Culturas Primárias de Astrócitos de Rato e Microglia e Seu Uso no Estudo da Esclerose Lateral Amiotrófica

Katarina Milićević; Andrej Korenić; Milena Milošević; Pavle R. Andjus

doi:10.3791/63483

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Artigo de método

Culturas Primárias de Astrócitos de Rato e Microglia e Seu Uso no Estudo da Esclerose Lateral Amiotrófica

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DOI:

10.3791/63483

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23 de junho de 2022

Katarina Milićević¹ , Andrej Korenić¹ , Milena Milošević¹ , Pavle R. Andjus¹

¹Center for Laser Microscopy, Institute for Physiology and Biochemistry “Jean Giaja”, University of Belgrade Faculty of Biology

Neste artigo

Resumo

Apresentamos aqui um protocolo sobre como preparar culturas primárias de células gliais, astrócitos e micróglias de córtices de ratos para imagens de vídeo de lapso de tempo de Ca²⁺ intracelular para pesquisa sobre fisiopatologia da esclerose lateral amiotrófica no modelo de rato hSOD1^G93A .

Resumo

Este protocolo demonstra como preparar culturas primárias de células gliais, astrócitos e micróglia a partir dos córtices de ratos Sprague Dawley e como usar essas células com a finalidade de estudar a fisiopatologia da esclerose lateral amiotrófica (ELA) no modelo hSOD1^G93A de ratos. Primeiro, o protocolo mostra como isolar e cultivar astrócitos e micróglias de córtices de ratos pós-natais e, em seguida, como caracterizar e testar a pureza dessas culturas por imunocitoquímica usando o marcador de proteína ácida fibrilar glial (GFAP) de astrócitos e o marcador microglial da molécula adaptadora de ligação ao cálcio ionizado 1 (Iba1). Na próxima etapa, são descritos métodos para o carregamento de corantes (Fluo 4-AM sensível ao cálcio) de células cultivadas e as gravações de alterações de Ca²⁺ em experimentos de imagem de vídeo em células vivas.

Os exemplos de gravações de vídeo consistem em: (1) casos de imagem de Ca²⁺ de astrócitos cultivados agudamente expostos à imunoglobulina G (IgG) isolados de pacientes com ELA, mostrando uma resposta característica e específica em comparação com a resposta ao ATP, conforme demonstrado no mesmo experimento. Exemplos também mostram um aumento transitório mais pronunciado na concentração intracelular de cálcio evocada pela ELA IgG em astrócitos hSOD1^G93A em comparação com controles não transgênicos; (2) Imagem Ca 2+ de astrócitos cultivados durante uma depleção dos estoques de cálcio pela thapsigargina (Thg), um inibidor não competitivo do retículo endoplasmático Ca 2+ ATPase, seguido pela entrada de cálcio operada em armazém provocada pela adição de cálcio na solução de registro, o que demonstra a diferença entre a operação de armazenamento de Ca²⁺ em hSOD1^G93A e em astrócitos não transgênicos; (3) Imagens de Ca 2+ da micróglia cultivada mostraram predominantemente uma falta de resposta à IgG da ELA, enquanto a aplicação de ATP provocou uma alteração de Ca²⁺. Este artigo também enfatiza possíveis ressalvas e advertências em relação à densidade celular crítica e pureza das culturas, escolhendo a concentração correta do corante Ca²⁺ e das técnicas de carregamento de corantes.

Introdução

As técnicas de cultura de células deram origem a inúmeros avanços em diversos campos da neurofisiologia celular na saúde e na doença. Particularmente, as culturas de células primárias, recém-isoladas do tecido neuronal de um animal de laboratório, permitem que o experimentador estude de perto o comportamento de diversas células em diferentes meios bioquímicos e configurações fisiológicas. O uso de diferentes indicadores fisiológicos fluorescentes, como os corantes sensíveis ao Ca^2+, em combinação com a microscopia de vídeo de lapso de tempo, fornece uma melhor visão dos processos biofísicos e bioquímicos celulares em tempo real.

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