O artigo explica como remover cirurgicamente os olhos das larvas vivas de zebrafish como o primeiro passo para investigar como a entrada da retina influencia o crescimento e o desenvolvimento do tectum óptico. Além disso, o artigo fornece informações sobre anestesia larval, fixação e dissecção cerebral, seguida de imunohistoquímica e imagem confocal.
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Artigo de método
Remoção de olhos em larvas de zebrafish vivos para examinar o crescimento e desenvolvimento dependentes da inervação do sistema visual
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os zebrafish exibem notável crescimento ao longo da vida e habilidades regenerativas. Por exemplo, nichos especializados de células-tronco estabelecidos durante a embriogênese suportam o crescimento contínuo de todo o sistema visual, tanto no olho quanto no cérebro. O crescimento coordenado entre a retina e o tectum óptico garante um mapeamento retinotópico preciso à medida que novos neurônios são adicionados nos olhos e no cérebro. Para abordar se os axônios da retina fornecem informações cruciais para a regulação de comportamentos tectal e células progenitoras, como sobrevivência, proliferação e/ou diferenciação, é necessário ser capaz de comparar lóbulos tectal inervados e denervados dentro do mesmo animal e entre animais.
A remoção cirúrgica de um olho de zebrafish larval vivo seguida da observação do tectum óptico atinge esse objetivo. O vídeo que acompanha demonstra como anestesiar larvas, afiar eleticamente agulhas de tungstênio e usá-las para remover um olho. Em seguida, mostra como dissecar cérebros de larvas de zebrafish fixas. Finalmente, o vídeo fornece uma visão geral do protocolo de imunohistoquímica e uma demonstração de como montar embriões manchados em agarose de ponto de baixa fusão para microscopia.
Introdução
O objetivo deste método é investigar como a entrada da retina influencia o crescimento e o desenvolvimento do tectum óptico, o centro de processamento visual no cérebro de zebrafish. Removendo um olho e, em seguida, comparando os dois lados do tectum óptico, alterações tectal dentro do mesmo espécime podem ser observadas e normalizadas, permitindo a comparação entre vários espécimes. Abordagens moleculares modernas combinadas com esta técnica produzirão insights sobre os mecanismos subjacentes ao crescimento e desenvolvimento do sistema visual, bem como a degeneração e regeneração axonal.
Sistemas sensoriais - visuais, auditivos e somatosen....
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Protocolo
Os métodos deste artigo foram conduzidos de acordo com as diretrizes e aprovação dos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais da Reed College e university College London. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre as cepas de zebrafish utilizadas neste estudo.
1. Prepare materiais e ferramentas
- Faça soluções.
- Faça o embrião médio (E314) diluindo um estoque de 60x (300 mM NaCl, 10,2 mM KCl, 20 mM CaCl 2-dihidrato e 20 mM MgCl2-hexahidrato em água desionizada, autoclavada e armazenada à temperatura ambiente). Adicione 160....
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Resultados
Para confirmar se a remoção dos olhos foi completa e avaliar como o tectum óptico muda, foram realizadas cirurgias na cepa Tg[atoh7:RFP], que rotula todas as RGCs com um RFP direcionado à membrana e, assim, todos os axônios que projetam a partir da retina e formam o nervo óptico24. Embora o uso dessa cepa não seja absolutamente necessário, permite a observação e visualização direta do nervo óptico termini no neuropil tectum óptico. Outras abordagens para rotular o nervo óptico, como o tra.......
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Discussão
As técnicas descritas neste artigo ilustram uma das muitas abordagens para estudar o desenvolvimento de sistemas visuais de vertebrados em zebrafish. Outros pesquisadores publicaram métodos para dissecar a retina embrionária e realizar análises de expressão genética19 ou visualizar a atividade neuronal no tectumóptico 30. Este artigo fornece uma abordagem para explorar como a entrada diferencial da retina pode influenciar os comportamentos celulares no tectum óptico.
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Agradecimentos
O financiamento para este trabalho foi apoiado principalmente por fundos inativos da Reed College para a KLC, fundos da Helen Stafford Research Fellowship para a OLH, e uma Reed College Science Research Fellowship para yk. Este projeto começou no laboratório de Steve Wilson como uma colaboração com a HR, que foi apoiada por uma Wellcome Trust Studentship (2009-2014). Agradecemos a Máté Varga, Steve Wilson e outros membros do laboratório Wilson pelas discussões iniciais sobre este projeto, e agradecemos especialmente a Florencia Cavodeassi e Kate Edwards, que foram as primeiras a ensinar a KLC como montar embriões em agarose e realizar dissecções cerebrais de zebrafish....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Equipamentos e suprimentos: | |||
| Caixas de criação | Aquaneering | ZHCT100 | |
| graxa de alto vácuo Dow Corning | Sigma ou fornecedor equivalente | Z273554 | |
| frascos Erlenmeyer (125 mL) | Para fazer Marc's Modified Ringers (MMR) com antibióticos para incubação pós-cirúrgica. | ||
| Pinça fina - Dumont #5 | Fine Science Tools (FST) | 11252-20 | |
| Pipetas de vidro Pasteur | DWK Lifescience | 63A53 & 63A53WT | Para pipetagem de embriões e larvas. |
| Lâminas de vidro para microscopia | VWR ou fornecedor equivalente | 48311-703 | As lâminas de microscópio de vidro padrão podem ser encomendadas a muitos fornecedores de laboratórios diferentes. |
| Vidraria, incluindo garrafas graduadas e cilindros | Para fazer e armazenar soluções. | ||
| Resina epóxi de 2 partes | ACE Hardware ou outro fornecedor equivalente de Gorilla Glue ou | seringa equivalente de 0,85 oz | https://www.acehardware.com/departments/paint-and-supplies/tape-glues-and-adhesives/glues-and-epoxy/1590793 |
| tubo de microcentrífuga (1,7 mL) | VWR ou fornecedor equivalente | 22234-046 | |
| Suporte de pino niquelado (17 cm de comprimento) | Fine Science Tools (FST) | 26018-17 | Para segurar o fio de tungstênio enquanto afia e realiza cirurgias / dissecações. |
| Filtro de chá de malha de nylon ou equivalente | Ali Express ou equivalente | Para a colheita de ovos de peixe-zebra após a desova; https://www.aliexpress.com/item/1005002219569756.html | |
| Clipe | para dispositivo de afiação de agulha de tungstênio. | ||
| Placas de Petri 100 mm | Fischer Scientific ou fornecedor equivalente | 50-190-0267 | |
| Placas de Petri 35 mm | Fischer Scientific ou fornecedor equivalente | 08-757-100A | |
| Bomba de pipeta | SP Bel-Art ou equivalente | F37898-0000 | |
| Hidróxido de potássio (KOH) | Sigma | 909122 | Para dispositivo de afiação de agulha de tungstênio. Faça uma solução a 10% p/v de KOH no exaustor adicionando pellets à água deionizada. |
| Fonte de alimentação (tensão variável) | Para dispositivo de afiação de agulha de tungstênio. Qualquer fonte de alimentação com tensão variável funcionará (mesmo uma usada para eletroforese em gel). | ||
| Sylgard 184 Kit de elastômero | Dow Corning | 3097358 | |
| Fio de tungstênio (0,125 mm de diâmetro) | World Precision Instruments (WPI) | TGW0515 | Afie para remover o olho e dissecar as larvas. |
| Bloco de calor de temperatura variável | O Lab Depot ou fornecedor equivalente | BSH1001 ou BSH1002 | Definido para 40-42 ° C à frente dos experimentos. |
| Frasco de vidro de boca larga com tampa (por exemplo, geléia limpa ou frasco de salsa) | Para dispositivo de afiação de agulha de tungstênio. | ||
| Fios com cabos | Para dispositivo de afiação de agulha de tungstênio. | ||
| Microscópios: | |||
| mas é preferível ter luz transmitida ajustável em uma base espelhada. | |||
| confocal de varredura a laser | Recomenda-se lente objetiva de imersão em água de alta NA, 20-25x. O software de controle de microscópio e captura de imagem (NIS-Elements da Nikon) é usado aqui, mas qualquer microscópio confocal funcionará. | ||
| Reagentes para cirurgias e dissecções: | |||
| Cloreto de cálcio di-hidratado | Sigma | C7902 | para anéis modificados de Marc (MMR) e meio embrionário (E3). |
| HEPES | Sigma | H7006 | Para Toques Modificados de Marc (MMR). |
| Baixo ponto de fusão agarose | Invitrogen | 16520-050 | Faça 1% em meio embrionário (E3) ou Marc's Modified Ringers (MMR). |
| Cloreto de magnésio hexahidratado | Sigma | 1374248 | Para meio embrionário (E3). |
| Sulfato de magnésio | Sigma | M7506 | para anéis modificados de Marc (MMR). |
| Ciências de Microscopia Eletrônica | de Paraformaldeído | 19210 | Diluir 8% (p / v) com 2x PBS concentrado (diluído de 10x estoque de PBS). |
| Penicilina / estreptomicina | Sigma | P4333-20ML | diluir 1:100 em toques modificados de Marc. |
| Comprimidos de solução salina tamponada com fosfato (PBS) | Diagnostic BioSystems | DMR E404-01 | Faça 10x estoque em água deionizada, autoclave e armazene em temperatura ambiente. Diluir para 1x a concentração de trabalho. |
| Cloreto de potássio | Sigma | P3911 | para anéis modificados de Marc (MMR) e meio embrionário (E3). |
| Cloreto de sódio | Sigma | S9888 | Para Ringers modificados por Marc (MMR) e meio embrionário (E3). |
| Hidróxido de sódio | Sigma | S5881 | Faça 10 M e use para ajustar o pH do MMR para 7,4. |
| Sacarose | Sigma | S9378 | |
| Tricaine-S | Pentair | 100G #TRS1 | Receita: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE |
| Reagentes para imuno-histoquímica: | |||
| Alexafluor 568 marcado Anticorpo secundário para detectar IgG de coelho | Invitrogen | A-11011 | Use na diluição de 1:500 para montagem integral imuno-histoquímica. |
| DAPI ou ToPro3 | Invitrogen | 1306 ou T3605 | Compõem soluções de 1 mg / mL em DMSO; diluição 1: 5.000 para contracoloração. |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma | D8418 | Um componente do tampão imunobloqueio. |
| Metanol (MeOH) | Sigma | 34860 | A mistura de MeOH com soluções aquosas como PBST é exotérmica. Faça as soluções MeOH/PBST com pelo menos várias horas de antecedência ou resfrie-as no gelo antes de usar. |
| Soro de cabra normal | ThermoFisher Scientific | 50-062Z | Um componente do tampão imunobloqueio. Pode ser aliquotado em volumes de 1-10 mL e armazenado a -20 °C. |
| Anticorpo primário para detectar fosfohistona H3 | Millipore | 06-570 | Use na diluição de 1:300 para imuno-histoquímica total. |
| Anticorpo primário para detectar a proteína fluorescente vermelha (RFP; detecta derivados dsRed) | MBL International | PM005 | Use na diluição de 1:500 para imuno-histoquímica total. |
| Proteinase K (PK) | Sigma | P2308-10MG | Fazer 10 mg/mL de soluções estoque em PBS e usar a 10 µ g/mL. |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Útil para fazer uma solução de estoque de 20% (v / v) em PBS. |
| Software para análise de dados | |||
| ImageJ (Fiji) | Freeware para análise de imagens; https://imagej.net/software/fiji/ | ||
| RStudio | Freeware para análise estatística e visualização de dados; https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ | ||
| Adobe Photoshop ou GIMP | Softwares proprietários de processamento de imagem (Adobe Photoshop e Illustrator) são frequentemente usados para compor figuras). Uma alternativa freeware é o Gnu Image Manipulation Program (GIMP; https://www.gimp.org/) | ||
| Zebrafish strains. Este estudo utilizou as cepas AB, TU, Tg[atoh7:RFP]. | Disponível no Centros Internacionais de Recursos do Peixe-Zebra nos EUA (https://zebrafish.org/home/guide.php) ou na Europa (https://www.ezrc.kit.edu/). Cepas transgênicas especializadas que ainda não foram depositadas em nenhum dos centros de recursos podem ser solicitadas a laboratórios individuais após a publicação. |
Referências
- Butler, A. B., Hodos, W. Optic tectum. Comparative Vertebrate Neuroanatomy: Evolution and Adaptation. , John Wiley & Sons, Inc. 311-340 (2005).
- Cang, J., Feldheim, D. A. Developmental mechanisms of topographic map formation and alignment. Annual Review of Neuroscience. 36
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Reimpressões e permissões
