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Artigo de método

Decifrando o Mecanismo Molecular da Montagem de Histonas pela Técnica de Cortina de DNA

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DOI:

10.3791/63501

⸱

9 de março de 2022

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Ulsan National Institute of Science and Technology, 2Center for Genomic Integrity, Institute for Basic Science (IBS)

Neste artigo

Resumo

A cortina de DNA, uma técnica de imagem de molécula única de alto rendimento, fornece uma plataforma para visualização em tempo real de diversas interações proteína-DNA. O presente protocolo utiliza a técnica de cortina de DNA para investigar o papel biológico e o mecanismo molecular de Abo1, uma Schizosaccharomyces pombe contendo bromodomínio AAA+ ATPase.

Resumo

A cromatina é uma estrutura de ordem superior que empacota o DNA eucariótico. A cromatina sofre alterações dinâmicas de acordo com a fase do ciclo celular e em resposta a estímulos ambientais. Essas alterações são essenciais para a integridade genômica, regulação epigenética e reações metabólicas do DNA, como replicação, transcrição e reparo. A montagem da cromatina é crucial para a dinâmica da cromatina e é catalisada por chaperonas de histonas. Apesar de extensos estudos, os mecanismos pelos quais as chaperonas de histonas permitem a montagem da cromatina permanecem indefinidos. Além disso, as características globais dos nucleossomos organizados por chaperonas de histonas são pouco compreendidas. Para resolver esses problemas, este trabalho descreve uma técnica única de imagem de molécula única chamada cortina de DNA, que facilita a investigação dos detalhes moleculares da montagem de nucleossomos por chaperonas de histonas. A cortina de DNA é uma técnica híbrida que combina fluidez lipídica, microfluídica e microscopia de fluorescência por reflexão interna total (TIRFM) para fornecer uma plataforma universal para imagens em tempo real de diversas interações proteína-DNA. Usando cortina de DNA, a função de chaperona de histona de Abo1, a Schizosaccharomyces pombe bromodomain-containing AAA+ ATPase, é investigada, e o mecanismo molecular subjacente à montagem de histonas de Abo1 é revelado. A cortina de DNA fornece uma abordagem única para estudar a dinâmica da cromatina.

Introdução

O DNA eucariótico é empacotado em uma estrutura de ordem superior conhecida como cromatina 1,2. O nucleossomo é a unidade fundamental da cromatina, que consiste em aproximadamente 147 pb de DNA envolto em torno das histonas do núcleo octeramérica 3,4. A cromatina desempenha um papel crítico em células eucarióticas; por exemplo, a estrutura compacta protege o DNA de fatores endógenos e ameaças exógenas5. A estrutura da cromatina muda dinamicamente de acordo com a fase do ciclo celular e estímulos ambientais, e essas alterações controlam o acesso às proteínas durante transações de DNA, como replicação, transcrição e reparo6. A dinâmica da cromatina também é importante para a estabilidade genômica e informações epigenéticas.

A cromatina é regulada dinamicamente por vários fatores, incluindo modificações na cauda de histonas e organizadores da cromatina, como remodeladores de cromatina, proteínas do grupo policomb e chaperonas de histonas7. As chaperonas de histonas coordenam a montagem e desmontagem de nucleossomos via deposição ou descolamento de histonas centrais 8,9. Defeitos nas chaperonas de histonas induzem instabilidade do genoma e causam distúrbios do desenvolvimento e câncer 9,10. Várias chaperonas de histonas não necessitam de consumo de energia química, como hidrólise de ATP, para montar ou desmontar nucleossomos 9,11,12,13. Recentemente, pesquisadores relataram que AAA+ contendo bromodomínio (ATPase associada a diversas atividades celulares) ATPases desempenham um papel na dinâmica da cromatina como chaperonas de histonas 14,15,16,17. A ATAD2 humana (ATPase family AAA domain-containing protein 2) promove a acessibilidade da cromatina para aumentar a expressão gênica18. Como co-regulador transcricional, o ATAD2 regula a cromatina dos fatores transcricionais oncogênicos14, e a superexpressão de ATAD2 está relacionada ao mau prognóstico em muitos tipos de câncer19. Yta7, o homólogo de Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) de ATAD2, diminui a densidade nucleossômica na cromatina15. Em contraste, Abo1, o Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) homólogo de ATAD2, aumenta a densidade nucleossômica16. Usando uma técnica única de imagem de molécula única, a cortina de DNA, se Abo1 contribui para a montagem ou desmontagem do nucleossomoé abordada 17,20.

Tradicionalmente, as propriedades bioquímicas de biomoléculas têm sido examinadas por experimentos em massa, como o ensaio de deslocamento da mobilidade eletroforética (EMSA) ou a co-imunoprecipitação (co-IP), nos quais um grande número de moléculas é sondado e suas propriedades médias sãocaracterizadas21,22. Em experimentos em massa, os sub-estados moleculares são velados pelo efeito ensemble-average, e a sondagem de interações biomoleculares é restrita. Em contraste, técnicas de molécula única contornam as limitações dos experimentos em massa e permitem a caracterização detalhada das interações biomoleculares. Em particular, técnicas de imagem de molécula única têm sido amplamente utilizadas para estudar interações DNA-proteína e proteína-proteína23. Uma dessas técnicas é a cortina de DNA, uma técnica única de imagem de molécula única baseada em microfluídica e microscopia de fluorescência por reflexão interna total (TIRFM)24,25. Em uma cortina de DNA, centenas de moléculas individuais de DNA estão ancoradas à bicamada lipídica, o que permite o movimento bidimensional das moléculas de DNA devido à fluidez lipídica. Quando o fluxo hidrodinâmico é aplicado, as moléculas de DNA se movem ao longo do fluxo na bicamada e ficam presas em uma barreira de difusão, onde são alinhadas e esticadas. Enquanto o DNA é corado com agentes intercalantes, proteínas fluorescentemente marcadas são injetadas, e o TIRFM é usado para visualizar interações proteína-DNA em tempo real em nível de moléculaúnica 23. A plataforma de cortina de DNA facilita a observação de movimentos de proteínas como difusão, translocação e colisão 26,27,28. Além disso, a cortina de DNA pode ser utilizada para mapeamento de proteínas no DNA com posições, orientações e topologias definidas ou aplicada ao estudo da separação de fases de proteínas e ácidos nucléicos 29,30,31.

Neste trabalho, a técnica de cortina de DNA é usada para fornecer evidências da função de chaperonas através da visualização direta de proteínas específicas. Além disso, como a cortina de DNA é uma plataforma de alto rendimento, ela facilita uma extensão de coleta de dados suficiente para a confiabilidade estatística. Aqui, descreve-se como conduzir o ensaio de cortina de DNA em detalhes para investigar o papel molecular de S. pombe bromodomain contendo AAA+ ATPase Abo1.

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Protocolo

1. Preparação da célula de fluxo

  1. Prepare uma lâmina de sílica fundida limpa contendo padrões de nano-trincheira seguindo o relatório25 publicado anteriormente.
    1. Faça dois furos com 1 mm de diâmetro em uma lâmina de sílica fundida limpa (Figura 1A) usando uma broca revestida de diamante (consulte a Tabela de Materiais).
    2. Deposite 250 nm de alumínio espesso (Al) na lâmina usando a pulverização DC32 (ver Tabela de Materiais) com 10 mTorr de gás argônio.
    3. Spin-coat uma camada de 310 nm de espessura de 4% 950K poli(metacrilato de metila) (PMMA) (ver Tabela de Materiais) a 4.000 rpm por 1 min e asse em uma placa quente a 180 °C por 3 min.
    4. Desenhe os padrões de nano-trincheiras na camada de PMMA entre os dois furos usando litografia de feixe de elétrons (ebeam)33 com corrente de 0,724 nA a 80 kV.
      NOTA: A arquitetura e as dimensões dos padrões de nano-trincheira são mostradas na Figura 1A.
    5. Remova o PMMA exposto ao feixe mergulhando as lâminas na solução reveladora (proporção 1:3 de metilisobutilcetona e isopropanol, ver Tabela de Materiais) por 2 minutos.
    6. Camadas de Etch Al com corrosão iônica reativa a plasma indutivamente acoplado (ICP-RIE) usando cloro (Cl2) e tricloreto de boro (BCl3).
      NOTA: Estes dois gases podem remover o Al das áreas expostas ao feixe.
    7. Esculpir nano-trincheiras nas lâminas usando tetrafluoreto de enxofre (SF4), tetrafluorometano (CF4) e gases de oxigênio (O2) (ver Tabela de Materiais).
    8. Remova a camada de Al restante mergulhando os slides em Al etchant (desenvolvedor AZ 300 MIF, consulte Tabela de Materiais) por 10 minutos.
    9. Após a fabricação, enxaguar as lâminas com água deionizada e sonicar em acetona por 30 min usando um sonicador tipo banho.
    10. Limpe as lâminas em solução de Hellmanex III a 2% (ver Tabela de Materiais) durante pelo menos 1 dia com agitação magnética.
    11. Sonicar as lâminas em acetona por 30 min e NaOH 1 M por 30 min sucessivamente.
    12. Enxaguar as lâminas com água deionizada e secar com um gás nitrogênio (N2).
  2. Coloque um papel limpo (5 mm x 35 mm) no centro da fita dupla face. Fixe a fita sobre a lâmina para cobrir os dois orifícios e os nanopadrões com o papel.
  3. Excique o papel usando uma lâmina limpa (Figura 1A).
  4. Coloque uma tampa de vidro em cima da fita dupla face e esfregue a lamínula usando uma ponta de pipeta para formar uma câmara microfluídica (Figura 1A).
  5. Coloque a célula de fluxo montada entre duas lâminas de microscópio e prenda-as.
  6. Asse a célula de fluxo em forno a vácuo a 120 °C por 45 min.
  7. Conecte o conector de fluido (Nanoport) para as análises baseadas em chips (consulte Tabela de Materiais) a cada orifício aberto usando uma pistola de cola quente e conecte as duas linhas de tubulação Luer lock.
  8. Conecte uma seringa Luer lock contendo 3 mL de água deionizada e lave a câmara.
  9. Lavar a câmara com 3 mL de tampão lipídico (20 mM de Tris-HCl, pH 8,0 e 100 mM de NaCl) através da conexão gota-a-gota.
    NOTA: A conexão gota a gota liga todas as seringas à célula de fluxo para evitar a injeção de bolhas de ar na câmara.
  10. Injetar 1 mL de lipídio biotinilado 0,04x em tampão lipídico na câmara em dois disparos com 5 min de incubação por disparo.
    NOTA: A preparação de 1x estoque lipídico biotinilado é descrita em um relatório publicado anteriormente34.
  11. Lavar a câmara com 3 mL de tampão lipídico e incubar por 20 min para que a bicamada lipídica seja maturada na superfície da lâmina.
  12. Adicionar 1 mL de tampão BSA (40 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM de NaCl, 2 mM de MgCl2 e 0,2 mg/mL de BSA) e incubar por 5 min para passivar a superfície da lâmina.
    NOTA: Esta etapa pode reduzir a ligação inespecífica de proteínas à superfície da lâmina.
  13. Injetar 0,025 mg/mL de estreptavidina em 1 mL de tampão BSA com duas doses e 10 min de incubação por injeção.
  14. Lavar a estreptavidina residual com 3 ml de tampão BSA.
  15. Injetar ~300 pM (30 μL) de DNA de fagos lambda biotinilados em 1 mL de tampão BSA na câmara com dois tiros e 10 min de incubação por disparo.
    NOTA: A preparação de DNA lambda biotinilado é descrita em um relatório publicado anteriormente34.

2. Conectando a célula de fluxo ao sistema microfluídico e carregando-a no microscópio

  1. Preparar tampão de imagem Abo1 (50 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM de NaCl, 1 mM de TDT, 1 mM de ATP, 2 mM de MgCl2, 1,6% de glicose e 0,1x de gloxy, ver Tabela de Materiais).
    NOTA: Gloxy é um sistema de sequestro de oxigênio que reduz o fotobranqueamento de corantes fluorescentes. A preparação de estoque de gloxy 100x com glicose oxidase e catalase é descrita na referência35.
  2. Conecte uma seringa contendo 10 mL de tampão de imagem a uma bomba de seringa e remova as bolhas em todas as linhas de tubulação no sistema microfluídico.
  3. Acoplar a célula de fluxo preparada com o sistema microfluídico através de conexão gota-gota para evitar a injeção de bolhas na célula de fluxo (Figura 1B).
  4. Monte a célula de fluxo e os suportes de célula de fluxo e monte o conjunto em um microscópio TIRF personalizado (Figura 1C).
    CUIDADO: Quando a célula de fluxo for colocada sob o microscópio, ajuste cuidadosamente a altura da lente objetiva. A célula de fluxo não deve tocar na lente objetiva. Isso pode danificar a lente.
  5. Índice de queda de óleo correspondente no centro da célula de fluxo e coloque um prisma de pomba feito sob medida (consulte Tabela de Materiais) na gota de óleo.

3. Montagem de Histone por Abo1 usando cortina de DNA

  1. Misturar 5 nM de Abo1 e 12,5 nM de dímero de histona H3-H4 marcado com Cy5 (Cy5-H3-H4) (ver Tabela de Materiais) em 150 μL de tampão de imagem. Todas as proteínas foram preparadas seguindo relato publicado anteriormente17.
  2. Incubar a mistura no gelo por 15 min.
    OBS: Para evitar o fotoclareamento do Cy5, a incubação deve ser feita no escuro.
  3. Injetar ~20 pM (2 μL) de corante YOYO-1 em tampão de imagem através de uma alça de amostra de 100 μL para corar moléculas de DNA lambda.
  4. Execute o software de imagem (consulte a Tabela de Materiais) e ligue o laser de 488 nm para verificar se as cortinas de DNA estão bem formadas.
    NOTA: Se as cortinas de DNA são bem formadas, as moléculas de DNA, que são coradas com YOYO-1, são mostradas como linhas alinhadas em uma barreira na presença de fluxo. As linhas esticadas recuam e se difundem para longe da barreira quando o fluxo é desligado.
  5. Injetar 2 mL de tampão salino alto (200 mM de NaCl e 40 mM de MgCl2) para eliminar o corante YOYO-1 do DNA.
  6. Após a remoção do corante YOYO-1, injete a amostra de proteína pré-incubada.
  7. Quando as proteínas atingirem a cortina de DNA, desligue a bomba da seringa, desligue a válvula de desligamento e incube 15 min para carregamento de histona por Abo1.
  8. Lave as proteínas Abo1 e histonas não ligadas por 5 min.
  9. Ligue a válvula de desligamento e retome a injeção de fluxo.
  10. Ligue o laser de 637 nm e obtenha imagens das proteínas fluorescentes enquanto o fluxo tampão está ligado.
  11. Desligue transitoriamente o fluxo tampão para verificar se as proteínas de histonas estão carregadas no DNA (Figura 2C).
  12. Coletar imagens de cortina de DNA com um programa de aquisição de imagens (ver Tabela de Materiais).
    NOTA: Quando o fluxo tampão pára transitoriamente, o DNA recua para fora do campo evanescente de reflexão interna total, e as proteínas fluorescentemente marcadas ligadas ao DNA desaparecem.

4. Análise dos dados

  1. Transformar as imagens obtidas pelo programa de aquisição de imagens em formato TIFF como sequências de imagens.
    OBS: Todos os dados foram analisados utilizando-se a Imagem J (NIH) conforme descrito na Referência20.
  2. Escolha uma única molécula de DNA das sequências de imagem e desenhe um quimógrafo.
    NOTA: O quimógrafo pode mostrar a mudança na intensidade de fluorescência de cada proteína de histona ligada a uma única molécula de DNA em função do tempo.
  3. Crie o perfil de intensidade de fluorescência a partir do quimógrafo e encaixe-o com múltiplas funções gaussianas.
  4. Coletar as coordenadas centrais dos picos do perfil de intensidade de fluorescência. Nesta etapa, pode-se obter a intensidade mínima de fluorescência de histonas.
  5. Divida todas as intensidades de pico coletadas dos perfis pela intensidade mínima. O número de dímeros H3-H4 ligados ao DNA é estimado nesta etapa.
  6. Execute as etapas 4.2-4.5 para outras moléculas de DNA.
  7. Crie um histograma para a distribuição de ligação de dímeros H3-H4 com tamanho de compartimento de 1 kbp. O número de moléculas analisadas é de pelo menos 300.

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Resultados

Este trabalho descreve o procedimento de preparação de células de fluxo para o ensaio de cortina de DNA (Figura 1A). O ensaio de cortina de DNA facilitou o estudo da montagem de dímeros de histona H3-H4 no DNA por Abo1. Primeiro, a formação de cortinas de DNA foi verificada pela coloração de moléculas de DNA com YOYO-1, um corante intercalante. Linhas verdes foram mostradas em arranjos paralelos, indicando que YOYO-1 intercalou em moléculas de DNA, que estavam bem alinhadas e esticadas em um...

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Discussão

Como uma técnica de imagem de molécula única, a cortina de DNA tem sido usada extensivamente para sondar reações metabólicas do DNA43. A cortina de DNA é um sistema híbrido que concatena fluidez lipídica, microfluídica e TIRFM. Ao contrário de outras técnicas de molécula única, a cortina de DNA permite a visualização em tempo real de alto rendimento das interações proteína-DNA. Portanto, a técnica de cortina de DNA é adequada para investigar o mecanismo por trás das interações moleculares, incluin...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Os autores agradecem o apoio gentil para Abo1 e Cy5-H3-H4 pelo Professor Ji-Joon Song, Carol Cho, Ph.D., e Juwon Jang, Ph.D., em KAIST, Coreia do Sul. Este trabalho é apoiado pela National Research Foundation Grant (NRF-2020R1A2B5B01001792), pelo fundo de pesquisa intramuros (1.210115.01) do Ulsan National Institute of Science and Technology e pelo Institute for Basic Science (IBS-R022-D1).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Seringa luer-lock de 1 mLBecktonDickinson301321
vidro de lâmina de silca fundida de 1' x 3'G. FinkenbeinerSeringa de 1 polegada x 3 polegadas retangular e 1 mm
de espessura 10 mL seringa luer-lockBecktonDickinson302149
18:1 (Δ 9-Cis) PC (DOPC)Avanti850375Este é um componente do estoque de lipídios biotinilados
18:1 Tampa de biotinil PEAvanti870273Este é um componente do estoque de lipídios biotinilados
18:1 PEG2000 PEAvanti880130Este é um componente do estoque de lipídios biotinilados
Seringa Luer-lock de 3 mLBecktonVálvulade injeção de amostra de 6
IDEXMX série II
950K PMMAAll-resist671.04
AcetonaSAMCHUNA1759
Adenosina 5'-trifosfato de sal dissódico hidratado (ATP)SigmaA2383
Alumínio (Al)TASCO, Coreia do SulLT50AI414Diâmetro 4 polegadas, espessura 1/4 polegada
Filtro centrífugo Amicon Ultra, MWCO 10 kDaMilliporeZ648027
AmpicilinaMbcellMB-A4128Antibióticos
AZ 300 MIF desenvolvedorMerck10454110521Usado para remover alumínio
LâminaDORCODN5212 mm x 6 m
Tricloreto de boro (BCl3)UNIONGASPureza: >99,99%
Albumina de soro bovino (BSA)SigmaA7030
CatalaseSigmaC40-1gEste é um componente de 100x gloxy stock
Cloro (Cl2)UNIONGASPureza: >99.99%
Fita dupla face transparente3M313770
D-(+)-glicoseSigmaG7528
DC sputterSoronaSRM-120Usado para deposição de alumínio em uma lâmina
Broca revestida de diamanteEurotoolDIB-211.00Usado para fazer furos em uma lâmina de sílica fusced
DL-Dithiothreitol (DTT)SigmaD0632
Dove-prismKorea Electro-Optics Co., Ltd.1906-106Prisma de pomba de sílica fundida feito sob medida com revestimento antirreflexo
BrocaDremelDremel 3000Usado para fazer furos em uma lâmina de sílica fusced
Electron Bean LithographyNanobeam Ltd.NB3
Ácido etileno-diamina-tetracético (EDTA)SigmaEDS-1KG
Conexões à prova de dedosIDEXF-300É conectado com "PFA Tubing Natural" para formar tubulação luer-lock
Porca macho sem flangeIDEXP-235É conectado com "PFA Tubing Natural" para formar tubulação luer-lock
Liofilizador, HyperCOOLLabogeneHC3110Usado para liofilizar proteínas líquidas
Glicose oxidaseSigmaG2133-50KUEste é um componente de 100x gloxy estoque
Cloridrato de guanidínioAcros Organics364790025
seringa HamiltonCompany80065Esta seringa é usada para injeção de amostra
Hellmanex IIISigmaZ805939
HiLoad 26/600 SuperdexTM 200 pgCytiva28-9893-36Usado para FPLC (exclusão de tamanho)
Agitador de placa quenteCorningPC-420D
Ácido clorídricoSigmaH1759Usado para Tris-HCl
Índice de óleo correspondenteZEISS444970-9000-000
Gravação de íons reativos de plasma indutivamente acopladaTop Technology Ltd.FabStar
Isopropil β-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG)Glentham Life SciencesGC6586-100gUsado para indução de atividade de β-galactosidase
Lambda phage DNANEBN0311
LB caldoBD difco244610Mídia para crescimento de células E.coli
Adaptador Luer 10-32IDEXP-659Isso conecta luer-lock seringa e tubo
Cloreto de magnésio hexahidratadofisher biorreagentesBP214
Metil isobutilcetona (MIBK)KAYAKU MATERIAISUsado para desenvolver solução
Microscópio (Eclipse Ti2)NikonEclipse Ti2Microscópio de fluorescência invertida
Microscópio lamínula de vidro do microscópioMARIENFELD10114222 x 50 mm (Nº 1)
Lâmina de microscópioDURAN GROUPDU.2355013Lâmina de vidro 45°, lisa 26 x 76 mm
NanoportIDEXN-333-01
Lente objetivaNikonCFI Plan Apochromat VC 60XC WITipo de imersão: água, ampliação: 60x, correção: 18, distância de trabalho: 0,29 (0,31-0,28)
One Shot BL21 (DE3)pLysS E. coli quimicamente competenteThermo Fisher ScientificC6060-03Célula competente para superexpressão de proteínas
Oxigênio (O2)NOBLEGAS, CoreiaPureza: >99,99%
PFA tubulação naturalIDEX1512LEle é conectado com "Conexões Fingertight" para formar tubulação luer-lock
Fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF)Roche11359061001Inibidor
de proteaseSephacryl S-200 Cytiva de alta resolução17-0584-01Usado para FPLC (exclusão de tamanho)
Válvula de corteIDEXP-732
Acetato de sódioSigma791741
Cloreto de sódio (NaCl)SigmaS3014
Hidróxido de sódio (NaOH)Sigmas5881
Espectros / Por tubulação de membrana molecularporosa, MWCO 6-8 kDaSpectrum laboratories132660
EstreptavidinThermo Fisher ScientificS888
Tetrafluoreto de enxofre (SF4)NOBLEGAS, CoreiaPureza: >99,99%
Bomba de seringaKD Scientific78-8210
Tetrafluorometano (CF4)NOBLEGAS, CoreiaPureza: >99,99%
TritonX-100SigmaT9284
Base TrizmaSigmaT1503Usado para Tris-HCl
TSKgel SP-5PWTOSOH14715Usado para FPLC (troca iônica)
União montagemIDEXP-760Isso conecta tubulações
UreiaSigmaU5378
Forno a vácuoJeio TechOV-11
YOYO-1Thermo Fisher ScientificY3601Este corante de intercalação é diluído em DMSO
β -mercaptoetanol (BME)SigmaM6250
vias Dickinson 302832 AVANÇADOS do Sul do Sul do Sul

Referências

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