Este artigo detalha como realizar a miografia de impedância elétrica in vivo (usando matrizes de eletrodos de superfície e agulha) e ex vivo (usando uma célula dielétrica) no músculo gastrocnêmio de roedores. Ele demonstrará a técnica em camundongos e ratos e detalhará as modificações disponíveis (ou seja, animais obesos, filhotes).
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Artigo de método
Realização de Miografia de Impedância Elétrica In Vivo e Ex Vivo em Roedores
Neste artigo
Resumo
Resumo
A miografia por impedância elétrica (EIM) é uma técnica conveniente que pode ser usada em estudos pré-clínicos e clínicos para avaliar a saúde e a doença do tecido muscular. O EIM é obtido aplicando uma corrente elétrica de baixa intensidade, direcionalmente focada, a um músculo de interesse em uma faixa de frequências (ou seja, de 1 kHz a 10 MHz) e registrando as tensões resultantes. A partir destes, vários componentes de impedância padrão, incluindo a reatância, resistência e fase, são obtidos. Ao realizar medições ex vivo no músculo excisado, as propriedades elétricas passivas inerentes do tecido, ou seja, a condutividade e a permissividade relativa, também podem ser calculadas. O MEI tem sido amplamente utilizado em animais e humanos para diagnosticar e rastrear alterações musculares em uma variedade de doenças, em relação à atrofia por simples desuso ou como medida de intervenção terapêutica. Clinicamente, o EIM oferece o potencial de rastrear a progressão da doença ao longo do tempo e avaliar o impacto das intervenções terapêuticas, oferecendo assim a oportunidade de encurtar a duração do ensaio clínico e reduzir os requisitos de tamanho da amostra. Como pode ser realizado de forma não invasiva ou minimamente invasiva em modelos animais vivos, bem como em humanos, o EIM oferece o potencial de servir como uma nova ferramenta translacional que permite o desenvolvimento pré-clínico e clínico. Este artigo fornece instruções passo a passo sobre como realizar medições de MEI in vivo e ex vivo em camundongos e ratos, incluindo abordagens para adaptar as técnicas a condições específicas, como para uso em filhotes ou animais obesos.
Introdução
A miografia por impedância elétrica (MEI) fornece um método poderoso para avaliar a condição muscular, potencialmente possibilitando o diagnóstico de distúrbios neuromusculares, o rastreamento da progressão da doença e a avaliação da resposta à terapia 1,2,3. Pode ser aplicado de forma análoga a modelos de doenças animais e humanos, permitindo uma tradução relativamente perfeita de estudos pré-clínicos para clínicos. As medições do EIM são facilmente obtidas usando quatro eletrodos posicionados linearmente, com os dois externos aplicando uma corrente elétrica indolor e fraca em uma faixa de frequências (geralmente entre 1 kHz e aproximadamente 2 MHz), e os dois internos registrando as tensões resultantes1. A partir dessas tensões, as características de impedância do tecido podem ser obtidas, incluindo a resistência (R), uma medida de quão difícil é para a corrente passar através do tecido, e a reatância (X) ou "carregabilidade" do tecido, uma medida relacionada à capacidade do tecido de armazenar carga (capacitância). A partir da reatância e resistência, o ângulo de fase (θ) é calculado através da seguinte equação: 
, fornecendo uma única medida de impedância somativa. Tais medições podem ser obtidas usando qualquer dispositivo de bioimpedância multifreqüência. Como as miofibras são essencialmente cilindros longos, o tecido muscular também é altamente anisotrópico, com corrente fluindo mais facilmente ao longo das fibras do que através delas 4,5. Assim, o EIM é frequentemente realizado em duas direções: com a matriz colocada ao longo das fibras, de modo que a corrente corre paralela a elas, e através do músculo, de modo que a corrente flui perpendicularmente a elas. Além disso, em medições ex vivo, onde um volume conhecido de tecido é medido em uma célula de medição de impedância, as propriedades elétricas inerentes do músculo (ou seja, a condutividade e a permissividade relativa) podem ser derivadas6.
O termo "distúrbios neuromusculares" define uma ampla gama de doenças primárias e secundárias que levam à alteração e disfunção muscular estrutural. Isso inclui esclerose lateral amiotrófica e várias formas de distrofia muscular, bem como alterações mais simples relacionadas ao envelhecimento (por exemplo, sarcopenia), atrofia por desuso (por exemplo, devido a repouso prolongado ou microgravidade) ou mesmo lesão7. Embora as causas sejam abundantes e possam se originar do neurônio motor, nervos, junções neuromusculares ou do próprio músculo, o EIM pode ser usado para detectar alterações precoces no músculo devido a muitos desses processos e para rastrear a progressão ou a resposta à terapia. Por exemplo, em pacientes com distrofia muscular de Duchenne (DMD), a MEI demonstrou detectar a progressão da doença e a resposta aos corticosteroides8. Trabalhos recentes também mostraram que o MEI é sensível a diferentes estados de desuso, incluindo a gravidade fracionada9, como seria experimentado na Lua ou em Marte, e os efeitos do envelhecimento10,11. Por fim, ao aplicar algoritmos preditivos e de machine learning ao conjunto de dados obtidos a cada medida (dados multifrequência e direcionais dependentes), torna-se possível inferir aspectos histológicos do tecido, incluindo tamanho da miofibra 12,13, alterações inflamatórias e edema 14, e tecido conjuntivo e teor de gordura 15,16.
Vários outros métodos não invasivos ou minimamente invasivos também são utilizados para avaliar a saúde muscular em humanos e animais, incluindo eletromiografia por agulha17 e tecnologias de imagem, como ressonância magnética, tomografia computadorizada e ultrassonografia18,19. No entanto, o EIM demonstra benefícios distintos em comparação com essas tecnologias. Por exemplo, a eletromiografia registra apenas as propriedades elétricas ativas das membranas miofibras e não as propriedades passivas e, portanto, não pode fornecer uma avaliação verdadeira da composição ou estrutura muscular. Em certo aspecto, os métodos de imagem estão mais intimamente relacionados com o EIM, pois também fornecem informações sobre a estrutura e a composição do tecido. Mas, em certo sentido, eles fornecem muitos dados, exigindo segmentação detalhada de imagens e análise de especialistas, em vez de apenas fornecer uma saída quantitativa. Além disso, dadas as suas complexidades, as técnicas de imagem também são muito impactadas pelas especificidades do hardware e do software que estão sendo usados, idealmente exigindo o uso de sistemas idênticos para que os conjuntos de dados possam ser comparados. Em contraste, o fato de o EIM ser muito mais simples significa que ele é menos impactado por essas questões técnicas e não requer nenhuma forma de processamento de imagem ou análise especializada.
O protocolo a seguir demonstra como realizar EIM in vivo em ratos e camundongos, usando técnicas não invasivas (matriz de superfície) e minimamente invasivas (matriz de agulhas subdérmicas), bem como EIM ex vivo em músculo recém-excisado.
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Protocolo
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Beth Israel Deaconess Medical Center sob números de protocolo (031-2019; 025-2019). Use equipamentos de EPI adequados para lidar com animais e siga as diretrizes da IACUC para todo o trabalho com animais.
1. EIM de superfície in vivo
- Coloque o animal em uma caixa de anestesia para induzir a anestesia.
NOTA: Para ratos, foram utilizados isoflurano a 1,5%-3,5% e 2 O 2 L·min-1 e, para camundongos, isoflurano a 2% e 1 O2 L·min-1. - Uma vez totalmente anestesiado, como indicado pela ausência de resposta após beliscar o pé do animal, coloque o rato no banco em decúbito ventral e utilize o cone nasal para manter a anestesia com isoflurano a 1,5% e um fluxo de oxigênio de 1 L·min-1.
- Coloque a perna do animal a ser analisada em um ângulo de 45° com a articulação do quadril (joelho estendido) e prenda o pé com fita adesiva.
- Use um cortador de cabelo para aparar a pele que sobrepõe o músculo gastrocnêmio.
- Aplique uma camada espessa de creme depilatório sobre a pele do animal e deixe-o descansar por 1 min. Em seguida, use gaze saturada de solução salina para remover o agente depilatório. Repita este processo até três vezes até que toda a pele que sobrepõe o músculo gastrocnêmio seja removida.
NOTA: Coloque uma gaze embebida em solução salina sobre a pele quando as medidas não estiverem sendo adquiridas para evitar a desidratação da pele. - Conecte a matriz de superfície (Figura 1) ao dispositivo EIM e deixe os eletrodos descansarem em um pedaço de gaze embebido em solução salina.
- Coloque a matriz de superfície diretamente sobre a pele sobre o músculo gastrocnêmio, orientada longitudinalmente para as fibras musculares.
- Após a verificação do contato apropriado, que é indicado por todas as barras que aparecem em verde no software mostrando a estabilidade dos valores de resistência, reatância e fase de 50 kHz, adquira as medidas do EIM.
NOTA: As curvas devem ser verificadas em tempo real para garantir a aquisição adequada de dados. - Gire a matriz de superfície em 90° e reposicione-a na pele sobre o gastrocnêmio para obter as medidas transversais (verifique se há barras verdes indicando a estabilidade).
- Repita as etapas 1,7, 1,8 e 1,9 para obter um total de quatro medidas por músculo: duas longitudinais e duas transversais.
NOTA: Não use um agente depilatório mais de uma vez (ou seja, até três aplicações no mesmo caso) a cada duas semanas para evitar irritação excessiva da pele e lesões. É importante realizar as medidas dentro de cerca de 5-10 min após a remoção do creme depilatório, uma vez que o desenvolvimento de edema cutâneo localizado induzido pelo agente depilatório pode afetar os dados de impedância coletados. A recuperação animal é imediata após a interrupção da anestesia com isoflurano e o procedimento não requer tratamento analgésico.
2. Matriz de agulhas in vivo EIM
- Anestesiar o animal e preparar a perna utilizando o mesmo procedimento descrito nos passos 1.1-1.4. No entanto, não é necessário usar um agente depilatório ao realizar EIM in vivo usando uma matriz de agulhas.
- Conecte o conjunto de agulhas (Figura 2A-F) ao dispositivo EIM e deixe-o descansar em um barco de pesagem contendo solução salina. Verifique a conectividade e a estabilidade do sinal (indicadas por barras verdes).
- Desinfete a pele e as agulhas com álcool. Coloque a matriz de agulhas em uma posição longitudinal em comparação com as miofibras e pressione-a firmemente na pele até que todas as agulhas penetrem na pele e no músculo subjacente até o protetor de plástico na matriz. Adquira dados.
- Remova suavemente a matriz e reinsira-a através da pele e no músculo em um ângulo de 90° em relação à primeira medição, na direção transversal. Adquira dados.
NOTA: Ao usar matrizes de agulhas, as medições só devem ser adquiridas uma vez em cada direção para reduzir o impacto dos eletrodos da agulha na pele e no tecido muscular. Se ocorrer sangramento, limpe suavemente o sangue antes de realizar a segunda medição. A recuperação animal é imediata após a interrupção da anestesia com isoflurano e o procedimento não requer tratamento analgésico.
3. EIM ex vivo
- Preparar a célula dieléctrica ex vivo (Figura 2G,H), adicionar solução salina à câmara e ligar a célula ao dispositivo EIM para obter os valores de referência.
NOTA: Os valores de fase e reatância da solução salina devem permanecer constantes em ou perto de zero e os valores de resistência da solução salina devem permanecer constantes em aproximadamente 100 ± 25 Ω na faixa de frequência de 1 kHz a 1 MHz. - Eutanasiar o animal de acordo com as respectivas diretrizes da IACUC.
- Usando um par de tesouras, corte a pele perto do tendão de Aquiles. Usando pinças, puxe a pele em um movimento ascendente para revelar os músculos subjacentes e a fáscia. Disseque suavemente o bíceps femoral que recobre o músculo gastrocnêmio e corte o nervo ciático.
- Corte o tendão de Aquiles para liberar a extremidade distal dos músculos gastrocnêmio e sóleo e puxe suavemente o tendão para cima enquanto usa uma tesoura para remover quaisquer acessórios. Uma vez que todos os anexos são removidos, use uma tesoura para cortar a extremidade rostral do músculo sóleo e removê-lo.
- Use uma tesoura para dissecar as cabeças do músculo gastrocnêmio ao redor da patela.
NOTA: Após a remoção do músculo gastrocnêmio, é importante lembrar a orientação original das miofibras. - Coloque o músculo gastrocnêmio em uma folha de cera dentária e separe-o usando uma lâmina de barbear e uma régua para obter uma seção de 10 mm x 10 mm do centro do músculo gastrocnêmio.
NOTA: O tamanho da célula dielétrica pode ser personalizado. Para os ratos, foi utilizada uma célula de 10 mm x 10 mm e, para os camundongos, uma célula de 5 mm x 5 mm. - Usando uma pinça, coloque suavemente o gastrocnêmio nas células dielétricas, certificando-se de que as fibras estejam orientadas longitudinalmente (ou seja, as extremidades caudais e rostral devem estar tocando os eletrodos). Certifique-se de que o músculo está totalmente em contato com os eletrodos de metal.
- Anexe a parte superior da célula dielétrica e insira duas agulhas monopolares (26 G) nos dois orifícios. Conecte os fios do dispositivo EIM à célula ex vivo na seguinte ordem: (1: I+, 2: V+, 3: V-, 4: I-, onde I representa os eletrodos de corrente e V representa os eletrodos de tensão). Adquira a medida longitudinal.
- Abra a célula dielétrica e reoriente o músculo na direção transversal, girando-o 90°. Reconecte a parte superior da célula dielétrica. Adquira a medida transversal.
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Resultados
O EIM pode ser obtido em muitas condições, incluindo matrizes de superfície in vivo (Figura 1), matrizes de agulha in vivo (Figura 2A-F) e células dielétricas ex vivo (Figura 2G,H).
O EIM fornece um instantâneo quase instantâneo da condição muscular com base nos valores de impedância medidos. As medições são adquiridas rapidamen...
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Discussão
Este artigo fornece os métodos básicos para a realização de EIM em roedores, tanto in vivo quanto ex vivo. Para adquirir medições confiáveis, é fundamental executar uma série de etapas. Primeiro, é preciso identificar adequadamente o músculo de interesse, pois cada músculo terá respostas diferentes a doenças, tratamento e patologia. Deve-se estar ciente de que os dados adquiridos em um músculo (por exemplo, gastrocnêmio) não fornecerão as mesmas informações que em outro músculo (por exemplo, tibial ante...
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Divulgações
S. B. Rutkove tem participação e atua como consultor e consultor científico da Myolex, Inc., uma empresa que projeta dispositivos de impedância para uso clínico e de pesquisa, e o sistema mView usado aqui. Ele também é membro do Conselho de Administração da empresa. A empresa também tem a opção de licenciar a tecnologia de impedância patenteada da qual S. B. Rutkove é nomeado como inventor. Os outros autores não têm outras afiliações relevantes ou envolvimento financeiro com qualquer organização ou entidade com interesse financeiro ou conflito financeiro com o assunto ou materiais discutidos no manuscrito além daqueles divulgados.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Charley's Fund e NIH R01NS055099.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Impressora 3D | Formlabs Inc. | 3D | de mesa Formulário 2 |
| Impressora 3D | Shenzhen Creality 3D Technology Co. LTD | Creality Ender 3 V2 | Impressora 3D |
| 3M Micropore fita cirúrgica | Fisher | 19-027761 e 19-061655 | modelos 1530-0 e 1530-1 |
| Fita cirúrgica 3M TRANSPORE | Fisher | 18-999-380 e 18-999-381 | modelos 1527-0 e 1527-1 |
| Conector cabeçalho vertical 10 POS 1 mm espaçamento | Digi-Key (solução de conector Sullins) | S9214-ND (SMH100-LPSE-S10-ST-BK) | Espaçador de plástico de 1 mm para a matriz in vivo de rato exibida na Figura 2A |
| Aplicadores com ponta de algodão | Fisher | 22-363-172 | |
| Cera Dental | Fisher | NC9377103 | |
| Agente depilatório | Loção | removedora de pelos NAIR NA com óleo de bebê amaciante | |
| Dumont #7b Forceps | Fine Ferramentas de Ciência | No. 11270-20 | Usado para dissecação, Estilo: #7b, Forma da Ponta: Curva, Pontas: Padrão, Dimensões da Ponta: 0,17 mm x 0,1 mm, Liga/Material: Inox, Comprimento: 11 cm |
| Paquímetro Digital Eletrônico | Fisher | 14-648-17 | Usado para medir as dimensões do músculo Gastrocnêmio |
| Adesivo epóxi cartucho duplo 4 min vida útil | Devcon | série 14265, modelo 2217 | Cola usada na matriz in vivo de rato exibida na Figura 2A |
| Célula de impedância dielétrica ex vivo Células | NA personalizadas | foram impressas em 3D no laboratório Rutkove | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | No. 11051-10 | Usado para o músculo colocar e ajustar, Comprimento: 10 cm, Forma da ponta: Curva, Pontas: Serrilhadas, Largura da ponta: 0,8 mm, Dimensões da ponta: 0,8 mm x 0,7 mm, Liga/Material |
| Máquina de cortar cabelo | Amazon | NA | Wahl animal profissional BravMini+ |
| Impedance Animal Device | Myolex | EIM1103 | mView system - dispositivo de miografia de impedância elétrica experimental para uso em pesquisa animal |
| Matrizes de agulhas in vivo | Custom | NA | Matrizes personalizadas usando agulhas subdérmicas de 27 G da Ambu. A construção foi finalizada usando uma impressora 3D no laboratório Rutkove |
| Matriz de superfície In vivo | Custom | NA | A matriz de superfície in vivo foi impressa e montada no laboratório Rutkove |
| Isoflurano | Patterson Veterinary Supplies | 07-893-8441 (NDC: 46066-755-04) | Pivetal - garrafa de 250 mL |
| Gaze não tecida | Fisher | 22-028-559 | 2 x 2 polegadas |
| Poliestireno Pesagem Pratos | Fisher | S67090A | Dimensões (L x W x H): 88,9 mm x 88,9 mm x 25,4 mm |
| Lâminas de barbear | Fisher | 12-640 | Usado para cortar músculos para dimensões corretas, lâminas de aço carbono de borda única |
| Tesoura Fina para Estudantes | Ferramentas de Ciência Fina | No. 91460-11 | Usado para dissecação, Pontas: Afiadas-Afiadas, Liga/Material: Aço Inoxidável Estudante, Serrilhado: Não, Forma da Ponta: Reta, Borda Cortante: 20 mm, Comprimento: 11,5 cm, Característica: Agulhas |
| subdérmicas de qualidade estudantil 27 G Neuroline | Ambu | 745 12-50/24 | Agulhas usadas na matriz in vivo de ratos exibida na Figura 2A |
| Tesoura Cirúrgica - Sharp | Fine Science Tools | No. 14002-13 | Usada para cortar pele, Pontas: Afiadas, Liga/Material: Aço inoxidável, Serrilhadas: Não, Forma da ponta: Reta, Borda de corte: 42 mm, Comprimento: Eletrodos |
| agulha monopolar TECA ELITE | Natus | 902-DMG50-S | 0,46 mm de diâmetro (26 G). Blue hub |
| Teknova 0,9% solução salina | Fisher | S5815 | 1000 mL estéril |
Referências
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Reimpressões e permissões
