A microscopia de dispersão raman estimulada (SRS) é uma técnica de imagem poderosa, não destrutiva e livre de rótulos. Uma aplicação emergente é a histologia raman estimulada, onde imagens de SRS de duas cores nas transições de proteína e lipídio de Raman são usadas para gerar imagens pseudo-hematoxilina e eosina. Aqui, demonstramos um protocolo para imagens de SRS em tempo real e duas cores para diagnóstico de tecido.
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Artigo de método
Raman estimulado em tempo real, duas cores, espalhando imagens do cérebro do rato para diagnóstico de tecido
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A microscopia estimulada de dispersão de Raman (SRS) surgiu como uma poderosa técnica de imagem óptica para diagnóstico de tecidos. Nos últimos anos, o SRS de duas cores mostrou-se capaz de fornecer imagens equivalentes à hematoxilina e eosina (H&E) que permitem um diagnóstico rápido e confiável do câncer cerebral. Tal capacidade permitiu aplicações emocionantes de diagnóstico de câncer intraoperatório. A imagem de tecido srs de duas cores pode ser feita com uma fonte de laser picosegundo ou femtosegundo. Os lasers Femtosegundos têm a vantagem de permitir modos de imagem flexíveis, incluindo imagens hiperespectrais rápidas e imagens srs em tempo real de duas cores. Uma abordagem espectral com pulsos laser chirped é tipicamente usado com lasers femtosegundos para alcançar alta resolução espectral.
A aquisição de SRS de duas cores pode ser realizada com modulação ortogonal e detecção de lock-in. A complexidade do pulso, modulação e caracterização é um gargalo para a adoção generalizada desse método. Este artigo fornece um protocolo detalhado para demonstrar a implementação e otimização do SRS focado no espectral e imagens em tempo real de duas cores do tecido cerebral do camundongo no modo epi. Este protocolo pode ser usado para uma ampla gama de aplicações de imagem SRS que aproveitam a alta velocidade e capacidade de imagem espectroscópica do SRS.
Introdução
Os diagnósticos tradicionais de tecido dependem de protocolos de coloração seguidos de exame sob um microscópio óptico. Um método comum de coloração usado pelos patologistas é a coloração de H&E: manchas de hematoxilina nos núcleos celulares um azul arroxeado, e eosina mancha a matriz extracelular e citoplasma rosa. Essa simples coloração continua sendo o padrão ouro na patologia para muitas tarefas de diagnóstico de tecido, particularmente o diagnóstico de câncer. No entanto, a histopatologia H&E, particularmente a técnica de secção congelada usada em um ambiente intraoperatório, ainda tem limitações. O procedimento de coloração é um processo trabalhoso que envolve i....
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Protocolo
Todos os procedimentos experimentais de animais foram realizados com cérebros de camundongos fixos e seccionados de 200 μm, de acordo com o protocolo (nº 4395-01) aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Washington. Os camundongos do tipo selvagem (cepa C57BL/6J) são eutanizados com CO2. Em seguida, uma craniotomia é realizada para extrair seus cérebros para fixação em 4% de paraformaldeído em soro fisco tamponado. Os cérebros são embutidos em uma mistura de 3% de agarose e 0,3% de gelatina e seccionados em fatias de 200 μm de espessura por um vibratome.
1. Alinhamento inicial
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Resultados
Otimização da resolução espectral:
A dispersão através de um material é afetada pelo meio dispersivo (comprimento e material) e comprimento de onda. A alteração do comprimento da haste de dispersão afeta a resolução espectral e o tamanho do sinal. É uma relação de dar e receber que pode ser ponderada de forma diferente dependendo da aplicação. As hastes esticam o pulso do feixe de ser larga em frequência e estreita no tempo para ser estreita em frequência e larga no tempo. A Figur.......
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Discussão
O esquema de imagem SRS de duas cores apresentado neste protocolo depende da implementação adequada de imagens SRS de uma cor. Em imagens de SRS de uma cor, as etapas críticas são alinhamento espacial, alinhamento temporal, profundidade de modulação e mudança de fase. A combinação espacial dos dois feixes é realizada por um espelhodicróico. Vários espelhos de direção são usados para ajuste fino ao enviar as vigas para o espelho dicroico. Uma vez que os feixes são combinados com o espelho dicroico, o alinhamento espacial .......
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Divulgações
Os autores declaram que não há conflitos de interesse.
Agradecimentos
Este estudo foi apoiado pelo NIH R35 GM133435 a D.F.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Lente acromática de 100 mm | THORLABS | AC254-100-B | Banda larga, 650 - 1.050 nm, distância focal da lente acromática, filtro passa-banda de 100 mm |
| 20 MHz | Minicircuitos | BBP-21.4+ | Filtro passa-banda LC concentrado, 19,2 - 23,6 MHz, 50 e ômega; |
| Lente acromática de 200 mm | THORLABS | AC254-200-B | Banda larga, 650 - 1.050 nm, distância focal da lente acromática, 200 mm |
| Meia placa de onda acromática | Union Optic | WPA2210-650-1100-M25.4 | Banda larga meia placa de onda |
| Acromática | Union Optic | WPA4210-650-1100-M25.4 | Wideplate Quarter waveplate |
| Beam Sampler | THORLABS | BSN11 | 10:90 Espelho |
| dicróico dicroico | de feixe de placas THORLABS | DMSP1000 | Outros dicróicos com comprimento de onda central em torno de 1.000 nm podem ser usados. |
| DMSO (dimetilsulfóxido) | Sigma Aldrich | 472301 | Solvente para calibração do deslocamento Raman. Outros solventes com picos Raman conhecidos podem ser usados. |
| Modulador de amplitude eletro-óptico | THORLABS | EO-AM-NR-C1 | São necessários dois EOMs para modulação ortogonal e imagem de canal duplo. A versão ressonante é recomendada para que uma tensão de acionamento mais baixa possa ser usada. |
| Falso H& Script de coloração E | Matlab | https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining | |
| Fanout Buffer | PRL-414B | Pulse Research Lab | 1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer e Line Driver, para gerar a frequência de condução EOM e a referência ao |
| fotodiodo rápido | de bloqueio THORLABS | DET10A2 | Si Detector, 1 ns Tempo de subida |
| Divisor de frequência | PRL-220A | Laboratório | de pesquisa de pulsoDivisor de frequência TTL (f/2, f/4, f/8, f/16), para geração de 20MHz a partir da saída do laser. |
| Hastes de vidro altamente dispersivas | Union Optic | CYLROD01 | Lente de haste H-ZF52A de alta dispersão 120 mm, SF11 Lente de haste 100 mm |
| Sistema Insight DS+ | Newport | Laser capaz de emitir dois lasers pulsados sincronizados (um feixe fixo a 1.040 nm e um feixe sintonizável, variando de 680-1.300 nm) com uma taxa de repetição de 80 MHz. | |
| Amplificador de bloqueio | Liquid Instruments | Moku Lab | Amplificador de bloqueio para extrair o sinal SRS do fotodiodo. Um instrumento Zurich HF2LI ou instrumento semelhante também pode ser usado. |
| Espelhos | THORLABS | BB05-E03-10 | Espelho dielétrico de banda larga, 750 - 1.100 nm. Espelhos prateados também podem ser usados. |
| Estágio de atraso motorizado | Zaber | X-DMQ12P-DE52 | Estágio de atraso para controle fino da sobreposição temporal da bomba e dos lasers Stokes. Qualquer outro estágio motorizado deve funcionar. |
| Condensador de imersão em óleo | Nikon | CSC1003 | 1.4 NA. Outros condensadores com NA>1.2 podem ser usados. |
| Osciloscópio | Tektronix | TDS7054 | Qualquer outro osciloscópio com largura de banda de 400 MHz ou superior deve funcionar. |
| Deslocador de fase | SigaTek | SF50A2 | Para deslocar a fase da frequência de modulação |
| Fotodiodo | Hamamatsu Corp | S3994-01 | Diodo PIN de silício com grande área (10 x 10 cm2). Outros diodos com grande área e baixa capacitância podem ser usados. |
| Divisor de feixe polarizador | Union Optic | PBS9025-620-1000 | Divisor de feixe polarizador de banda |
| larga Banco de dados | refractiveindex.info | ||
| Retrorrefletor | Edmund Optics | 34-408 | BBAR Prisma de ângulo reto. Outros prismas ou retrorrefletores podem ser usados. |
| Minicircuitos | amplificador de potência RF | ZHL-1-2W + | bloco de ganho, 5 - 500 MHz, 50 e ômega; |
| Espelhos de varredura | Cambridge Technologies | 6215H | Usamos um conjunto de espelhos de 5 mm com revestimento prateado |
| ScanImage | Vidrio | ScanImage Basic | Software de controle de microscópio de varredura a laser |
| Filtro Shortpass | THORLABS | FESH1000 | Filtro Shortpass Premium de 25,0 mm, Comprimento de onda de corte: 1.000 nm. Para uma supressão eficiente dos Stokes, dois filtros podem ser necessários. |
| Microscópio vertical | Nikon | Eclipse FN1 | Qualquer outra estrutura de microscópio pode ser usada. Se um microscópio de varredura a laser estiver disponível, ele pode ser usado diretamente. Caso contrário, um scanner galvo e uma lente de varredura precisavam ser adicionados ao microscópio. |
| Objetiva de imersão em água | Olympus | XLPLN25XWMP2 | A objetiva multifotônica 25X tem um NA de 1,05. Outros objetivos semelhantes podem ser usados. |
Referências
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
- Cui, M., Zhang, D. Y. Artificial intelligence and computational pathology. Laboratory Investigation. ....
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Reimpressões e permissões
