Summary
Isoleringen av tungmetallresistenta mikrober från geotermiska källor är ett hett ämne för utvecklingen av bioremediering och miljöövervakning biosystem. Denna studie ger ett metodologiskt tillvägagångssätt för att isolera och identifiera tungmetalltoleranta bakterier från varma källor.
Abstract
Geotermiska fjädrar är rika på olika metalljoner på grund av samspelet mellan sten och vatten som äger rum i den djupa akvifern. Dessutom, på grund av säsongsvariation i pH och temperatur, observeras fluktuationer i elementkompositionen periodiskt inom dessa extrema miljöer, vilket påverkar de miljömässiga mikrobiella samhällena. Extremofila mikroorganismer som trivs i vulkaniska termiska ventiler har utvecklat resistensmekanismer för att hantera flera metalljoner som finns i miljön och därmed delta i komplexa metallbiogeokemiska cykler. Dessutom har extremofiler och deras produkter fått ett omfattande fotfäste på marknaden, och detta gäller särskilt för deras enzymer. I detta sammanhang är deras karakterisering funktionell för utvecklingen av biosystem och bioprocesser för miljöövervakning och bioremediering. Hittills utgör isoleringen och odlingen under laboratorieförhållanden av extremofila mikroorganismer fortfarande en flaskhals för att fullt ut utnyttja deras biotekniska potential. Detta arbete beskriver ett strömlinjeformat protokoll för isolering av termofila mikroorganismer från varma källor samt deras genotypiska och fenotypiska identifiering genom följande steg: (1) Provtagning av mikroorganismer från geotermiska platser ("Pisciarelli", ett vulkaniskt område i Campi Flegrei i Neapel, Italien); (2) Isolering av tungmetallresistenta mikroorganismer. (3) Identifiering av mikrobiella isolat. (4) Fenotypisk karakterisering av isolaten. De metoder som beskrivs i detta arbete kan generellt tillämpas även för isolering av mikroorganismer från andra extrema miljöer.
Introduction
De extrema miljöerna på vår planet är utmärkta källor till mikroorganismer som kan tolerera svåra förhållanden (dvs. temperatur, pH, salthalt, tryck och tungmetaller)1,2, som är Island, Italien, USA, Nya Zeeland, Japan, Centralafrika och Indien, de mest erkända och studerade vulkaniska områdena 3,4,5,6,7,8,9 . Termofiler har utvecklats i tuffa miljöer i ett temperaturintervall från 45 ° C till 80 ° C 10,11,12. Termofila mikroorganismer, som antingen tillhör arkeala eller bakteriella riken, är en reservoar för studier av biologisk mångfald, fylogenes och produktion av exklusiva biomolekyler för industriella tillämpningar 13,14,15,16. Faktum är att under de senaste decennierna har den kontinuerliga industriella efterfrågan på den globala marknaden uppmuntrat utnyttjandet av extremofiler och termozymer för deras diversifierade tillämpningar inom flera biotekniska områden 17,18,19.
Varma källor, där organismer lever i konsortier, är rika källor till biologisk mångfald, vilket representerar en attraktiv livsmiljö för att studera mikrobiell ekologi20,21. Dessutom koloniseras dessa vulkaniska metallrika områden vanligen av mikroorganismer som har utvecklat toleranssystem för att överleva och anpassa sig till närvaron av tungmetaller22,23 och är därför aktivt involverade i sina biogeokemiska cykler. Numera anses tungmetaller vara prioriterade föroreningar för människor och miljö. De tungmetallresistenta mikroorganismerna kan solubilisera och fälla ut metaller genom att omvandla dem och omforma sina ekosystem24,25. Förståelsen av de molekylära mekanismerna för tungmetallresistens är ett hett ämne för brådskan att utveckla nya gröna tillvägagångssätt 26,27,28. I detta sammanhang utgör upptäckten av nya toleranta bakterier utgångspunkten för att utveckla nya strategier för miljöbioremediering24,29. Som ett led i arbetet med att utforska hydrotermiska miljöer genom mikrobiologiska ingrepp och öka kunskapen om genens eller genernas roll som ligger till grund för tungmetalltoleransen genomfördes en mikrobiell screening i det varma källområdet Campi Flegrei i Italien. Denna tungmetallrika miljö visar en kraftfull hydrotermisk aktivitet, fumarol och kokande pooler, varierande i pH och temperatur beroende på säsongsmässighet, nederbörd och underjordiska geologiska rörelser30. I detta perspektiv beskriver vi ett lättanvänt och effektivt sätt att isolera bakterier som är resistenta mot tungmetaller, till exempel Geobacillus stearothermophilus GF1631 (namngiven som isolat 1) och Alicyclobacillus mali FL1832 (namngiven som isolat 2) från Pisciarelli-området i Campi Flegrei.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Provtagning av mikroorganismer från geotermiska platser
- Välj platsen för provtagning med som kriterium platser med önskad temperatur och pH. Mät de fysiska parametrarna genom en digital termoelementsond och sätt in den i de valda poolerna eller lerorna.
- Samla 20 g jordprover (i detta fall från lera på den hydrotermiska platsen Pisciarelli Solfatara) och plocka upp dem med en steriliserad sked. Ta minst två prover för varje vald plats.
- Lägg proverna i 50 ml sterila polypropenrör och stäng omedelbart.
- Mät pH och temperatur med en digital termoelementsond genom att direkt sätta in den i provtagningsstället. Skölj sonden noggrant med avjoniserat vatten efter användning.
2. Isolering av tungmetallresistenta mikroorganismer
OBS: Utför steg 2.1-2.7 under en steril biologisk huva.
- Inokulera 2 g av varje insamlat prov till 50 ml nyberedt Luria-Bertani-medium (LB), i vilket pH har justerats till 4 eller 7 genom tillsats av HCl eller NaOH.
- Inkubera proverna vid samma temperatur på provtagningsstället och vid ±5 °C (55 °C och 60 °C för Pisciarelliprover) i en temperaturkontrollerad omloppsskakare i 24 timmar med en skakningshastighet på 180 rpm.
- Platta 200 μL av de odlade proverna på LB-agar (pH 4 eller pH 7) och inkubera i statiskt tillstånd i 48 timmar vid 55 °C eller 60 °C.
- Isolera enskilda kolonier och upprepa streckpläteringscykler (steg 2.3 och 2.4) minst tre gånger.
- För att bereda -80 °C frysta cellbestånd, odla kulturerna över natten (ON) och tillsätt till de odlade cellerna 20% glycerol (i en slutlig volym av 1 ml); använd en blandning av aceton och torris för snabb frysning.
- För att bereda en ympning från ett glycerollager, inokulera 50 μL i 50 ml LB (pH 4 eller pH 6) och inkubera vid 55 °C eller 60 °C i orbitalskakaren vid 180 rpm ON.
- För att erhålla en tillväxtprofil, späd ut en prekultur (erhållen från steg 2.6) till 0,1 OD600 nm i 10 ml LB (pH 4 eller pH 6), odla cellerna vid 55 °C eller 60 °C i 16 timmar i orbitalskakarn och mät OD600 nm med 30 minuters mellanrum.
- Konstruera en tillväxtkurva från de data som erhållits i steg 2.7 med tiden (min) på X-axeln och OD600 nm på Y-axeln.
- Realisera samma tillväxtkurva som beskrivs i steg 2.7 och 2.8 men variera pH (± 1 enhet) för odlingsmediet (t.ex. pH 3 och 5 för prover odlade vid pH 4) för att bestämma det optimala pH för laboratorieförhållanden.
3. Identifiering av mikrobiella isolat
- Framställning av genomiskt DNA
- Inokulera isolatet som ströks från glycerolstocken i 50 ml LB-medium (pH 4 eller pH 6) och växa i en orbital shaker vid 55 ° C eller 60 ° C vid 180 rpm ON.
- Skörda ON-kulturen genom centrifugering i 10 min vid 5000 x g. Kassera supernatanten.
- Förbered 10 ml bakterielysbuffert sammansatt av: 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 2 mM EDTA, 1,2% Triton X-100 och lysozym (20 mg / ml) omedelbart före användning.
- Resuspend pelletsen i 180 μL bakterielysbuffert. Inkubera i 30 min vid 37 °C.
- Följ riktlinjerna som anges av ett genomiskt DNA-reningssats (Table of Materials) för att extrahera genomiskt DNA.
- Kvantifiera det extraherade genomiska DNA:t och dess renhet genom UV-Vis-mätning. För renhet bestäm förhållandena-OD 260/280 nm och OD 260/230 nm.
- Bedöm integriteten hos det genomiska DNA genom att ladda 200 ng av varje prov på en 0,8% agarosgel och jämföra storleksfördelningen med en molekylär markör med hög vikt.
- Kommissionen till en extern tjänst 16S rRNA-fragmentberedning, sekvensering och jämförande analys av den erhållna sekvensen (1000 bp) med de som finns i nukleotiddatabasen för US National Center for Biotechnology Information (NCBI)33.
- För att bekräfta data om 16S rRNA-sekvensering, utför också automatiserad ribotypning på det smälta kromosomala DNA (extern tjänst, materialtabell).
- Om specieidentifieringen inte kan bestämmas enbart med ribotypningsdata, beställ en MALDI-TOF MS-analys för identifiering av fettsyror.
- För att utföra en fylogenetisk analys av det identifierade släktet, analysera 16S rRNA-sekvensen för isolatet med BLASTn34. Sekvenser med identiteter från 99% till 97% måste användas för att bygga en multipel sekvensjustering med CLUSTAL Omega35. Konstruera ett grannfogningsträd med standardalternativet ClustalW2 (Simple Phylogeny).
4. Tungmetaller och antibiotika mottaglighet
- Inokulera isolatet från ett glycerollager (se steg 2.5) och odla det i 200 ml LB under de optimala pH- och temperaturförhållanden som tidigare bestämts.
- Späd varje prekultur vid 0,1 OD600 nm i 5 ml LB-medium (vid lämpligt pH) innehållande ökande koncentrationer av tungmetaller. Koncentrationerna varierar från 0,01-120 mM för tungmetaller [As(V), As(III), Cd(II), Co(III), Cr(VI), Cu(II), Hg(II), Ni(II), V(V)] eller 0,5-1 mg/ml för antibiotika [Ampicillin, Bacitracin, Kloramfenikol, Ciprofloxacin, Erytromycin, Kanamycin, Streptomycin, Tetracyklin och Vankomycin].
- Utför tungmetall- och antibiotikabehandlingar separat. Använd ett 50 ml polypropenrör och odla cellerna i en temperaturkontrollerad orbital shaker med en skakningshastighet på 180 rpm vid 55 ° C eller 60 ° C i 16 timmar för varje tillstånd / behandling.
- Beräkna minsta hämmande koncentration (MIC) antingen för antibiotika eller tungmetaller genom att identifiera koncentrationsvärdena i rören där mikrobiell tillväxt inte sker, dvs bestämma de värden som helt hämmar celltillväxt efter 16 timmar.
- Kontrollera att koncentrationen är hämmande och inte dödlig för cellerna genom att plätera 200 μL av den odlade odlingen till det värde som betraktas som MIC på LB-agarplattor (vid lämpligt pH och temperatur) och kontrollera förekomsten av kolonier efter ON-inkubation.
OBS: Eftersom odlingen på LB-agarplattan är livskraftig vid 4 °C endast under några veckor, för att bevara isolaten under en längre tid, bereddes glycerollagren och lagrades vid -80 °C. För MIC-bestämning utfördes minst tre oberoende replikat med hjälp av oberoende kulturer. Standardavvikelsen beräknades bland tredubbla experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Provtagningsplats
Detta protokoll illustrerar en metod för isolering av tungmetallresistenta bakterier från en varm källa. I denna studie användes Pisciarelli-området, en syrasulfidisk geotermisk miljö, som provtagningsplats (figur 1). Detta ekosystem kännetecknas av flödet av aggressiva svavelhaltiga vätskor härrörande från vulkaniska aktiviteter. Det har visats att de mikrobiella samhällena i syrasulfidiska geotermiska system utsätts för extremt selektivt tryck som görs av närvaron av höga koncentrationer av tungmetaller. Proverna samlades in under två olika perioder av året (april och september) från 2,21 en lerpool marginell med avseende på en bubblande lerpool. I lerpoolen registrerades fluktuationer i pH-värdena (~ pH 6 i april och ~ pH 5 i september), medan temperaturen var ~ 55 ° C i båda fallen. Men högre temperaturer registrerades också i lerpoolen (~ 70 ° C) under andra år32.
Isolering och identifiering
De insamlade proverna ympades i LB-medium och inkuberades i 24 timmar vid 55 ° C och 60 ° C som rapporterats tidigare, vilket fastställde laboratorieförhållandena för tillväxten av cellproverna för att efterlikna de kemiska-fysiska miljöförhållandena. För att gynna celltillväxt ströks enskilda kolonier på plattan och isolerades efter flera utspädningar (minst 3) i ett rikt flytande medium; De isolerade stammarna visade sin optimala tillväxttemperatur vid 55 °C och 60 °C (figur 2).. För att identifiera de nya isolaten genomfördes en genomisk DNA-beredning och 16S rRNA-sekvensering och fettsyror masspektrometrianalys utfördes som en extern tjänst. Som rapporterats är analysen av fettsyrorna en kraftfull bioanalytisk metod som hjälper till att exakt identifiera bakterier i kombination med andra metoder36. Flera inriktningar av 16S rRNA användes för att bygga det fylogenetiska trädet för att identifiera de närmaste släktingarna37.
Känslighetstest för tungmetall
Samexistensen av giftiga molekyler karakteriserar solfatariska miljöer. I synnerhet kännetecknas varma källor i Pisciarelli av höga nivåer av CO2,H2S,NH4 i samexistens med As, Hg, Fe, Be, Ni, Co, Cu30,38. Av denna anledning utfördes en fenotypisk karakterisering av de isolerade mikroorganismerna i närvaro av en ökande koncentration av tungmetaller, som rapporterats i tabell 1. Intressant nog visade isolat 1 högre tolerans mot As (V) och V (V). Det höga motståndet mot både arsenat och vanadat kan bero på deras kemiska strukturer; i själva verket liknar båda jonerna fosfatjonerna, vilket tyder på att V (V) och As (V) kan tas upp av celler genom fosfattransportsystem. Dessa isolat visade sig också vara resistenta mot Cd (II), även om MIC-värdet var relativt lågt. Detta resultat kan förklaras av frånvaron av Cd (II) i poolen. Även om de två mikroorganismerna provtogs på samma plats visade de olika tungmetallresistensprofiler. De provtogs emellertid under olika perioder, vilket pekar på den säsongsberoende variationen i tungmetallkoncentrationen som den främsta drivkraften som formar sammansättningen av de mikrobiella samhällena och deras differentiella motståndskraft mot tungmetaller39. Från dessa jämförande data har det visats att isolat 1 har ett starkt motstånd mot As (V), medan isolera 2 för As (III). Ytterligare genetiska undersökningar krävs för att reda ut de molekylära resistensmekanismerna och bättre förstå hur fenotyperna påverkas av det selektiva trycket från varma källor.
Tester av antibiotikaresistens
De mikrobiella stammar som utvecklats i extrema miljöer uppvisar vanligtvis resistens mot olika antibiotika. Korrelationen mellan tungmetallresistens och antibiotika är välkänd40. Av denna anledning testade vi resistensen mot antibiotika för båda isolaten (tabell 2). Isolat 1 visade hög känslighet för alla testade antibiotika, även när låga koncentrationer användes. Däremot är isolat 2 resistent mot alla antibiotika som testats, med undantag för kloramfenikol och tetracyklin. Intressant nog var de bestämda MIC-värdena mot ampicillin, erytromycin, kanamycin, streptomycin och vankomycin jämförbara med värdena för andra antibiotikaresistenta bakterier och ännu högre för bacitracin och ciprofloxacin41. Dessa fascinerande data förtjänar ytterligare undersökningar; Förmodligen, på grund av slumpmässiga mutationer eller horisontell genöverföring, har mikroorganismen förvärvat antibiotikaresistens, vilket kan utgöra en selektiv fördel under sådana extrema miljöförhållanden.
Figur 1. Provtagningsplats: solfatariskt område i Pisciarelli, Campi Flegrei (Neapel, Italien). Provtagningsplatsen är belägen vid 40° 49' 45,3" N - 14° 08' 49,9 E, i det geotermiska området Pisciarelli fumarol. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2. Schematisk representation av experimentproceduren. Mikroorganismer provtas i varma källor, odlas i laboratoriet, isoleras genom upprepad streckning och plätering och genotypiskt identifieras vid 16S rRNA-sekvensering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Metalljoner | Isolera 1 | Isolera 2 |
| Som (III) | 1,9 mM | 41 mM |
| Som (V) | 117 mM | 11 mM |
| Cd-skiva (II) | 0,9 mM | 0,8 μM |
| Co (II) | 2 mM | 3 mM |
| Co (III) | 2,75 mM | N.a. |
| Cr (VI) | 0,25 mM | N.a. |
| Cu (II) | 4,1 mM | 0,5 mM |
| Hg (II) | 20 μM | 17 μM |
| Ni (II) | 1,3 mM | 30 mM |
| V (V) | 128 mM | n.a |
Tabell 1. MIC-värden mot tungmetalljoner i isolaten. MIC anses vara de minimala koncentrationsvärdena som helt hämmar celltillväxt efter 16 timmar; värdena rapporteras som genomsnitt av tre experiment.
| Antibiotika | Isolera 1 | Isolera 2 |
| Ampicillin | N.d. | 20 μg/ml |
| Bacitracin | N.d. | 700 μg/ml |
| Kloramfenikol | N.d. | <0,5 μg/ml |
| Ciprofloxacin | N.d. | >1 mg/ml |
| Erytromycin | N.d. | 70 μg/ml |
| Kanamycin | N.d. | 80 μg/ml |
| Streptomycin | N.d. | 70 μg/ml |
| Tetracyklin | N.d. | <0,5 μg/ml |
| Vancomycin | N.d. | 1 μg/ml |
Tabell 2. MIC-värden mot antibiotika i isolaten. MIC anses vara de minimala koncentrationerna som helt hämmar celltillväxten efter 16 timmar; värdena rapporteras som genomsnitt av tre experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Varma källor innehåller en outnyttjad mångfald av mikrobiom med lika olika metaboliska kapaciteter12. Utvecklingen av strategier för isolering av mikroorganismer som effektivt kan omvandla tungmetaller till mindre giftiga föreningar10 utgör ett forskningsområde av växande intresse över hela världen. Detta dokument syftar till att beskriva ett strömlinjeformat tillvägagångssätt för screening och isolering av mikrober med förmågan att motstå giftiga kemikalier. Den beskrivna metoden kan enkelt modifieras för att isolera mikrober från olika miljökällor som vatten, mat, jord eller sediment. Det finns dock vissa begränsningar i denna teknik relaterade till beroendet av mikrobiell odling. Därför skulle denna inställning inte vara lämplig för att isolera bakterier från en miljö som inte är lätt odlingsbar. Ett sätt att lösa detta problem är att använda olika bakteriemedier (dvs. selektiva medier eller föranpassningsstrategier) och längre inkubationstider42.
Majoriteten av de arter som är av intresse för bioremediering förväntas dock växa under de förhållanden som beskrivs häri. Detta protokoll har vissa fördelar jämfört med traditionella pläteringstekniker, med tanke på att selektiva agarmedier för kemikalier hittills är okända. Användningen av MIC för att identifiera resistenta mikrober är en snabb strategi som ska utnyttjas på enskilda isolat som öppnar vägen för karakterisering av nya arter eller nya stammar. Denna studie visar nyttan av en sådan metod för att välja miljömikroorganismer som kan bidra till effektiv bioremediering genom att inaktivera föroreningarna och omvandla dem till ofarliga produkter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ERA-NET Cofund MarTERA: "FLAshMoB: Functional Amyloid Chimera for Marine Biosensing", PRIN 2017-PANACEA CUP:E69E19000530001 och av GoodbyWaste: ObtainGOOD products-exploit BY-products-reduce WASTE, MIUR 2017-JTNK78.006, Italien. Vi tackar Dr. Monica Piochi och Dr. Angela Mormone (Istituto Nazionale di Geofisica e Vulcanologia, Sezione di Napoli Osservatorio Vesuviano, Italien) för identifiering och karakterisering av geotermisk plats.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393 | |
| Aura Mini | bio air s.c.r.l. | Biological hood | |
| Bacitracin | Sigma Aldrich | B0125 | |
| Cadmium chloride | Sigma Aldrich | 202908 | |
| Chloramphenicol | Sigma Aldrich | C0378 | |
| Ciprofloxacin | Sigma Aldrich | 17850 | |
| Cobalt chloride | Sigma Aldrich | C8661 | |
| Copper chloride | Sigma Aldrich | 224332 | |
| Erythromycin | Sigma Aldrich | E5389 | |
| Exernal Service | DSMZ | Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH | |
| Genomic DNA Purification Kit | Thermo Scientific | #K0721 | |
| Kanamycin sulphate | Sigma Aldrich | 60615 | |
| MaxQTM 4000 Benchtop Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE4000 | |
| Mercury chloride | Sigma Aldrich | 215465 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
| Nickel chloride | Sigma Aldrich | 654507 | |
| Orion Star A221 Portable pH Meter | Thermo Scientific | STARA2218 | |
| Sodium (meta) arsenite | Sigma Aldrich | S7400 | |
| Sodium arsenate dibasic heptahydrate | Sigma Aldrich | A6756 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S5886 | |
| Streptomycin | Sigma Aldrich | S6501 | |
| Tetracycline | Sigma Aldrich | 87128 | |
| Tryptone BioChemica | Applichem Panreac | A1553 | |
| Vancomycin | Sigma Aldrich | PHR1732 | |
| Yeast extract for molecular biology | Applichem Panreac | A3732 |
References
- Arora, N. K., Panosyan, H. Extremophiles: applications and roles in environmental sustainability. Environmental Sustainability. 2, 217-218 (2019).
- Gallo, G., Puopolo, R., Carbonaro, M., Maresca, E., Fiorentino, G. Extremophiles, a nifty tool to face environmental pollution: From exploitation of metabolism to genome engineering. International Journal of Environmental Research and Public Health. 18 (10), 5228 (2021).
- Saxena, R., et al. Metagenomic analysis of hot springs in Central India reveals hydrocarbon degrading thermophiles and pathways essential for survival in extreme environments. Frontiers in Microbiology. 7, 2123 (2017).
- Papke, R. T., Ramsing, N. B., Bateson, M. M., Ward, D. M. Geographical isolation in hot spring cyanobacteria. Environmental Microbiology. 5 (8), 650-659 (2003).
- Zitelle, L., Lan Pe, N. I. al The role of photosynthesis and CO2 evasion in travertine formation: a quantitative investigation at an important travertine-depositing hot spring. Journal of the Geological Society. 164, 843-853 (2007).
- Kubo, K., Knittel, K., Amann, R., Fukui, M., Matsuura, K. Sulfur-metabolizing bacterial populations in microbial mats of the Nakabusa hot spring. Japan. Systematic and Applied Microbiology. 34 (4), 293-302 (2011).
- Siljeström, S., Li, X., Brinckerhoff, W., van Amerom, F., Cady, S. L. ExoMars mars organic molecule analyzer (MOMA) laser desorption/ionization mass spectrometry (LDI-MS) analysis of phototrophic communities from a silica-depositing hot spring in Yellowstone national park, USA. Astrobiology. , (2021).
- Aulitto, M., Tom, L. M., Ceja-Navarro, J. A., Simmons, B. A., Singer, S. W. Whole-genome sequence of Brevibacillus borstelensis SDM, isolated from a sorghum-adapted microbial community. Microbiology Resource Announcements. 9 (48), 8-9 (2020).
- Antranikian, G., et al. Diversity of bacteria and archaea from two shallow marine hydrothermal vents from Vulcano Island. Extremophiles. 21 (4), 733-742 (2017).
- Gallo, G., Puopolo, R., Limauro, D., Bartolucci, S., Fiorentino, G. Metal-tolerant thermophiles: from the analysis of resistance mechanisms to their biotechnological exploitation. The Open Biochemistry Journal. 12 (1), 149-160 (2018).
- Aulitto, M., et al. Draft genome sequence of Bacillus coagulans MA-13, a thermophilic lactic acid producer from lignocellulose. Microbiology Resource Announcements. 8 (23), 341-360 (2019).
- Mehta, D., Satyanarayana, T. Diversity of hot environments and thermophilic microbes. Thermophilic Microbes in Environmental and Industrial Biotechnology: Biotechnology of Thermophiles. , Springer. Dordrecht. (2013).
- Fusco, S., et al. The interaction between the F55 virus-encoded transcription regulator and the RadA host recombinase reveals a common strategy in Archaea and Bacteria to sense the UV-induced damage to the host DNA. Biochimica et Biophysica Acta - Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (5), (2020).
- Puopolo, R., et al. Self-assembling thermostable chimeras as new platform for arsenic biosensing. Scientific Reports. 11 (1), (2021).
- Fiorentino, G., Contursi, P., Gallo, G., Bartolucci, S., Limauro, D. A peroxiredoxin of Thermus thermophilus HB27: Biochemical characterization of a new player in the antioxidant defence. International Journal of Biological Macromolecules. 153, 608-615 (2020).
- Fiorentino, G., Del Giudice, I., Bartolucci, S., Durante, L., Martino, L., Del Vecchio, P. Identification and physicochemical characterization of BldR2 from Sulfolobus solfataricus, a novel archaeal member of the MarR transcription factor family. Biochemistry. 50 (31), 6607-6621 (2011).
- Bhattacharya, A., Gupta, A. G. Microbial Extremozymes. Current trends in applicability of thermophiles and thermozymes in bioremediation of environmental pollutants. , Elsevier, Academic Press. 161-176 (2022).
- Aulitto, M., et al. Prebiotic properties of Bacillus coagulans MA-13: Production of galactoside hydrolyzing enzymes and characterization of the transglycosylation properties of a GH42 β-galactosidase. Microbial Cell Factories. 20 (1), 1-18 (2021).
- Ing, N., et al. A multiplexed nanostructure-initiator mass spectrometry (NIMS) assay for simultaneously detecting glycosyl hydrolase and lignin modifying enzyme activities. Scientific Reports. 11 (1), 11803 (2021).
- Saw, J. H. W. Characterizing the uncultivated microbial minority: towards understanding the roles of the rare biosphere in microbial communities. mSystems. 6 (4), 0077321 (2021).
- He, Q., et al. Temperature and microbial interactions drive the deterministic assembly processes in sediments of hot springs. Science of the Total Environment. 772, 145465 (2021).
- Shakhatreh, M. A. K., et al. Microbiological analysis, antimicrobial activity, and heavy-metals content of Jordanian Ma'in hot-springs water. Journal of Infection and Public Health. 10 (6), 789-793 (2017).
- Antonucci, I., et al. An ArsR/SmtB family member regulates arsenic resistance genes unusually arranged in Thermus thermophilus HB27. Microbial Biotechnology. 10 (6), 1690-1701 (2017).
- Ozdemir, S., Kılınç, E., Poli, A., Nicolaus, B. Biosorption of Heavy Metals (Cd 2+, Cu 2+ , Co 2+ , and Mn 2+ ) by Thermophilic Bacteria, Geobacillus thermantarcticus and Anoxybacillus amylolyticus Equilibrium and Kinetic Studies. Bioremediation Journal. 17 (2), 86-96 (2013).
- Hlihor, R. -M., Apostol, L. -C., Gavrilescu, M. Environmental bioremediation by biosorption and bioaccumulation: Principles and applications. Enhancing Cleanup of Environmental Pollutants: Volume 1: Biological Approaches. , Springer. Cham. 289-315 (2017).
- Del Giudice, I., Limauro, D., Pedone, E., Bartolucci, S., Fiorentino, G. A novel arsenate reductase from the bacterium Thermus thermophilus HB27: its role in arsenic detoxification. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics. 1834 (10), 2071-2079 (2013).
- Politi, J., Spadavecchia, J., Fiorentino, G., Antonucci, I., Casale, S., De Stefano, L. Interaction of Thermus thermophilus ArsC enzyme and gold nanoparticles naked-eye assays speciation between As(III) and As(V). Nanotechnology. 26 (43), 435703 (2015).
- Antonucci, I., et al. Characterization of a promiscuous cadmium and arsenic resistance mechanism in Thermus thermophilus HB27 and potential application of a novel bioreporter system. Microbial Cell Factories. 17 (1), (2018).
- Ilyas, S., Lee, J. C., Kim, B. S. Bioremoval of heavy metals from recycling industry electronic waste by a consortium of moderate thermophiles: Process development and optimization. Journal of Cleaner Production. 70, 194-202 (2014).
- Piochi, M., Mormone, A., Strauss, H., Balassone, G. The acid-sulfate zone and the mineral alteration styles of the Roman Puteolis (Neapolitan area, Italy): clues on fluid fracturing progression at the Campi Flegrei volcano. Solid Earth. 10 (6), 1809-1831 (2019).
- Puopolo, R., et al. Identification of a new heavy-metal-resistant strain of Geobacillus stearothermophilus isolated from a hydrothermally active volcanic area in southern Italy. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (8), 2678 (2020).
- Aulitto, M., et al. Genomic insight of Alicyclobacillus mali FL18 isolated from an Arsenic-rich hot spring. Frontiers in Microbiology. 12, 639697 (2021).
- Agarwala, R., et al. Database resources of the National Center for Biotechnology Information. Nucleic Acids Research. 46, 8-13 (2018).
- Altschul, S. F., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research. 25 (17), 3389-3402 (1997).
- Sievers, F., Higgins, D. G.
- Kliem, M., Sauer, S. The essence on mass spectrometry based microbial diagnostics. Current Opinion in Microbiology. 15 (3), 397-402 (2012).
- Madeira, F., et al. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Research. 47, 636-641 (2019).
- Piochi, M., Mormone, A., Balassone, G., Strauss, H., Troise, C., De Natale, G. Native sulfur, sulfates and sulfides from the active Campi Flegrei volcano (southern Italy): Genetic environments and degassing dynamics revealed by. Journal of Volcanology and Geothermal Research. 301, 180-193 (2015).
- Hsu, H. -C., et al. Assessment of temporal effects of a mud volcanic eruption on the bacterial community and their predicted metabolic functions in the mud volcanic sites of Niaosong, Southern Taiwan. Nicroorganisms. 9 (11), 2315 (2021).
- Ye, J., Rensing, C., Su, J., Zhu, Y. G. From chemical mixtures to antibiotic resistance. Journal of Environmental Sciences (China). 62, 138-144 (2017).
- Farias, P., et al. Natural hot spots for gain of multiple resistances: arsenic and antibiotic resistances in heterotrophic, aerobic bacteria from marine hydrothermal vent fields. Applied and Environmental Microbiology. 81 (7), 2534-2543 (2015).
- Aulitto, M., Fusco, S., Nickel, D. B., Bartolucci, S., Contursi, P., Franzén, C. J. Seed culture pre-adaptation of Bacillus coagulans MA-13 improves lactic acid production in simultaneous saccharification and fermentation. Biotechnology for Biofuels. 12 (1), 45 (2019).
