Isolamento de Microvesículas Esplênicas em Modelo Murino de Infecção Bacteriana Intraperitoneal

Summary

As microvesículas que se desprendem da membrana plasmática atuam como efetores celulares. As microvesículas do baço (SMVs) são marcadores substitutos de condições fisiopatológicas. Em ratos e camundongos, o conteúdo e as propriedades do SMV caracterizam o envelhecimento ou a inflamação e são alterados por tratamentos citoprotetores, tornando-os uma ferramenta de monitoramento valiosa e abundante para pesquisas pré-clínicas.

Abstract

Microvesículas (MVs) são fragmentos submicrônicos liberados da membrana plasmática de células ativadas que atuam como efetores celulares pró-inflamatórios e pró-coagulantes. Em ratos, os MVs do baço (SMVs) são marcadores substitutos de condições fisiopatológicas. Estudos in vitro anteriores demonstraram que Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis), um importante patógeno periodontal, permite a descamação endotelial e a apoptose, enquanto o lipopolissacarídeo (LPS) favorece a eliminação de microvesículas derivadas de esplenócito (SMVs). Estudos in vivo mostraram a viabilidade do controle farmacológico da excreção de SMV. O presente protocolo estabelece um procedimento padronizado para isolar SMVs esplênicos do modelo de infecção murina aguda por P. gingivalis . A infecção por P. gingivalis foi induzida em camundongos jovens C57BL/6 por injeção intraperitoneal (três injeções de 5 x 10⁷ bactérias/semana). Após duas semanas, os baços foram coletados, pesados e os esplenócitos foram contados. Os SMVs foram isolados e quantificados por ensaios de proteína, RNA e protrombinase. A viabilidade celular foi avaliada por corantes de exclusão de iodeto de propídio ou azul de tripano. Após a extração dos esplenócitos, as contagens de neutrófilos foram obtidas por citometria de fluxo após 24 h de cultura de esplenócitos. Em camundongos injetados com P. gingivalis, foi observado um aumento de 2,5 vezes no peso do baço e um aumento de 2,3 vezes na contagem de esplenócitos, enquanto a contagem de neutrófilos foi aumentada em 40 vezes. A viabilidade celular dos esplenócitos de camundongos injetados com P. gingivalis variou de 75% a 96% e diminuiu 50% após 24 h de cultura, sem nenhuma diferença significativa em comparação com os controles não expostos. No entanto, os esplenócitos de camundongos injetados liberam maiores quantidades de MVs por ensaio de protrombinase ou medições de proteínas. Os dados demonstram que os SMVs pró-coagulantes são ferramentas confiáveis para avaliar uma resposta precoce do baço à infecção intraperitoneal por P. gingivalis .

Introduction

Microvesículas (MVs), também denominadas micropartículas ou ectossomos, são fragmentos de membrana plasmática com diâmetro de 0,1-1,0 μm liberados em fluidos corporais e no espaço extracelular em resposta a vários estímulos celulares. Identificados pela primeira vez como poeira plaquetária expondo fosfolipídios pró-coagulantes, principalmente fosfatidilserina (PSer), os MVs constituem uma superfície adicional para a montagem dos complexos de coagulação sanguínea ^1,2. O papel fundamental das MVs circulantes como efetores pró-coagulantes foi demonstrado em pacientes com síndrome^{de Scott 2}, uma doença genética rara que leva à exposição disfuncional ao PSer e sangramento (Figura 1 suplementar). As MVs têm sido extensivamente estudadas como biomarcadores circulantes de risco trombótico em doenças crônicas associadas a doenças cardiovasculares, como diabetes, doença renal crônica, pré-eclâmpsia e hipertensão ^3,4. Atualmente, são reconhecidos como verdadeiros efetores celulares em fluidos ou tecidos de órgãos como o miocárdio¹. Por transportarem proteínas, lipídios e miRNAs ativos, modulam remotamente as respostas vasculares, como hemostasia, inflamação, angiogênese vascular e crescimento vascular ou remodelação tecidual⁵.

Enquanto os estudos clínicos examinam o valor prognóstico das MVs em relação aos fatores de risco, as MVs isoladas dos fluidos ou tecidos do paciente permitem a avaliação ex vivo de suas propriedades efetoras⁶. A decifração dos mecanismos que governam a biogênese de MV e as habilidades de diafonia é geralmente alcançada em modelos de cultura de células para identificar moléculas ativas expostas ou encapsuladas dentro dos MVs e sua sinalização a jusante. As interações da VM com as células-alvo dependerão da ligação proteína/proteína da membrana, quando contraligantes apropriados estiverem disponíveis, e/ou fusão lipídica⁷.

Em condições fisiológicas, as MVs que circulam no plasma se originam principalmente de células vasculares, conforme identificado pelos marcadores de diferenciação de agrupamento de linhagem (DC)^8,9. No entanto, na patologia, notadamente no câncer¹⁰ e na rejeição do enxerto^11,12, as MVs são eliminadas do tecido danificado e apresentam características pró-coagulantes e pró-inflamatórias nocivas. Estes são detectados na circulação sistêmica, tornando-os sondas úteis para monitorar terapias protetoras ou de rejuvenescimento, e possíveis alvos farmacológicos¹³. Como as MVs circulam como um pool de armazenamento dinâmico refletindo a homeostase das células vasculares e teciduais na saúde e na doença, uma melhor compreensão de sua ação remota também precisa ser investigada in vivo, após injeção intravenosa ou instilação nasal em pequenos animais^14,15. De fato, as MVs têm sido consideradas os principais contribuintes para as intrincadas vias que acoplam inflamação exagerada e trombose¹⁶.

A periodontite é uma doença inflamatória de origem infecciosa que afeta os tecidos de suporte dentário^17,18 e está associada ao risco trombótico. É caracterizada por sangramento gengival, destruição do osso alveolar, mobilidade dentária e pode levar à perda do dente. A periodontite é altamente prevalente em todo o mundo e afeta mais de 50% da população, sendo que 11% apresentam uma forma grave¹⁹. A periodontite é induzida pela disbiose bacteriana dos biofilmes subgengivais, que sustentam uma resposta inflamatória exacerbada que desencadeia a destruição tecidual²⁰. Na última década, a periodontite tem sido associada a doenças sistêmicas, como distúrbios cardiovasculares, diabetes e artrite reumatóide. As possíveis explicações são a ação dos patógenos periodontais à distância e/ou o aumento da inflamação sistêmica mediada por citocinas pró-inflamatórias, como a interleucina (IL-1, IL-6) e o TNF-α^21,22.

Dentre os patógenos associados ao início e desenvolvimento da periodontite, o Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis)²³ é encontrado na maioria das lesões graves que colhem vários fatores de virulência, incluindo lipopolissacarídeo (LPS)²⁴ induzindo respostas inflamatórias mediadas por receptores semelhantes a Toll (TLR)²⁵ e o recrutamento de neutrófilos e leucócitos polimorfonucleares (PMNs) no local da infecção^inicial26. O LPS de P. gingivalis ativa TLR-4 ou TLR-2, facilitando a detecção imunológica e a evasão da sobrevivência bacteriana²⁷. No nível vascular, a ativação de TLR2 por LPS está associada à imunotrombose. A capacidade única de P. gingivalis de estimular a sinalização de TLR-2 enquanto o reconhecimento dependente de TLR-4 é significativamente prejudicado favorece a infecção persistente de baixo grau^28,29.

Procedimentos in vivo para estudar as respostas da VM à infecção crônica e sustentada de patógenos de baixo grau são escassos. As abordagens metodológicas para a extração de MVs tissulares são pouco descritas na literatura e geralmente dizem respeito à coleta de MVs de tecidos patológicos como tumores sólidos, esteatose hepática, placas aterotrombóticas ou enxertos 11,29,30, enquanto o baço detecta bactérias e vírus na corrente sanguínea. Ele também armazena eritrócitos, plaquetas, linfócitos, monócitos, basófilos e eosinófilos envolvidos na resposta imune. Granulócitos como neutrófilos da polpa vermelha também geram espécies reativas de oxigênio (ROS) e proteases que destroem patógenos e impedem que a infecção se espalhe^31,32. Surpreendentemente, e até onde sabemos, as MVs do baço não são investigadas no contexto de insultos teciduais induzidos por patógenos. Há uma necessidade global não atendida de estudar as variações das MVs tissulares na fisiopatologia.

Dados in vitro de nosso laboratório mostraram que o LPS induz a liberação de MVs pró-coagulantes de esplenócitos de ratos, o que, por sua vez, provoca a senescência de células endoteliais coronárias cultivadas e um fenótipo endotelial pró-inflamatório e pró-inflamatório consecutivo¹¹. A viabilidade do controle farmacológico das MVs do baço foi demonstrada após o tratamento do animal com uma fórmula otimizada de ômega-3. A gavagem oral de ratos de meia-idade e idosos mostrou-se protetora tanto contra a liberação de MVs pró-coagulantes dos esplenócitos quanto contra suas propriedades nocivas prosenescentes em relação ao endotélio coronariano³³.

Comparado ao sangue, o baço oferece a vantagem de ser uma importante fonte de leucócitos em um indivíduo. Além disso, um eixo esplênico-cardíaco foi proposto recentemente ^3,34, tornando o baço um possível contribuinte para o risco cardiovascular relacionado à infecção de interesse benéfico para o controle farmacológico. A avaliação das propriedades ou liberação dos SMVs é fundamental para entender as respostas inflamatórias ou induzidas por patógenos. Curiosamente, pode ser alcançado em animais tratados e em diferentes modelos fisiopatológicos (idade, hipertensão, diabetes). De fato, comparando ratos de meia-idade e idosos³³, as diferenças nas propriedades e liberação de MVs do baço podem ser evidenciadas após uma cultura simples de esplenócitos de 24 horas.

Dadas as evidências acima da alteração das propriedades efetoras das MVs do baço com a condição fisiopatológica e a viabilidade de seu controle farmacológico em ratos, um protocolo padronizado é descrito aqui para o isolamento das MVs do baço murino. O procedimento se encaixaria melhor em investigações aprofundadas dos mecanismos in vivo que suportam os efeitos mediados por SMVs, eventualmente em camundongos modificados. O procedimento foi estabelecido em camundongos C57BL/6 usando uma infecção intraperitoneal local por P. gingivalis, para estabelecer a prova de uma ação remota do patógeno nas propriedades efetoras do MV do baço (SMV).

Protocol

Todos os protocolos experimentais foram aprovados e seguiram as diretrizes relevantes do Comitê de Ética local (APAFIS#28745-2020121815051557) e cuidados com os animais da Universidade de origem e do INSERM. Camundongos jovens machos C57BL/6, com 6-8 semanas de idade, foram utilizados para os experimentos. Os camundongos foram examinados regularmente para avaliar a dor e o estresse, e seus pesos foram monitorados diariamente. Salvo indicação em contrário, todos os tampões e soluções de extração devem ser estéreis e à temperatura ambiente.

1. Preparação animal

1. Administrar aos camundongos seis injeções intraperitoneais de P. gingivalis (PG) a cada 2 dias durante 2 semanas (três injeções de 5 x 10⁷ bactérias/semana, Arquivo Suplementar 1).
2. Anestesiar os camundongos usando uma combinação de 100 mg/kg de cetamina e 10 mg/kg de xilazina.
3. Sacrifique os camundongos anestesiados e colha o baço após a laparotomia.
   NOTA: As condições específicas para a infecção por P. gingivalis e o sacrifício dos animais para a colheita do baço são detalhadas na seção "experimento animal" do Arquivo Suplementar 1. A representação esquemática das etapas do protocolo é mostrada na Figura 1.

2. Extração de esplenócitos

1. Usando um bisturi, pique o tecido do baço em fatias de ~ 1 mm em uma placa de Petri já preenchida com 3 mL de RPMI contendo antibióticos (estreptomicina (100 U / mL) / penicilina (100 U / mL), Fungizone (250 mg / mL), L-glutamina (2 mM)) e suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) (ver Tabela de Materiais).
2. Transfira as fatias para uma peneira (ver Tabela de Materiais), que é previamente fixada a um tubo de poliestireno de 50 mL.
3. Use o êmbolo de uma seringa como pilão para esmagar os tecidos na peneira.
4. Enxágue a peneira com o meio RPMI (3 mL).
5. Centrifugar o eluído da suspensão celular a 450 x g durante 5 min à temperatura ambiente e rejeitar o sobrenadante com precaução por refluxo.

3. Remoção de eritrócitos por choque osmótico

1. Adicione 1 mL de tampão ACK (consulte a Tabela de Materiais), misture bem, incube por 3 min em temperatura ambiente e agite suavemente girando com a mão.
2. Dilua adicionando 9 mL de RPMI e misture bem usando aspiração e refluxo.
3. Centrifugue a 450 x g por 5 min em temperatura ambiente.
4. Descarte o sobrenadante por aspiração e refluxo e ressuspenda o pellet em 5 mL de meio RPMI.
5. Misture suavemente (aspiração / refluxo) e, eventualmente, remova quaisquer detritos lipídicos pipetando ou usando uma peneira.

4. Ajuste da concentração isolada de esplenócitos

1. Encha um microtubo de 1,5 mL contendo 900 μL de RPMI.
2. Usando uma micropipeta, pegue 100 μL da suspensão celular, adicione ao microtubo de 1,5 mL contendo 900 μL de meio RPMI e misture bem.
3. Transfira 10 μL das células diluídas para um microtubo, adicione 10 μL do corante de exclusão azul de tripano e misture bem.
4. Colocar 10 μL da solução (passo 3.3) na lâmina de contagem do contador automático de células (ver Tabela de Materiais) e determinar a contagem de células.
   NOTA: O software do dispositivo fornece dois valores: o número total de células e o número e a porcentagem de células vivas.
5. Ajuste a concentração de células vivas para 3 ou 5 x 10⁶ células/mL (V_máx = 20 mL; capacidade total máxima é de 100 x 10⁶ células/mL).
6. Semeie as células em um frasco de 75 mL contendo RPMI.
7. Incubar o balão verticalmente numa incubadora humidificada a 37 °C durante 24 h.
   CUIDADO: O azul de tripano é um agente mutagênico e cancerígeno^35,36. Certifique-se de usar luvas durante a contagem, mesmo fora do capô. Descarte imediatamente as pontas e fluidos em recipientes e lave a superfície da bancada.
   NOTA: Se as células coletadas forem inferiores a 50 x 10⁶, use um frasco de cultura de 25 mL. O número de células não deve variar muito de um indivíduo para outro. A porcentagem de células vivas é geralmente superior a 80% nesta etapa.

5. Isolamento de microvesículas de esplenócito

1. Após 24 h, despeje o conteúdo do frasco em um tubo de polipropileno ou poliestireno de 50 mL.
2. Centrifugue a 450 x g por 15 min em temperatura ambiente para remover células e detritos.
3. Após centrifugação, manter 100 μL do 1º sobrenadante (SN1) para uma eventual medição da concentração inicial de MV para calcular o rendimento do isolamento. Observe o volume SN1.
4. Centrifugue o SN1 a 450 x g por 15 min em temperatura ambiente.
5. Descarte o pellet e centrifugue novamente a 450 x g por 15 min em temperatura ambiente. Retire e colete rapidamente SN2 (observe o volume).
6. Transfira SN2 para microtubos de 1,8 mL com fundo de formato cônico. Mantenha 100 μL de SN2 para uma eventual medição da concentração inicial de MV para calcular o rendimento de isolamento caso muitos detritos eventualmente prejudiquem a medição de MV em SN1.
7. Adicione 5 mL de meio RPMI ao pellet (células) e conte os esplenócitos.
   NOTA: A suspensão celular também pode ser fixada para caracterização por citometria de fluxo em paraformaldeído a 0,1% (concentração final)³⁷.
8. Centrifugue SN2 a 14.000 x g por 1 h a 4 °C e, eventualmente, refrigere o rotor com antecedência, operando o rotor vazio a 4 °C. Esta etapa gera SN3.
9. Retire imediatamente o SN3 de cada microtubo invertendo sobre um único tubo estéril de 50 mL (sob o capô). Observe o volume SN3.
10. Misture suavemente SN3 usando uma pipeta sob o capô. Guarde alíquotas para eventuais medições na suspensão.
    NOTA: A solução está agora esgotada de MVs, mas contém os mediadores solúveis e exossomos.
11. Raspe cada microtubo (fechado) em um rack pontiagudo para favorecer mecanicamente a ressuspensão dos MVs no pellet.
12. Adicione 200 μL de solução salina balanceada de Hank sem Ca²⁺ e Mg²⁺ (HBSS) no primeiro microtubo (ver Tabela de Materiais).
13. Ressuspenda o sedimento MV do primeiro tubo por ciclos suaves de aspiração/refluxo (~10 vezes) usando uma micropipeta de 1 mL. Tome muito cuidado para evitar a formação de espuma, pois isso promoverá a oxidação das vesículas e outras porções na suspensão.
14. Colha os primeiros 200 μL de MVs ressuspensos e despeje-os no segundo tubo sobre o pellet. Misture delicadamente como acima e, em seguida, despeje novamente no terceiro tubo e misture delicadamente. A suspensão torna-se cada vez mais turva de tubo para tubo. Feche o terceiro tubo.
15. Inicie a coleta dos próximos três microtubos como acima (etapa 4.14).
16. Colete todos os MVs ressuspensos em um único (ou dois) microtubo coletor (2 mL com fundo de formato cônico). Guarde 50 μL para o eventual cálculo do rendimento desta etapa. Observe o volume da suspensão.
17. Centrifugue o tubo coletor a 14.000 x g por 1 h a 4 °C. Esta etapa gera SN4.
18. Descarte imediatamente o SN4 (despeje sobre um tubo coletor sobrenadante). Mantenha uma alíquota de SN4 para calcular o rendimento da etapa de purificação e ressuspenda suavemente o pellet em 500 μL de HBBS (sem Ca²⁺ e Mg²⁺). Conservar uma alíquota de 50 μL do sedimento ressuspenso para calcular o rendimento de depuração e anotar o seu volume.
19. Conservar o sedimento ressuspenso a 4 °C durante um mês até um mês para ensaios funcionais em condições estéreis ou a -20 °C para ensaios estruturais.
20. Calcular o rendimento de purificação (ver NOTA abaixo) de cada etapa ou de todo o procedimento, medindo a concentração de MV em sobrenadantes e/ou suspensões de sedimentos.
    NOTA: Rendimento de purificação (%): ([MV1] x volume SN1) / ([MV4] x volume final de suspensão) x 100.
    Este rendimento deve ser racionalizado em função do número de esplenócitos isolados do balão de cultura e contabilizados no passo 4.4. O rendimento de purificação do presente experimento é de ~ 70% a partir de 111 x 10,⁶ células e 60 mL de sobrenadante.
    1. Avalie a perda de SMVs causada pelo procedimento medindo os SMVs remanescentes nos sobrenadantes esgotados de SMVs e contendo principalmente exossomos (SN2 e SN4).
    2. Meça a concentração de VM pelo ensaio TRPS ou protrombinase³⁸ para alta sensibilidade e especificidade.
       CUIDADO: Colha os MVs após a centrifugação pelo rápido vazamento de cabeça para baixo do sobrenadante. Esperar ou usar microtubos em forma de U levará à perda de MV na parede do microtubo. Nunca use uma micropipeta para descartar o sobrenadante; o pellet pode ser aspirado. Nunca atrase o processo depois que a centrífuga for parada. A centrifugação em excesso de velocidade resultará na contaminação do pellet MV por exossomos.
       NOTA: As velocidades e a duração da centrifugação são otimizadas para um enriquecimento de MV com contaminação mínima por exossomos. Este protocolo não é confiável para estudar MVs de monócitos/macrófagos do baço, pois essas células podem fagocitar e recapturar rapidamente suas próprias MVs³⁹. O protocolo não pode ser pausado e reiniciado posteriormente devido à perda de células devido à viabilidade celular.

Results

Os dados fornecidos fornecem uma representação completa de todo o procedimento, usando duas condições animais principais: camundongos C57BL/6 jovens não tratados e seus irmãos de ninhada submetidos a seis injeções intraperitoneais (IP) de PG a cada 2 dias, durante 2 semanas. Eles também mostram a ação remota de uma injeção intraperitoneal de PG na resposta do baço após 2 semanas. As microvesículas de esplenócito foram quantificadas por ensaio enzimático de protrombinase ou pela medição de suas proteínas e concentração de...

Discussion

O presente estudo confirma que o baço é uma fonte importante e confiável de MVs com relevância fisiopatológica em comparação com outras fontes como o sangue, de volume limitado em camundongos. Desde que sejam tomadas precauções, o método é fácil de configurar e não requer equipamentos caros. Uma vez que não há outra forma alternativa além da avaliação in vivo , o modelo atual parece ser um método valioso para estudar o impacto dos pró-fármacos na eliminação de VM. É importante r...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubos de 2 mL tipo Eppendorf	Dutscher	54816	Estrutura de fundo cônico; microtubos riel
Allegra 64 R Centrífuga	Beckman Coulter
Contador automático de células	Biorad
Albumina de soro bovino	Euromedex	04-100-812-E	Preparado, filtrado com 0,22 µ m peneira e armazenado a 4 ° C em condições estéreis, utilizando as seguintes fórmulas: EDTA 2 mM, BSA 0,5% e PBS
CD11 estéril (Mac-1)	e-Biosciences	45-00112-80	Conjugado a eFluor 450; λ max excitação 405 nm λ máx 445 nm
CD16/32	BD Biosciences	553142	não conjugado
	Calbiochem Calbiochem	S	6381-92-6
Tubo de falcão	Estrela celular	227261	50 mL
Soro bovino fetal	Dutscher	S1810-500	Número do lote = S14028S1810
Fortessa Aria	BD Biosciences		para citômetro
de fluxo Fortessa	Becton-Dickinson para
Fungizone	PAN biotech	P06-01050
HBSS	Gibco	14175-053	Sem vermelho de fenol, sem Ca+2 and Mg+2
ICAM-1	abcam	ab171123
LYG-6 (Gr-1)	BD Biosciences	566218	Conjugado a BUV395; λ max excitação 348 nm, λ máx 395 nm
Eritrócitos tampão de lise (ACK)	Sigma		preparado, filtrado com 0,22 µ m peneira e armazenado a 4° C em condições estéreis usando as seguintes fórmulas: NH4Cl, 0,15 M (molaridade), 53,491 (mw) 4 g KHCO3 1 mM (molaridade) 100,115 (mw), 50 mg EDTA  0,1 mM (molaridade), 292,24 (mw), 14,6 g pH: 7,2– 7.4
NanoDrop 1000 espectrofotômetro	Thermoscientific
PBS	Lonza	17-516F	Sem Ca+2  e Mg+2
Placa			100 mm
Tubo de poliestireno	Falcon	352070
q-Nano Gold	iZON science
Meio de cultura RPMI 1640: 2 g/L de glicose	PAN biotech	p04-18047	Suplementado com Streptomycin (100 U/mL)/Penicilina (100 U/mL), Fungizone (250 mg/mL), L-glutamina (2 mM) e FBS 10%.
Scalpels
Sieve Nylon	Falcon USA	352360	100 µ m
Estreptomicina/Penicilina	PAN biotech	P06-07100
Seringa			2 mL
Trypan Blue	Biorad	1450013
VCAM1	abcam	ab215380