isolare e identificare i batteri tolleranti ai metalli pesanti dalle sorgenti termali.
Abstract
Le sorgenti geotermiche sono ricche di vari ioni metallici a causa dell'interazione tra roccia e acqua che avviene nella falda acquifera profonda. Inoltre, a causa della variazione stagionale del pH e della temperatura, la fluttuazione della composizione degli elementi viene periodicamente osservata all'interno di questi ambienti estremi, influenzando le comunità microbiche ambientali. I microrganismi estremofili che prosperano nelle bocche termiche vulcaniche hanno sviluppato meccanismi di resistenza per gestire diversi ioni metallici presenti nell'ambiente, prendendo così parte a complessi cicli biogeochimici metallici. Inoltre, gli estremofili e i loro prodotti hanno trovato un ampio punto d'appoggio nel mercato, e questo vale soprattutto per i loro enzimi. In questo contesto, la loro caratterizzazione è funzionale allo sviluppo di biosistemi e bioprocessi per il monitoraggio ambientale e il biorisanamento. Ad oggi, l'isolamento e la coltivazione in condizioni di laboratorio di microrganismi estremofili rappresentano ancora un collo di bottiglia per sfruttare appieno il loro potenziale biotecnologico. Questo lavoro descrive un protocollo semplificato per l'isolamento di microrganismi termofili da sorgenti termali e la loro identificazione genotipica e fenotipica attraverso le seguenti fasi: (1) Campionamento di microrganismi da siti geotermici ("Pisciarelli", un'area vulcanica dei Campi Flegrei a Napoli, Italia); (2) Isolamento di microrganismi resistenti ai metalli pesanti; (3) Identificazione di isolati microbici; (4) Caratterizzazione fenotipica degli isolati. Le metodologie descritte in questo lavoro potrebbero essere generalmente applicate anche per l'isolamento di microrganismi provenienti da altri ambienti estremi.
Introduction
Gli ambienti estremi del nostro pianeta sono eccellenti fonti di microrganismi in grado di tollerare condizioni difficili (cioè temperatura, pH, salinità, pressione e metalli pesanti)1,2, essendo Islanda, Italia, STATI UNITI, Nuova Zelanda, Giappone, Africa centrale e India, le aree vulcaniche più riconosciute e studiate 3,4,5,6,7,8,9 . I termofili si sono evoluti in ambienti difficili in un intervallo di temperature da 45 °C a 80 °C 10,11,12. I microrganismi termofili, appartenenti al regno archeale o batterico, sono un serbatoio per lo studio della biodiversità, della filogenesi e della produzione di biomolecole esclusive per applicazioni industriali 13,14,15,16. Infatti, negli ultimi decenni, la continua domanda industriale nel mercato globale ha favorito lo sfruttamento di estremofili e termoenzimi per le loro applicazioni diversificate in diversi campi biotecnologici 17,18,19.
Le sorgenti termali, dove gli organismi vivono in consorzi, sono ricche fonti di biodiversità, rappresentando quindi un habitat attraente per studiare l'ecologia microbica20,21. Inoltre, queste aree vulcaniche ricche di metalli sono comunemente colonizzate da microrganismi che hanno evoluto sistemi di tolleranza per sopravvivere e adattarsi alla presenza di metalli pesanti22,23 e sono quindi attivamente coinvolti nei loro cicli biogeochimici. Al giorno d'oggi, i metalli pesanti sono considerati inquinanti prioritari per l'uomo e l'ambiente. I microrganismi resistenti ai metalli pesanti sono in grado di solubilizzare e precipitare i metalli trasformandoli e rimodellando i loro ecosistemi24,25. La comprensione dei meccanismi molecolari della resistenza ai metalli pesanti è un argomento caldo per l'urgenza di sviluppare nuovi approcci verdi 26,27,28. In questo contesto, la scoperta di nuovi batteri tolleranti rappresenta il punto di partenza per lo sviluppo di nuove strategie per il biorisanamento ambientale24,29. Accompagnando gli sforzi per esplorare gli ambienti idrotermali attraverso procedure microbiologiche e aumentare le conoscenze sul ruolo dei geni alla base della tolleranza ai metalli pesanti, è stato condotto uno screening microbico nell'area termale dei Campi Flegrei in Italia. Questo ambiente ricco di metalli pesanti mostra una potente attività idrotermale, fumarole e piscine bollenti, variabili in pH e temperatura in dipendenza della stagionalità, delle precipitazioni e dei movimenti geologici sotterranei30. In questa prospettiva, descriviamo un modo facile da applicare ed efficace per isolare batteri resistenti ai metalli pesanti, ad esempio, Geobacillus stearothermophilus GF1631 (denominato isolato 1) e Alicyclobacillus mali FL1832 (denominato isolato 2) dalla zona di Pisciarelli dei Campi Flegrei.
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Protocol
1. Campionamento di microrganismi da siti geotermici
- Scegliere il sito per il campionamento utilizzando come criterio i luoghi con la temperatura e il pH desiderati. Misurare i parametri fisici attraverso una sonda termocoppia digitale, inserendola nelle piscine o nei fanghi selezionati.
- Raccogliere 20 g di campioni di terreno (in questo caso, dal fango nel sito idrotermale di Pisciarelli Solfatara), raccogliendoli con un cucchiaio sterilizzato. Prelevare almeno due campioni per ogni sito scelto.
- Mettere i campioni in tubi di polipropilene sterile da 50 ml e chiudere immediatamente.
- Misura pH e temperatura con una sonda termocoppia digitale inserendola direttamente nel sito di campionamento. Dopo l'uso, sciacquare accuratamente la sonda con acqua deionizzata.
2. Isolamento di microrganismi resistenti ai metalli pesanti
NOTA: Eseguire i passaggi 2.1-2.7 sotto un cappuccio biologico sterile.
- Inoculare 2 g di ciascun campione raccolto in 50 ml di terreno Luria-Bertani (LB) appena preparato, in cui il pH è stato regolato a 4 o 7 attraverso l'aggiunta di HCl o NaOH.
- Incubare i campioni alla stessa temperatura del sito di campionamento e a ±5 °C (55 °C e 60 °C per i campioni Pisciarelli) in uno shaker orbitale a temperatura controllata per 24 ore con una velocità di agitazione di 180 giri/min.
- Piastra 200 μL dei campioni coltivati su LB agar (pH 4 o pH 7) e incubare in stato statico per 48 ore a 55 °C o 60 °C.
- Isolare le singole colonie e ripetere i cicli di streak-plating (passaggi 2.3 e 2.4) almeno tre volte.
- Per preparare scorte cellulari congelate a -80 °C, far crescere le colture durante la notte (ON) e aggiungere alle cellule cresciute il 20% di glicerolo (in un volume finale di 1 mL); utilizzare una miscela di acetone e ghiaccio secco per un congelamento rapido.
- Per preparare un inoculo da un ceppo di glicerolo, inoculare 50 μL in 50 mL di LB (pH 4 o pH 6) e incubare a 55 °C o 60 °C nello shaker orbitale a 180 rpm ON.
- Per ottenere un profilo di crescita, diluire una precoltura (ottenuta dallo stadio 2.6) a 0,1 OD600 nm in 10 mL di LB (pH 4 o pH 6), far crescere le cellule a 55 °C o 60 °C per 16 ore nello shaker orbitale e misurare l'OD600 nm a intervalli di 30 minuti.
- Costruisci una curva di crescita dai dati ottenuti nel passaggio 2.7 con tempo (min) sull'asse X e OD600 nm sull'asse Y.
- Realizzare la stessa curva di crescita descritta nei passaggi 2.7 e 2.8 ma variando il pH (± 1 unità) del terreno di coltura (ad esempio, pH 3 e 5 per campioni cresciuti a pH 4) per determinare il pH ottimale per le condizioni di laboratorio.
3. Identificazione degli isolati microbici
- Preparazione del DNA genomico
- Inoculare l'isolato striato dal materiale di glicerolo in 50 mL di terreno LB (pH 4 o pH 6) e crescere in uno shaker orbitale a 55 °C o 60 °C a 180 giri/min ON.
- Raccogliere la coltura ON per centrifugazione per 10 minuti a 5000 x g. Scartare il surnatante.
- Preparare 10 mL di tampone di lisi batterica composto da: 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 2 mM EDTA, 1,2% Triton X-100 e lisozima (20 mg/mL) immediatamente prima dell'uso.
- Risospesare il pellet in 180 μL di tampone di lisi batterica. Incubare per 30 minuti a 37 °C.
- Seguire le linee guida indicate da un kit di purificazione del DNA genomico (Tabella dei materiali) per estrarre il DNA genomico.
- Quantificare il DNA genomico estratto e la sua purezza mediante misurazione UV-Vis. Per la purezza determinare i rapporti-OD 260/280 nm e OD 260/230 nm.
- Valutare l'integrità del DNA genomico caricando 200 ng di ciascun campione su un gel di agarosio allo 0,8% e confrontando la distribuzione dimensionale con un marcatore molecolare ad alto peso.
- Commissione ad un servizio esterno della preparazione, del sequenziamento e dell'analisi comparativa dei frammenti di rRNA 16S della sequenza ottenuta (1000 bp) con quelli presenti nel database nucleotidico del National Center for Biotechnology Information (NCBI)33 degli Stati Uniti.
- Per corroborare i dati del sequenziamento dell'rRNA 16S, eseguire anche la ribotipizzazione automatizzata sul DNA cromosomico digerito (servizio esterno, Tabella dei materiali).
- Nel caso in cui l'identificazione della specie non possa essere determinata solo con i dati di ribotipizzazione, commissionare un'analisi MALDI-TOF MS per l'identificazione degli acidi grassi.
- Per eseguire un'analisi filogenetica del genere identificato, analizzare la sequenza di rRNA 16S dell'isolato con BLASTn34. Le sequenze con identità dal 99% al 97% devono essere utilizzate per costruire un allineamento di sequenze multiple utilizzando CLUSTAL Omega35. Costruisci un albero adiacente usando l'opzione predefinita di ClustalW2 (Simple Phylogeny).
4. Suscettibilità ai metalli pesanti e agli antibiotici
- Inoculare l'isolato da un ceppo di glicerolo (vedere punto 2.5) e coltivarlo in 200 ml di LB nelle condizioni ottimali di pH e temperatura precedentemente determinate.
- Diluire ogni precoltura a 0,1 OD600 nm in 5 mL di terreno LB (al pH appropriato) contenente concentrazioni crescenti di metalli pesanti. Le concentrazioni variano da 0,01-120 mM per i metalli pesanti [As(V), As(III), Cd(II), Co(III), Cr(VI), Cu(II), Hg(II), Ni(II), V(V)] o 0,5-1 mg/mL per gli antibiotici [Ampicillina, Bacitracina, Cloramfenicolo, Ciprofloxacina, Eritromicina, Kanamicina, Streptomicina, Tetraciclina e Vancomicina].
- Eseguire trattamenti con metalli pesanti e antibiotici separatamente. Utilizzare un tubo di polipropilene da 50 mL e far crescere le celle in uno shaker orbitale a temperatura controllata con una velocità di scuotimento di 180 giri / min a 55 ° C o 60 ° C per 16 ore per ogni condizione / trattamento.
- Calcola la concentrazione minima inibitoria (MIC) sia per antibiotici che per metalli pesanti identificando i valori di concentrazione nei tubi in cui non si verifica la crescita microbica, cioè determinando i valori che inibiscono completamente la crescita cellulare dopo 16 ore.
- Verificare che la concentrazione sia inibitoria e non letale per le cellule placcando 200 μL della coltura coltivata al valore che si considera MIC su piastre LB-agar (al pH e alla temperatura appropriati) e verificando la presenza di colonie dopo incubazione ON.
NOTA: Poiché la coltura su piastra di agar LB è praticabile a 4 °C solo per alcune settimane, al fine di conservare gli isolati per un tempo più lungo, le scorte di glicerolo sono state preparate e conservate a -80 °C. Per la determinazione del MIC, sono state effettuate almeno tre repliche indipendenti utilizzando colture indipendenti. La deviazione standard è stata calcolata tra gli esperimenti triplicati.
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Representative Results
Sito di campionamento
Questo protocollo illustra un metodo per l'isolamento di batteri resistenti ai metalli pesanti da una sorgente calda. In questo studio, l'area di Pisciarelli, un ambiente geotermico acido-solfidico, è stata utilizzata come sito di campionamento (Figura 1). Questo ecosistema è caratterizzato dal flusso di fluidi solforosi aggressivi derivati da attività vulcaniche. È stato dimostrato che le comunità microbiche nei sistemi geotermici acido-solfidici sono sottoposte a un'estrema pressione selettiva causata dalla presenza di alte concentrazioni di metalli pesanti. I campioni sono stati raccolti in due diversi periodi dell'anno (aprile e settembre) da 2,21 una pozza di fango marginale rispetto a una pozza di fango gorgogliante. Nella pozza di fango sono state registrate fluttuazioni dei valori di pH (~ pH 6 ad aprile e ~ pH 5 a settembre), mentre la temperatura era di ~ 55 ° C in entrambi i casi. Tuttavia, temperature più elevate sono state registrate anche nella pozza di fango (~ 70 ° C) negli altri anni32.
Isolamento e identificazione
I campioni raccolti sono stati inoculati in mezzo LB e incubati per 24 ore a 55 °C e 60 °C come riportato in precedenza, impostando così le condizioni di laboratorio per la crescita dei campioni cellulari per imitare le condizioni chimico-fisiche ambientali. Per favorire la crescita cellulare, le singole colonie sono state striate sulla piastra e isolate dopo diverse diluizioni (almeno 3) in un mezzo ricco-liquido; i ceppi isolati hanno mostrato la loro temperatura di crescita ottimale a 55 °C e 60 °C (Figura 2) . Per identificare i nuovi isolati, è stata effettuata una preparazione genomica del DNA e il sequenziamento dell'rRNA 16S e l'analisi della spettrometria di massa degli acidi grassi sono stati realizzati come servizio esterno. Come riportato, l'analisi degli acidi grassi è un potente metodo bioanalitico che aiuta nell'identificazione precisa dei batteri quando combinato con altri approcci36. Allineamenti multipli di rRNA 16S sono stati utilizzati per costruire l'albero filogenetico per identificare i parenti più stretti37.
Test di suscettibilità ai metalli pesanti
La coesistenza di molecole tossiche caratterizza gli ambienti solfatici. In particolare, le terme di Pisciarelli sono caratterizzate da alti livelli di CO2, H2S, NH4 in coesistenza con As, Hg, Fe, Be, Ni, Co, Cu30,38. Per questo motivo, è stata eseguita una caratterizzazione fenotipica dei microrganismi isolati in presenza di una concentrazione crescente di metalli pesanti, come riportato nella Tabella 1. È interessante notare che l'isolato 1 ha mostrato una maggiore tolleranza ad As(V) e V(V). L'elevata resistenza sia all'arseniato che al vanadato può essere dovuta alle loro strutture chimiche; infatti, entrambi gli ioni sono simili agli ioni fosfato, suggerendo che V(V) e As(V) potrebbero essere assorbiti dalle cellule attraverso sistemi di trasporto del fosfato. Questi isolati si sono rivelati resistenti anche al Cd(II), sebbene il valore MIC fosse relativamente basso. Questo risultato può essere spiegato dall'assenza di Cd(II) nel pool. Sebbene i due microrganismi siano stati campionati nello stesso sito, hanno mostrato diversi profili di resistenza ai metalli pesanti. Tuttavia, sono stati campionati in periodi diversi, indicando così la variazione dipendente dalla stagione nella concentrazione di metalli pesanti come la principale forza motrice che modella la composizione delle comunità microbiche e la loro resistenza differenziale ai metalli pesanti39. Da questi dati comparativi, è stato dimostrato che l'isolato 1 ha una forte resistenza ad As(V), mentre l'isolato 2 ad As(III). Sono necessarie ulteriori indagini genetiche per svelare i meccanismi di resistenza molecolare e comprendere meglio come i fenotipi sono influenzati dalla pressione selettiva delle sorgenti termali.
Test di resistenza agli antibiotici
I ceppi microbici evoluti in ambienti estremi di solito mostrano resistenza a diversi antibiotici. La correlazione tra la resistenza ai metalli pesanti e gli antibiotici è ben nota40. Per questo motivo, abbiamo testato la resistenza agli antibiotici per entrambi gli isolati (Tabella 2). L'isolato 1 ha mostrato un'elevata sensibilità a tutti gli antibiotici testati, anche quando sono state utilizzate basse concentrazioni. Al contrario, l'isolato 2 è resistente a tutti gli antibiotici testati, ad eccezione del cloramfenicolo e della tetraciclina. È interessante notare che i valori MIC determinati verso ampicillina, eritromicina, kanamicina, streptomicina e vancomicina erano paragonabili a quelli di altri batteri resistenti agli antibiotici e ancora più alti per bacitracina e ciprofloxacina41. Questi dati affascinanti meritano ulteriori indagini; probabilmente, a causa di mutazioni casuali o trasferimento genico orizzontale, il microrganismo ha acquisito una resistenza agli antibiotici, che potrebbe rappresentare un vantaggio selettivo in condizioni ambientali così estreme.
Figura 1. Sito di campionamento: zona solfatarica di Pisciarelli, Campi Flegrei (Napoli, Italia). Il sito di campionamento si trova a 40° 49' 45,3" N - 14° 08' 49,9 E, nell'area geotermica delle fumarole Pisciarelli. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Rappresentazione schematica della procedura sperimentale. I microrganismi vengono campionati nelle sorgenti termali, coltivati in laboratorio, isolati attraverso ripetute striature e placcature e identificati genotipicamente con il sequenziamento dell'rRNA 16S. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Ioni metallici | Isolare 1 | Isolare 2 |
| Come (III) | 1,9 mM | 41 mM |
| Come (V) | 117 metri quadrati | 11 mM |
| Cd (II) | 0,9 mM | 0,8 μM |
| Co (II) | 2 mM | 3 mM |
| Co (III) | 2,75 mM | n.d. |
| Cr (VI) | 0,25 mM | n.d. |
| Cu (II) | 4,1 mM | 0,5 mM |
| Hg (II) | 20 μM | 17 μM |
| Ni (II) | 1,3 mM | 30 mM |
| V (V) | 128 metri quadrati | n.a |
Tabella 1. Valori MIC verso gli ioni di metalli pesanti degli isolati. I MIC sono considerati come i valori minimi di concentrazione che inibiscono completamente la crescita cellulare dopo 16 ore; i valori sono riportati come media di tre esperimenti.
| Antibiotici | Isolare 1 | Isolare 2 |
| Ampicillina | n.d. | 20 μg/mL |
| Bacitracina | n.d. | 700 μg/ml |
| Cloramfenicolo | n.d. | <0,5 μg/mL |
| Ciprofloxacina | n.d. | >1 mg/mL |
| Eritromicina | n.d. | 70 μg/ml |
| Kanamicina | n.d. | 80 μg/mL |
| Streptomicina | n.d. | 70 μg/ml |
| Tetraciclina | n.d. | <0,5 μg/mL |
| Vancomycin | n.d. | 1 μg/mL |
Tabella 2. Valori MIC verso gli antibiotici degli isolati. I MIC sono considerati come le concentrazioni minime che inibiscono completamente la crescita cellulare dopo 16 ore; i valori sono riportati come media di tre esperimenti.
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Discussion
Le sorgenti termali contengono una diversità non sfruttata di microbiomi con capacità metaboliche altrettanto diverse12. Lo sviluppo di strategie per l'isolamento di microrganismi in grado di convertire efficacemente i metalli pesanti in composti meno tossici10 rappresenta un'area di ricerca di crescente interesse a livello mondiale. Questo documento mira a descrivere un approccio semplificato per lo screening e l'isolamento dei microbi con la capacità di resistere alle sostanze chimiche tossiche. Il metodo descritto può essere facilmente modificato per isolare i microbi da diverse fonti ambientali come acqua, cibo, suolo o sedimenti. Tuttavia, ci sono alcune limitazioni in questa tecnica legate alla dipendenza dalla coltura microbica. Pertanto, questa configurazione non sarebbe adatta per isolare i batteri da un ambiente che non è facilmente coltivabile. Un modo per superare questo problema è quello di utilizzare diversi mezzi batterici (ad esempio, mezzi selettivi o strategie di pre-adattamento) e tempi di incubazione più lunghi42.
Tuttavia, si prevede che la maggior parte delle specie di interesse per il biorisanamento crescerà nelle condizioni qui descritte. Questo protocollo presenta alcuni vantaggi rispetto alle tecniche di placcatura tradizionali, considerando che i mezzi di agar selettivi per le sostanze chimiche sono finora sconosciuti. L'uso del MIC per identificare microbi resistenti è una strategia rapida da sfruttare su singoli isolati che apre la strada alla caratterizzazione di nuove specie o nuovi ceppi. Questo studio dimostra l'utilità di un tale metodo per selezionare microrganismi ambientali che possono contribuire a un efficace biorisanamento inattivando gli inquinanti e convertendoli in prodotti innocui.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da ERA-NET Cofund MarTERA: "FLAshMoB: Functional Amyloid Chimera for Marine Biosensing", PRIN 2017-PANACEA CUP:E69E19000530001 e da GoodbyWaste: ObtainGOOD products-exploit BY-products-reduce WASTE, MIUR 2017-JTNK78.006, Italia. Si ringraziano la Dott.ssa Monica Piochi e la Dott.ssa Angela Mormone (Istituto Nazionale di Geofisica e Vulcanologia, Sezione di Napoli Osservatorio Vesuviano, Italia) per l'identificazione e la caratterizzazione del sito geotermico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393 | |
| Aura Mini | bio air s.c.r.l. | Biological hood | |
| Bacitracin | Sigma Aldrich | B0125 | |
| Cadmium chloride | Sigma Aldrich | 202908 | |
| Chloramphenicol | Sigma Aldrich | C0378 | |
| Ciprofloxacin | Sigma Aldrich | 17850 | |
| Cobalt chloride | Sigma Aldrich | C8661 | |
| Copper chloride | Sigma Aldrich | 224332 | |
| Erythromycin | Sigma Aldrich | E5389 | |
| Exernal Service | DSMZ | Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH | |
| Genomic DNA Purification Kit | Thermo Scientific | #K0721 | |
| Kanamycin sulphate | Sigma Aldrich | 60615 | |
| MaxQTM 4000 Benchtop Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE4000 | |
| Mercury chloride | Sigma Aldrich | 215465 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
| Nickel chloride | Sigma Aldrich | 654507 | |
| Orion Star A221 Portable pH Meter | Thermo Scientific | STARA2218 | |
| Sodium (meta) arsenite | Sigma Aldrich | S7400 | |
| Sodium arsenate dibasic heptahydrate | Sigma Aldrich | A6756 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S5886 | |
| Streptomycin | Sigma Aldrich | S6501 | |
| Tetracycline | Sigma Aldrich | 87128 | |
| Tryptone BioChemica | Applichem Panreac | A1553 | |
| Vancomycin | Sigma Aldrich | PHR1732 | |
| Yeast extract for molecular biology | Applichem Panreac | A3732 |
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