Isolamento de Microvesículas Esplênicas em Modelo Murino de Infecção Bacteriana Intraperitoneal

Resumo

As microvesículas que se desprendem da membrana plasmática atuam como efetores celulares. As microvesículas do baço (SMVs) são marcadores substitutos de condições fisiopatológicas. Em ratos e camundongos, o conteúdo e as propriedades do SMV caracterizam o envelhecimento ou a inflamação e são alterados por tratamentos citoprotetores, tornando-os uma ferramenta de monitoramento valiosa e abundante para pesquisas pré-clínicas.

Resumo

Microvesículas (MVs) são fragmentos submicrônicos liberados da membrana plasmática de células ativadas que atuam como efetores celulares pró-inflamatórios e pró-coagulantes. Em ratos, os MVs do baço (SMVs) são marcadores substitutos de condições fisiopatológicas. Estudos in vitro anteriores demonstraram que Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis), um importante patógeno periodontal, permite a descamação endotelial e a apoptose, enquanto o lipopolissacarídeo (LPS) favorece a eliminação de microvesículas derivadas de esplenócito (SMVs). Estudos in vivo mostraram a viabilidade do controle farmacológico da excreção de SMV. O presente protocolo estabelece um procedimento padronizado para isolar SMVs esplênicos do modelo de infecção murina aguda por P. gingivalis . A infecção por P. gingivalis foi induzida em camundongos jovens C57BL/6 por injeção intraperitoneal (três injeções de 5 x 10⁷ bactérias/semana). Após duas semanas, os baços foram coletados, pesados e os esplenócitos foram contados. Os SMVs foram isolados e quantificados por ensaios de proteína, RNA e protrombinase. A viabilidade celular foi avaliada por corantes de exclusão de iodeto de propídio ou azul de tripano. Após a extração dos esplenócitos, as contagens de neutrófilos foram obtidas por citometria de fluxo após 24 h de cultura de esplenócitos. Em camundongos injetados com P. gingivalis, foi observado um aumento de 2,5 vezes no peso do baço e um aumento de 2,3 vezes na contagem de esplenócitos, enquanto a contagem de neutrófilos foi aumentada em 40 vezes. A viabilidade celular dos esplenócitos de camundongos injetados com P. gingivalis variou de 75% a 96% e diminuiu 50% após 24 h de cultura, sem nenhuma diferença significativa em comparação com os controles não expostos. No entanto, os esplenócitos de camundongos injetados liberam maiores quantidades de MVs por ensaio de protrombinase ou medições de proteínas. Os dados demonstram que os SMVs pró-coagulantes são ferramentas confiáveis para avaliar uma resposta precoce do baço à infecção intraperitoneal por P. gingivalis .

Introdução

Microvesículas (MVs), também denominadas micropartículas ou ectossomos, são fragmentos de membrana plasmática com diâmetro de 0,1-1,0 μm liberados em fluidos corporais e no espaço extracelular em resposta a vários estímulos celulares. Identificados pela primeira vez como poeira plaquetária expondo fosfolipídios pró-coagulantes, principalmente fosfatidilserina (PSer), os MVs constituem uma superfície adicional para a montagem dos complexos de coagulação sanguínea ^1,2. O papel fundamental das MVs circulantes como efetores pró-coagulantes foi demonstrado em pacientes com síndrome....

Protocolo

Todos os protocolos experimentais foram aprovados e seguiram as diretrizes relevantes do Comitê de Ética local (APAFIS#28745-2020121815051557) e cuidados com os animais da Universidade de origem e do INSERM. Camundongos jovens machos C57BL/6, com 6-8 semanas de idade, foram utilizados para os experimentos. Os camundongos foram examinados regularmente para avaliar a dor e o estresse, e seus pesos foram monitorados diariamente. Salvo indicação em contrário, todos os tampões e soluções de extração devem ser estéreis e à temperatura ambiente.

1. Preparação animal

1. Administrar aos cam....

Resultados

Os dados fornecidos fornecem uma representação completa de todo o procedimento, usando duas condições animais principais: camundongos C57BL/6 jovens não tratados e seus irmãos de ninhada submetidos a seis injeções intraperitoneais (IP) de PG a cada 2 dias, durante 2 semanas. Eles também mostram a ação remota de uma injeção intraperitoneal de PG na resposta do baço após 2 semanas. As microvesículas de esplenócito foram quantificadas por ensaio enzimático de protrombinase ou pela medição de suas proteínas e concentração de.......

Discussão

O presente estudo confirma que o baço é uma fonte importante e confiável de MVs com relevância fisiopatológica em comparação com outras fontes como o sangue, de volume limitado em camundongos. Desde que sejam tomadas precauções, o método é fácil de configurar e não requer equipamentos caros. Uma vez que não há outra forma alternativa além da avaliação in vivo , o modelo atual parece ser um método valioso para estudar o impacto dos pró-fármacos na eliminação de VM. É importante r.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubos de 2 mL tipo Eppendorf	Dutscher	54816	Estrutura de fundo cônico; microtubos riel
Allegra 64 R Centrífuga	Beckman Coulter
Contador automático de células	Biorad
Albumina de soro bovino	Euromedex	04-100-812-E	Preparado, filtrado com 0,22 µ m peneira e armazenado a 4 ° C em condições estéreis, utilizando as seguintes fórmulas: EDTA 2 mM, BSA 0,5% e PBS
CD11 estéril (Mac-1)	e-Biosciences	45-00112-80	Conjugado a eFluor 450; λ max excitação 405 nm λ máx 445 nm
CD16/32	BD Biosciences	553142	não conjugado
	Calbiochem Calbiochem	S	6381-92-6
Tubo de falcão	Estrela celular	227261	50 mL
Soro bovino fetal	Dutscher	S1810-500	Número do lote = S14028S1810
Fortessa Aria	BD Biosciences		para citômetro
de fluxo Fortessa	Becton-Dickinson para
Fungizone	PAN biotech	P06-01050
HBSS	Gibco	14175-053	Sem vermelho de fenol, sem Ca+2 and Mg+2
ICAM-1	abcam	ab171123
LYG-6 (Gr-1)	BD Biosciences	566218	Conjugado a BUV395; λ max excitação 348 nm, λ máx 395 nm
Eritrócitos tampão de lise (ACK)	Sigma		preparado, filtrado com 0,22 µ m peneira e armazenado a 4° C em condições estéreis usando as seguintes fórmulas: NH4Cl, 0,15 M (molaridade), 53,491 (mw) 4 g KHCO3 1 mM (molaridade) 100,115 (mw), 50 mg EDTA  0,1 mM (molaridade), 292,24 (mw), 14,6 g pH: 7,2– 7.4
NanoDrop 1000 espectrofotômetro	Thermoscientific
PBS	Lonza	17-516F	Sem Ca+2  e Mg+2
Placa			100 mm
Tubo de poliestireno	Falcon	352070
q-Nano Gold	iZON science
Meio de cultura RPMI 1640: 2 g/L de glicose	PAN biotech	p04-18047	Suplementado com Streptomycin (100 U/mL)/Penicilina (100 U/mL), Fungizone (250 mg/mL), L-glutamina (2 mM) e FBS 10%.
Scalpels
Sieve Nylon	Falcon USA	352360	100 µ m
Estreptomicina/Penicilina	PAN biotech	P06-07100
Seringa			2 mL
Trypan Blue	Biorad	1450013
VCAM1	abcam	ab215380

EDTA classificação de células. de Petri de plástico