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Artigo de método

Isolamento e Análise Funcional do Endotélio Arteriolar do Cérebro do Rato Parenchyma

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DOI:

10.3791/63463

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11 de março de 2022

 ,  , 
1Department of Basic Sciences, Loma Linda University, 2Departments of Physiology, Surgery and Neurosurgery and Sarver Heart Center, University of Arizona College of Medicine Tucson

Neste artigo

Resumo

A preparação intensiva de "tubos" endoteliais cerebrais intactos de arteriolas parenchímicas cerebrais é ilustrada para o estudo da regulação do fluxo sanguíneo cerebral. Além disso, demonstramos os pontos fortes experimentais deste modelo de estudo endotelial para a medição de imagens de fluorescência e eletrofisiologia das principais vias de sinalização celular, incluindo alterações no potencial intracelular [Ca2+] e membrana.

Resumo

O fluxo sanguíneo cerebral é transmitido por artérias de resistência vascular e artérias parenchímicas a jusante. A resistência vascular de estado estável ao fluxo sanguíneo aumenta com a diminuição do diâmetro das artérias para as artérias que, em última análise, alimentam-se de capilares. Devido ao seu menor tamanho e localização no parenchyma, as artérias têm sido relativamente subestudadas e com menos reprodutibilidade em achados do que artérias piais superficiais. Independentemente disso, a estrutura e função celular endotelial arteriolar — integrante da fisiologia e etiologia de doenças crônicas degenerativas — requer uma ampla investigação. Em particular, evidências emergentes demonstram que a função endotelial comprometida precede e exacerba o comprometimento cognitivo e a demência.

Na microcirculação parênquima, a função do canal K+ endotelial é o estímulo mais robusto para controlar finamente a propagação da vasodilatação para promover o aumento do fluxo sanguíneo para áreas de atividade neuronal. Este artigo ilustra um método refinado para isolar os "tubos" endoteliais recém-isolados e eletricamente acoplados (diâmetro, ~25 μm) de artérias parenchímicas cerebrais do rato. Os tubos endoteliais arteriolares são fixados durante condições fisiológicas (37 °C, pH 7.4) para resolver variáveis experimentais que englobam a função do canal K+ e sua regulação, incluindo dinâmica intracelular Ca2+ , alterações no potencial da membrana e regulação lipídica da membrana. Uma vantagem técnica distinta versus endotélio arterial é a maior resolução morfológica das dimensões celular e organela (por exemplo, mitocôndrias), que expande a utilidade dessa técnica. Perfusão cerebral saudável ao longo da vida implica uma função endotelial robusta em artérias parenchímicas, ligando diretamente o fluxo sanguíneo ao abastecimento da atividade neuronal e gliana em regiões anatômicas precisas do cérebro. Assim, espera-se que este método avance significativamente o conhecimento geral da fisiologia vascular e da neurociência em relação ao cérebro saudável e doente.

Introdução

As artérias parenchímicas fornecem diretamente oxigênio e nutrientes essenciais em todo o cérebro1. Ao interagir com capilares, arteriolas altamente vasoativas respondem à sinalização retrógrada iniciada por canais de íons capilares que sentem sinais metabólicos de regiões neuronais específicas2. Com o parênquim cerebral tendo recebido historicamente a maior parte da investigação, um papel para a disfunção endotelial surgiu agora para esclarecer mecanismos patológicos associados a vários distúrbios cerebrovasculares que sustentam a demência (por exemplo, derrame isquêmico, doença de Alzheimer)3,4,5,6 . O endotélio é essencial para a perfusão do cérebro de acordo com a heterogeneidade da genética, estrutura e função em todos os segmentos vasculares7. As artérias piais têm sido extensivamente estudadas devido ao seu tamanho relativamente grande, alta resistência vascular segmental e papel na distribuição do fluxo sanguíneo para o cerebrum 8,9 subjacente. Assim, uma melhor compreensão dos mecanismos endoteliais arteriolares provavelmente aumentará a compreensão da regulação do fluxo sanguíneo cerebral na saúde e na doença para o desenvolvimento de novos regimes terapêuticos.

Evidências emergentes destacam a importância de estudar arteriolos parenchímicos em relação a diferentes vias de sinalização e doenças 8,10. No entanto, esta abordagem limitou-se ao uso de artéria pressurizada intacta11 e/ou preparações de arteriola capilar-parenchymal (CaPA)12. Células endoteliais arteriolares recém-isoladas e nativas desprovidas de outros tipos de células e fatores de confusão não foram examinadas, provavelmente devido a dificuldades técnicas em seu isolamento. Este artigo avança uma técnica anterior destacando o isolamento do endotélio arterial pial13 para agora isolar de forma confiável e reprodutivelmente o endotélio das artérias parenchímicas cerebrais (largura: ~25 μm, comprimento: ~250 μm). Esta técnica ajuda a alcançar a resolução ideal de células eletricamente e quimicamente acoplada em sua orientação individual e redes celulares.

Os principais caminhos de interesse incluíram a interação da sinalização intracelular Ca2+ ([Ca2+]i) e a hiperpolarização do potencial da membrana (Vm)14,15 — integral à vasodilatação16 — para permitir que o sangue entre nos capilares e entregue oxigênio e nutrientes ao parenchymaativo 17. Essas preparações permitem gravações eletrofisiológicas em tempo real de canais de íons, incluindo ca2+permeant, potencial de receptor transitório (TRP) e K+ e/ou imagens fluorescentes de organelas intracelulares dentro de tubos de células endoteliais em condições quase fisiológicas. Esta é uma técnica adequada para pesquisadores interessados em mecanismos celulares fisiológicos que regem o controle celular endotelial da entrega do fluxo sanguíneo cerebral para o parenchyma cerebral. Ao todo, essa técnica ajudará os pesquisadores a entender melhor as vias de sinalização endotelial fundamental e a comunicação em rede de arterioles incorporados no parenchyma cerebral, ao mesmo tempo em que aborda questões relacionadas à fisiologia e patologia cerebrovasculares.

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Protocolo

Os experimentadores devem garantir que o uso designado de animais e protocolos associados sejam aprovados por seu Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) e realizados de acordo com o "Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório" (8ª Edição, 2011) e as diretrizes do ARRIVE. O IACUC da Universidade de Loma Linda e da Universidade do Arizona aprovou todos os protocolos utilizados para este manuscrito para camundongos C57BL/6N e 3xTg-AD (machos e fêmeas; faixa etária: 2-30 meses). Veja a Figura 1 como uma visão geral do isolamento e exame de tubos endoteliais arteriolares recém-isolados das artérias pareremínmicas do cérebro.

1. Materiais e equipamentos

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para todos os reagentes e materiais necessários para este protocolo. Além disso, manuais e sites associados aos respectivos fornecedores também podem ser consultados conforme necessário. Ilustrações de estações de dissecção e aparelhos experimentais foram previamente fornecidas13.

  1. Câmara de fluxo
    1. Aperte uma câmara de superfusão com uma tampa de vidro em uma plataforma composta de alumínio anodizado. Proteja a plataforma com a câmara em um estágio de microscópio de alumínio.
    2. Coloque um micromanípulo segurando uma pipeta de fixação em cada extremidade da plataforma no estágio do microscópio de alumínio.
      NOTA: Se necessário, use um aparelho de estágio transferível com uma unidade de câmara de fluxo para mover um tubo endotelial seguro e isolado de um aparelho de microscópio para outro para experimentação.
  2. Microscópios
    1. Use estereóscópios (faixa de ampliação de 5x a 50x) e fontes de luz de fibra óptica para procedimentos de dissecção.
    2. Para o isolamento dos tubos endoteliais, utilize uma plataforma de microscópio invertida equipada com objetivos compatíveis com contraste de contraste ou interferência diferencial (DIC) e um estágio de alumínio.
    3. Tenha um controlador de bomba de microsiringe pronto ao lado do aparelho dedicado a isolar tubos endoteliais de vasos sanguíneos parcialmente digeridos.
    4. Configure o aparelho experimental organizando um microscópio invertido (objetivos: 4x, 10x, 20x, 40x e 60x) e um estágio manual de alumínio em uma mesa de isolamento de vibração.
  3. Equipamento de gravação Vm intracelular
    1. Conecte o eletrometro a um headstage compatível. Use acessórios, como um gerador de função e estimulador, para protocolos que requerem injeção atual.
    2. Conecte as saídas do amplificador a um sistema de digitalização de dados, osciloscópio e monitores de linha de base audíveis. Fixar o eletrodo de banho de referência (pellet Ag/AgCl) perto da saída da câmara de fluxo.
    3. Monte um sistema fotométrico com componentes integrados de uma interface do sistema de fluorescência, lâmpada de arco de alta intensidade e fonte de alimentação, hiperswitch, tubo fotomultiplier (ou PMT) e câmera para medir [Ca2+]i em células endoteliais.
    4. Monte um controlador de temperatura equipado com um aquecedor inline para elevar e manter uma temperatura fisiológica (37 °C) durante todo o experimento.
    5. Monte uma plataforma multicanal conectada a um controlador de válvula com uma válvula de controle de fluxo em linha para controlar a entrega de soluções para tubos endoteliais fixados na câmara.
  4. Micropipettos e eletrodos afiados
    NOTA: O experimentador precisará de um puxador eletrônico de vidro e um microforge para preparar a trituração e fixação de pipetas.
    1. Para separar o tubo endotelial do segmento arteriolar parcialmente digerido, prepare as pipetas de trituração polidas a calor (diâmetro da ponta interna: 30-50 μm) dos capilares de vidro borossilicato.
    2. Para fixar o tubo endotelial na câmara de superfusão, prepare as pipetas de fixação polidas a calor com uma extremidade esférica e sem cortes (diâmetro externo: 50-70 μm) preparadas a partir de capilares de vidro borossilicato de parede fina.
    3. Para gravar Vm de uma célula endotelial, prepare eletrodos afiados com uma resistência de ponta de ~150 ± 30 MΩ de capilares de vidro usando apenas o puxador de vidro.

2. Soluções e drogas

  1. Solução fisiológica de sal (PSS)
    1. Prepare um mínimo de 1 L de PSS usando 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM N-2-hidroxitilpiperazine-N'-2-ácido estilesulfônico (HEPES) e 10 mM de glicose.
    2. Prepare as soluções necessárias que carecem de CaCl2 (zero Ca2+ PSS) para dissecção de arterioles cerebrais e isolamento do tubo endotelial.
      NOTA: Prepare todas as soluções em H2O desionizado ultrapure, seguido de filtragem (0,22 μm). Certifique-se de que o produto final contenha um pH 7.4 com osmolalidade entre 290 e 300 mOsm.
  2. Albumina de soro bovino (BSA, 10%)
    1. Dissolva 1 g do pó BSA liofilizado em um béquer de 10 mL de zero Ca2+ PSS. Cubra o béquer e deixe pelo menos 2h com agitação lenta para que o BSA se dissolva.
    2. Solução de filtro usando uma seringa de 10 mL mais um filtro de 0,22 μm e prepare alíquotas de 1 mL a serem armazenadas a -20 °C.
  3. Solução de dissecção
    1. Adicione 500 μL de BSA (10%) a 49,5 mL de zero Ca2+ PSS para um volume total de 50 mL.
    2. Transferir solução para uma placa de Petri para dissecções arteriolares.
  4. Solução de dissociação
    1. Adicione 5 μL de solução CaCl2 (1 M) e 500 μL de BSA (10%) a 49,5 mL de zero Ca2+ PSS para um volume total de 50 mL. Incubar a solução em temperatura ambiente por pelo menos 1 h.
  5. Enzimas
    1. Prepare 1 mL de solução de digestão com 100 μg/mL papain, 170 μg/mL dithioerythritritol, 250 μg/mL collagenase (mistura tipo H) e 40 μg/mL elastase.
      NOTA: As atividades enzimáticas podem variar, embora os protocolos bem-sucedidos provavelmente exijam as seguintes atividades enzimáticas: ≥ 10 unidades/mg para papain, ≥ 1 unidade/mg para colagem e ≥ 5 unidades/mg para elastase.
  6. Fura-2 e agentes farmacológicos
    1. Prepare o estoque fura-2 AM em sulfóxido de dimetila (DMSO; 1 mM). Prepare 500 μL de concentração de trabalho (10 μM) adicionando 5 μL do estoque a 495 μL de PSS para carregamento.
    2. Prepare pelo menos 50 mL de concentrações de trabalho de agentes farmacológicos em PSS ou DMSO conforme apropriado.
  7. Solução de condução
    1. Prepare 2 M KCl dissolvendo KCl em H2O desionizado (7.455 g de KCl em 50 mL de H2O). Passe a solução através de uma seringa com um filtro de 0,22 μm antes de encher de trás os eletrodos afiados.
  8. Rastreadores de organela fluorescentes e anticorpos
    1. Prepare rastreadores de membrana plasmática ou organellar (por exemplo, núcleo, rcíteo endoplasmático) na solução salina fisiológica apropriada de acordo com as instruções do fabricante.
    2. Prepare anticorpos primários e secundários de acordo com as instruções do fabricante na solução de sal fisiológico apropriada.

3. Dissecção e isolamento de arteriolas cerebrais do rato

NOTA: Os esteremoscópios e as ferramentas de microdissecção afiadas (por exemplo, fórceps de ponta fina, tesoura de dissecção estilo Vannas) devem ser usados para ampliação de amostras (até 50x) em todos esses procedimentos de dissecção.

  1. Isolamento do cérebro do rato
    1. Anestesia um rato de laboratório padrão (por exemplo, C57BL/6, 3xTg-AD; 2-30 meses de idade, homem ou mulher) usando inalação de isoflurano (3% para 2-3 min), seguido de decapitação imediata usando tesoura afiada ou guilhotina por aprovação do IACUC. Coloque a cabeça do mouse em uma placa de Petri (diâmetro de 10 cm, profundidade de 1,5 cm) contendo solução de dissecção fria (4 °C).
    2. Ao visualizar sob um estereomicroscope, remova a pele e o cabelo sobre o crânio e lave o sangue excessivo com solução de dissecção fria. Utilizando as pontas da tesoura de dissecção padrão (por exemplo, lâminas de 24 mm), faça uma incisão começando pelo osso occipital e estendendo-se através do osso nasal do crânio. Use fórceps de ponta grosseira para abrir cuidadosamente o crânio ao longo da incisão, e tecido conjuntivo separado (membrana meningeal) para isolar o cérebro contendo um Círculo intacto de Willis.
    3. Lave o cérebro isolado com solução de dissecção fria em uma placa de béquer ou Petri para remover o sangue restante da superfície do cérebro. Coloque o lado ventral do cérebro voltado para cima em uma câmara contendo solução de dissecção a frio para isolamento de artérias parenchímicas (Figura 2A).
  2. Isolamento de arterioles parenchímicas
    NOTA: As artérias arterioles decorrentes das artérias cerebrais médias (MCAs) e embutidas no parenchyma cerebral são escolhidas para este protocolo. As artérias estão isoladas como descrito anteriormente11, com modificação.
    1. Use pinos de aço (diâmetro: 0,2 mm, comprimento: 11 a 12 mm) para fixar o cérebro isolado em solução de dissecção a frio em uma placa de Petri contendo um revestimento de polímero de silício infundido por carvão (profundidade ≥ 50 cm).
    2. Usando uma tesoura de dissecção afiada e alinhada, corte um retângulo do tecido cerebral (comprimento: 5 mm, largura: 3 mm) (Figura 2B) ao redor da MCA, garantindo que a parte superior do segmento tecidual passe do ponto de ramificação do Círculo de Willis. Corte outro retângulo de tecido cerebral do outro hemisfério do cérebro para acessar mais arterioles, se necessário.
    3. Fixar o segmento de tecido cerebral separado no prato com o MCA voltado para cima (distal do Círculo de Willis) usando pinos de aço (diâmetro: 0,1 mm, comprimento: 13 a 14 mm). Faça cuidadosamente uma incisão rasa perto dos pinos para remover a pia com pequenas fórceps, descascando suavemente de uma extremidade em direção à outra (Figura 2C). Remova a pia do outro segmento de tecido para acessar mais artérias, se necessário. Segure cuidadosamente a pia isolada com artérias parenchímicas ramificadas da MCA no prato com os pinos, e disseque as artérias parenchímicas (Figura 2D), garantindo que as artérias não sejam danificadas.
      NOTA: Se as artérias não forem facilmente retiradas com a pia do parenchyma, use fórceps finos e cavem no cérebro, começando no ponto de ramificação da MCA do Círculo de Willis. Localize a arteriola, solte cuidadosamente o tecido ao redor das artérias (Figura 2E), e puxe suavemente a arteriola para fora do parenchyma, segurando a extremidade superior da artéria (Figura 2F). Múltiplas artérias (comprimento: ~1,5-2 mm) podem ser isoladas de um retângulo de tecido cerebral.
    4. Certifique-se de que a arteriola está limpa sem tecido preso a ela e corte todos os ramos distais restantes (Figura 3A). Use esta arteriola limpa e intacta para digestão enzimática. Alternativamente, corte cada arteriola em dois pedaços (comprimento: 0,75-1 mm) para digestão enzimática para a preparação de tubos endoteliais, se desejar.

4. Digestão de artérias parenchímicas e preparação de tubos endoteliais

  1. Arranjo de equipamentos e pipetas
    NOTA: O isolamento dos tubos endoteliais arterials do cérebro foi descrito anteriormente 13,18. O protocolo atual incorpora modificações para o isolamento do endotélio das artérias parenchymal (intracerebral). Múltiplas artérias ou/e pedaços de arteriolas podem ser usados juntos para digestão enzimática.
    1. Monte o aparelho de trituração13 para preparar tubos endoteliais usando um estágio de alumínio que suporta uma câmara e micromanipuladores. Monte um microscópio equipado com objetivos (5x-60x) e uma câmera conectada a um monitor de computador. Fixar uma microsiringe com um controlador de bomba ao lado do estágio e espécime.
    2. Fixar uma pipeta de trituração com óleo mineral sobre o pistão de microsiringe. Use o microsinge com o controlador da bomba para retirar a solução de dissociação na pipeta de trituração (~130 nL) em cima do óleo mineral, enquanto toma cuidado para evitar bolhas de ar na pipeta.
  2. Digestão parcial dos segmentos arteriolares
    1. Coloque segmentos arteriolares intactos em 1 mL de solução de dissociação em um tubo de vidro de 10 mL contendo 100 μg/mL papain, 170 μg/mL dithioerythritol, 250 μg/mL collagenase e 40 μg/mL elastase. Incubar segmentos arteriolares a 34 °C por 10-12 min.
    2. Após a digestão, substitua a solução enzimática por 3-4 mL de solução de dissociação fresca à temperatura ambiente.
  3. Isolamento do tubo endotelial arteriolar
    NOTA: Após a digestão e substituição da solução enzimática, transfira um ou múltiplos segmentos parcialmente digeridos para a solução de dissociação em uma câmara de superfusão anexada a uma plataforma móvel. Enquanto estiver visualizando a ampliação de 100x a 200x, selecione um segmento de vaso parcialmente digerido, mas ininterrupto, e concentre-se nele sob o microscópio.
    1. Coloque a pipeta de trituração presa com o injetor de microsinge na solução de dissociação na câmara e posicione-a perto de uma extremidade do segmento de vaso digerido. Defina uma taxa dentro da faixa de 1-3 nL/s no controlador da bomba para trituração suave.
    2. Mantendo a ampliação de 100x a 200x, retire o segmento arteriolar na pipeta e, em seguida, ejete para dissociar a adventitia e as células musculares lisas (Figura 3B). Triturar o segmento do vaso até que todas as células musculares lisas sejam dissociadas, e apenas as células endoteliais permanecem como um "tubo" intacto.
      NOTA: Se necessário durante a trituração, utilize cuidadosamente fórceps finos para remover a adventitia dissociada e a lâmina elástica interna do tubo endotelial. Normalmente, apenas alguns ciclos de trituração produzem um tubo endotelial intacto.
    3. Use micromanipuladores para fixar cada extremidade do tubo endotelial na tampa de vidro na câmara com pipetas de fixação de vidro borossilicato (Figura 3C,D).
  4. Protegendo o tubo endotelial arteriolar
    1. Substitua a solução de dissociação por solução de superfusão (PSS contendo 2 mM CaCl2) ao mesmo tempo em que garante que o material não tertelial seja lavado da câmara.
    2. Transfira o tubo endotelial seguro na plataforma móvel para a plataforma de microscópio projetada para superfusão contínua e gravações/imagens intracelulares ou fluorescentes.
    3. Aplique a entrega contínua de PSS durante o experimento. Defina manualmente a taxa de fluxo (5-7 mL/min) durante todo o experimento usando a válvula de controle de fluxo inline, consistente com o fluxo laminar, ao mesmo tempo em que corresponde ao fluxo da solução à extensão da sucção do vácuo. Permita ≥5 minutos de fluxo de PSS para a câmara para superfusão do tubo endotelial antes de adquirir dados de fundo e/ou carregamento de corante.

5. Utilização de tubos endoteliais arteriolares para o exame da fisiologia celular

NOTA: Tubos endoteliais arteriolares isolados e fixados podem ser usados para gravações intracelulares de [Ca2+]i dynamics e Vm utilizando fotometria e eletrofisiologia de eletrodos afiados, respectivamente, como ilustrado anteriormente13 (Figura 4). [Ca2+] i e Vm podem ser medidos como variáveis experimentais separadas ou combinadas conforme necessário13 (Figura 4). No entanto, os tubos endoteliais arteriolares são mais delicados que o endotélio arterial, e o tempo de experimentação não deve exceder 1h.

  1. Medição de [Ca2+]i
    1. Ligue o equipamento e o software para gravações [Ca2+]i enquanto mantém a superfusão contínua a uma taxa de fluxo de 5-7 mL/min.
    2. Carregue o tubo endotelial com o corante Ca2+ Fura-2 AM por 30 min a temperatura ambiente. Lave as células com solução de superfusão por mais 20-30 minutos enquanto aumenta gradualmente a temperatura do banho para 37 °C. Mantenha a temperatura a 37 °C durante todo o experimento.
    3. Ajuste manualmente a janela de imagem usando o software de fotometria para se concentrar em ~20 células endoteliais (Figura 4A). Na ausência de luz, gire o PMT na interface da fluorescência e comece a aquisição de [Ca2+]i por excitar Fura-2 alternadamente (≥10 Hz) a 340 nm e 380 nm enquanto coleta emissão de fluorescência a 510 nm. Uma vez estabelecida uma gravação de linha de base estável de [Ca2+]i , aplique agentes farmacológicos (por exemplo, agonistas receptores purinérgicos) por objetivo experimental (Figura 4B).
  2. Medição de Vm
    1. Ligue o equipamento e o software para gravaçõesV m e defina a taxa de aquisição de dados (≥10 Hz) mantendo a superfusão contínua a uma taxa de fluxo de 5-7 mL/min. Aumente gradualmente a temperatura do banho para 37 °C e mantenha-a até o final do experimento.
    2. Puxe um eletrodo afiado usando um capilar de vidro borossilicato, enchimento traseiro com 2 M KCl, e fixe-o sobre um fio de prata revestido com cloreto no porta-pipetas preso a um eletrometro, que por sua vez, é mantido por um micromanipulador.
    3. Ao visualizar através do objetivo 4x, use um micromanipulador para posicionar cuidadosamente a ponta de eletrodo afiado logo acima de uma célula do tubo endotelial arteriolar no PSS fluindo na câmara.
    4. Aumente gradualmente a ampliação para 400x e reposicione a ponta do eletrodo conforme necessário.
    5. Usando o micromanipulador, insira suavemente a ponta de um eletrodo afiado em uma das células do tubo endotelial e comece a gravar Vm usando um eletrometro (Figura 4A).
    6. Uma vez que o repouso endotelial Vm esteja estável (-30 a −40 mV), aplique os agentes farmacológicos desejados por objetivo experimental (Figura 4C).

6. Imagem celular

NOTA: Tubos endoteliais fixados na câmara da plataforma móvel também podem ser usados para imagens microscópicas em condições vivas e fixas19 usando fluorescência padrão ou microscopia confocal. A imunohistoquímica com diferentes anticorpos para receptores e canais de íons também pode ser aplicada como descrito anteriormente20.

  1. Carregue o tubo endotelial com o rastreador de fluorescência para a membrana plasmática ou organela desejada (por exemplo, núcleo, ritúlume endoplasmático) a 37 °C por 15-30 min.
  2. Lave as células com PSS de superfusão fresca e células vivas de imagem sob o microscópio no comprimento de onda de excitação de seus respectivos corantes (Figura 4D,E).
    NOTA: A imunohistoquímica pode ser realizada neste modelo de tubo usando anticorpos de interesse.

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Resultados

Uma demonstração do protocolo é mostrada na Figura 1 com dissecção arteriolar e etapas de isolamento do tubo endotelial como Figura 2 e Figura 3, respectivamente. Aqui, a função endotelial foi avaliada pela medição [Ca2+]i e Vm utilizando fotometria Fura-2 e eletrofisiologia eletrodo afiada (Figura 4A) em resposta a um agente farmacológico [2-metilthioadenosine diphospha...

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Discussão

Evidências crescentes sugerem que a doença cerebrovascular (DCV), o envelhecimento e a doença de Alzheimer estão fortemente correlacionados e são um tópico atual de pesquisa de demência 4,8,14,21. Assim, é óbvio que estudos da rede cerebrovascular teriam um amplo impacto na saúde, ao mesmo tempo em que requerem uma investigação extensiva contínua durante as condições da doença. Como ponto signi...

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Divulgações

Os autores não declaram conflitos de interesse.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi apoiada por subvenções dos Institutos Nacionais de Saúde (R00AG047198 & R56AG062169 para o EJB; R00HL140106 para PWP) e a Associação de Alzheimer (AZRGD-21-805835 para PWP). O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde ou da Associação de Alzheimer.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
AmplificadoresMolecular Devices, Sunnyvale, CA, EUAAxoclamp 2B & Monitores de linha de base audíveis Axoclamp 900A
Ampol US LLC, Sarasota, FL, EUA  Resfriador de banho BM-A-TM
(Isotemp 500LCU)ThermoFisher Scientific13874647
capilares de vidro borossilicato (fixação)Warner InstrumentsG150T-6
capilares de vidro borossilicato (eletrodos afiados)Warner InstrumentsGC100F-10
capilares de vidro borossilicato (trituração)World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA1B100-4
BSA: Albumina de Soro BovinoSigmaA7906
CaCl2: Cloreto de CálcioSigma223506
Colagenase (Mistura Tipo H)SigmaC8051
Tampa de Vidro (2.4  &vezes;   5.0  cm)ThermoFisher Scientific12-548-5M
Data Acquision DigitizerMolecular Devices, Sunnyvale, CA, EUADigidata 1550A
Prato de Dissecção (Petri de Vidro com fundo de Sylgard de Carvão)Instrumentação de Sistemas Vivos, St. Albans City, VT, EUADD-90-S-BLK
DitioeritritolSigmaD8255
DMSO: DimetilsulfóxidoSigmaD8418
Elastase (pâncreas suíno)SigmaE7885
Rastreador de Retículo Endoplasmático (ER-Tracker Red, BODIPY TR Glibenclamide)ThermoFisher ScientificE34250
Fontes de luz de fibra óptica  Schott, Mainz, Alemanha & KL200, Válvula de Controle de Fluxo ZeissFostec 8375
Warner Instruments  FR-50
Interface do sistema de fluorescência, lâmpada ARC e fonte de alimentação, hiperinterruptor e dispositivosmoleculares PMT, Sunnyvale, CA, EUAFórceps de sistemas
(ponta fina, afiada)FSTDumont # 5 & Dumont #55
Gerador de FunçãoEZ Digital, Seul, Coreia do SulFG-8002
Fura-2 AM dyeInvitrogen, Carlsbad, CA, EUAF14185
GlicoseSigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA)G7021
HCl: Ácido ClorídricoThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, EUA)A466250
HeadstagesMolecular DispositivosHS-2A e HS-9A
HEPES: (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico)SigmaH4034
Warner InstrumentsSH-27B
KCl: Cloreto de PotássioSigmaP9541
MgCl2: Cloreto de MagnésioSigmaM2670
MicroforgeNarishige, East Meadow, NY, EUA  Micromanipulador MF-900
Siskiyou  Extrator de micropipeta MX10
(digital)Sutter Instruments, Novato, CA, EUAP-97 ou P-1000
(Nikon invertido)Nikon Instruments Inc, Melville, NY, EUAMicroscópio Ts2
(Nikon invertido)Nikon Instruments IncEclipse TS100
Objetivas de microscópioNikon Instruments Inc20X (S-Fluor) e 40X (Plan Fluor)
Plataforma de microscópio (alumínio anodizado; diâmetro, 7,8  cm)Warner InstrumentsPM6 ou PH6
Microscópio Stage (Alumínio)Siskiyou, Grants Pass, OR, EUA8090P
Microsyringe PumpController World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USASYS-MICRO4
MTA: 2-Metiltioadenosina difosfato sal trissódicoTocris1624
NaCl: Cloreto de SódioSigmaS7653
NaOH: Hidróxido de SódioSigmaS8045
Coloração Nuclear (Reagente NucBlue Live ReadyProbes; Hoechst 33342)ThermoFisher ScientificR37605
OsciloscópioTektronix, Beaverton, Oregon, EUA  Objetivas de contraste de fase TDS 2024B
PapainSigmaP4762
Nikon Instruments Inc ( Ph1 DL; 10X e 20X)
Mancha de membrana plasmática (CellMask Deep Red)ThermoFisher ScientificC10046
Warner Instruments, Camden, CT, EUARC-27
Tesoura (lâminas de 3 mm e 7 mm)Ferramentas de ciências finas (ou FST), Foster City, CA, EUATesoura Moria MC52 e 15000-00
(estilo Vannas; 9,5 mm & 3  lâminas mm)World Precision Instruments555640S, 14364
EstereomicroscópiosZeiss, NY, EUAStemi 2000 & 2000-C
Filtro de seringa (0,22 µ m)ThermoFisher Scientific722-2520
Controlador de Temperatura (Canal Duplo)Warner InstrumentsTC-344B ou Sistema
Warner InstrumentsVC-6
Mesa de Isolamentode Vibração Fabricação Técnica, Peabody, MA, EUA  Micro-g
IonOptixAquecedor de Solução Inline Microscópio Câmara de superfusão de plexiglas de Controle de Válvula C

Referências

  1. Fernandez-Klett, F., Offenhauser, N., Dirnagl, U., Priller, J., Lindauer, U. Pericytes in capillaries are contractile in vivo, but arterioles mediate functional hyperemia in the mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (51), 22290-22295 (2010).
  2. Longden, T. A., et al. Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow. Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).
  3. Kelleher, R. J., Soiza, R. L. Evidence of endothelial dysfunction in the development of Alzheimer's disease: Is Alzheimer's a vascular disorder. American Journal of Cardiovascular Disease. 3 (4), 197-226 (2013).
  4. Hakim, M. A., Behringer, E. J. Development of Alzheimer's disease progressively alters sex-dependent KCa and sex-independent KIR channel function in cerebrovascular endothelium. Journal of Alzheimers Disease. 76 (4), 1423-1442 (2020).
  5. Pires, P. W., Earley, S. Neuroprotective effects of TRPA1 channels in the cerebral endothelium following ischemic stroke. elife. 7, 35316(2018).
  6. Mughal, A., Harraz, O. F., Gonzales, A. L., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. PIP2 improves cerebral blood flow in a mouse model of Alzheimer's disease. Function. 2 (2), (2021).
  7. Zhao, L., et al. Pharmacologically reversible zonation-dependent endothelial cell transcriptomic changes with neurodegenerative disease associations in the aged brain. Nature Communications. 11 (1), 4413(2020).
  8. Peters, E. C., et al. Amyloid-beta disrupts unitary calcium entry through endothelial NMDA receptors in mouse cerebral arteries. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2021).
  9. De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. Changes in cerebral arteries and parenchymal arterioles with aging: Role of rho kinase 2 and impact of genetic background. Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).
  10. Fontaine, J. T., Rosehart, A. C., Joutel, A., Dabertrand, F. HB-EGF depolarizes hippocampal arterioles to restore myogenic tone in a genetic model of small vessel disease. Mechanisms of Ageing and Development. 192, 111389(2020).
  11. Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. Isolation and cannulation of cerebral parenchymal arterioles. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (111), e53835(2016).
  12. Rosehart, A. C., Johnson, A. C., Dabertrand, F. Ex vivo pressurized hippocampal capillary-parenchymal arteriole preparation for functional study. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60676(2019).
  13. Hakim, M. A., Behringer, E. J. Simultaneous measurements of intracellular calcium and membrane potential in freshly isolated and intact mouse cerebral endothelium. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58832(2019).
  14. Hakim, M. A., Chum, P. P., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Aging alters cerebrovascular endothelial GPCR and K+ channel function: Divergent role of biological sex. Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 75 (11), 2064-2073 (2020).
  15. Behringer, E. J., Hakim, M. A. Functional interaction among KCa and TRP channels for cardiovascular physiology: Modern perspectives on aging and chronic disease. International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1380(2019).
  16. Marrelli, S. P., Eckmann, M. S., Hunte, M. S. Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (4), 1590-1599 (2003).
  17. Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Endothelial SKCa and IKCa channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).
  18. Hakim, M. A., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Electrical dynamics of isolated cerebral and skeletal muscle endothelial tubes: Differential roles of G-protein-coupled receptors and K+ channels. Pharmacological Research and Perspectives. 6 (2), 00391(2018).
  19. Hakim, M. A., Behringer, E. J. Methyl-beta-cyclodextrin restores KIR channel function in brain endothelium of female Alzheimer's disease Mice. Journal of Alzheimers Disease Reports. 5 (1), 693-703 (2021).
  20. Behringer, E. J., Shaw, R. L., Westcott, E. B., Socha, M. J., Segal, S. S. Aging impairs electrical conduction along endothelium of resistance arteries through enhanced Ca2+-activated K+ channel activation. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1892-1901 (2013).
  21. Attems, J., Jellinger, K. A. The overlap between vascular disease and Alzheimer's disease--lessons from pathology. BMC Medicine. 12, 206(2014).
  22. Fisher, C. M. The arterial lesions underlying lacunes. Acta Neuropathologica. 12 (1), 1-15 (1968).
  23. Behringer, E. J. Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function. Microcirculation. 24 (3), (2017).
  24. Dunn, K. M., Nelson, M. T. Neurovascular signaling in the brain and the pathological consequences of hypertension. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (1), 1-14 (2014).
  25. Cipolla, M. J., et al. Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity. Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).
  26. Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. SKCa and IKCa Channels, myogenic tone, and vasodilator responses in middle cerebral arteries and parenchymal arterioles: effect of ischemia and reperfusion. Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).
  27. Chen, Y. L., et al. Calcium signal profiles in vascular endothelium from Cdh5-GCaMP8 and Cx40-GCaMP2 mice. Journal of Vascular Research. 58 (3), 159-171 (2021).
  28. Bando, Y., Sakamoto, M., Kim, S., Ayzenshtat, I., Yuste, R. Comparative evaluation of genetically encoded voltage indicators. Cell Reports. 26 (3), 802-813 (2019).
  29. Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A., Robinson, J. J., Earley, S. Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), 2031-2041 (2015).
  30. Behringer, E. J., Segal, S. S. Tuning electrical conduction along endothelial tubes of resistance arteries through Ca2+-activated K+ channels. Circulation Research. 110 (10), 1311-1321 (2012).
  31. Behringer, E. J., Socha, M. J., Polo-Parada, L., Segal, S. S. Electrical conduction along endothelial cell tubes from mouse feed arteries: confounding actions of glycyrrhetinic acid derivatives. British Journal of Pharmacology. 166 (2), 774-787 (2012).
  32. Thomsen, M. S., Routhe, L. J., Moos, T. The vascular basement membrane in the healthy and pathological brain. Journal of Cerebral of Blood Flow and Metabolism. 37 (10), 3300-3317 (2017).
  33. Jambusaria, A., et al. Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation. elife. 9, 51413(2020).
  34. Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), 365-375 (2016).
  35. Chen, M. B., et al. Brain endothelial cells are exquisite sensors of age-related circulatory cues. Cell Reports. 30 (13), 4418-4432 (2020).

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