Métodos Eletrofisiológicos para Medir Níveis de Fotopigment em Fotorreceptores de Drosophila

Resumo

Apresentamos um protocolo para caracterizar eletrofisilogicamente fotopigmentações bie estáveis: (i) explorando os deslocamentos de carga dentro das moléculas de fotopigment após a absorção de fótons e sua enorme quantidade nos fotorreceptores, e (ii) explorando as diferenças de absorção-espectros dos estados de fotopigmento de rhodopsina e metarhodopsina. Esses protocolos são úteis para rastrear mutações que afetam sistemas de fotopigment biestabilidade.

Resumo

O drosophila G-protein-acoplado rhodopsin (R) é composto de uma proteína (opsina) e um cromoforeiro. O processo de ativação da rodopsina é iniciado pela isomerização indutora de absorção de fótons do cromoóforo, promovendo alterações conformais da opsina e resultando em um segundo estado de fotopigmento escuro-estável (metarhodopsina, M). A investigação deste fotopigment bi-estável usando mutagênese aleatória requer métodos simples e robustos para a triagem de moscas mutantes. Portanto, vários métodos para medir reduções nos níveis funcionais de fotopigment foram projetados. Um desses métodos explora os deslocamentos de carga dentro do fotopigment após a absorção de fótons e as enormes quantidades de moléculas de fotopigment expressas nos fotorreceptores. Este sinal elétrico, chamado de potencial receptor precoce (ou corrente de receptor precoce), é medido por uma variedade de métodos eletrofisiológicos (por exemplo, eletroretinograma e gravações de células inteiras) e é linearmente proporcional aos níveis de fotopigment funcional. As vantagens deste método são a alta relação sinal-ruído, a medição linear direta dos níveis de fotopigment e a independência dos mecanismos de fototransdução rio abaixo para a ativação de rodopsina ou metarhodopsina. Um método eletrofisiológico adicional chamado despolarização prolongada pós-potencial (PDA) explora a bi-estabilidade da fotopigment de Drosophila e as diferenças espectrais de absorção dos estados de pigmento R e M. O PDA é induzido por intensa luz azul, convertendo quantidades saturadas de rodopsina em metarhodopsina, resultando na falha da terminação de resposta à luz por um longo tempo na escuridão, mas pode ser terminada por metarhodopsina à conversão de rodopsina usando luz laranja intensa. Uma vez que o PDA é um sinal robusto que requer conversão maciça de fotopigment, mesmo pequenos defeitos na biogênese do fotopigamento levam a PDA anormal prontamente detectada. De fato, mutantes PDA defeituosos levaram à identificação de novas proteínas de sinalização importantes para a fototransdução.

Introdução

A rodopsina ativada pela luz (R), que é um receptor acoplado à proteína G (GPCR), é composta por uma proteína transmembrana 7 (opsina) e um cromoforo. Em Drosophila melanogaster (mosca-das-frutas), a absorção de fótons induz a isomerização do cromo de 11-cis-3-OH-retinal ao todo trans-3-OH-retinal ¹, promovendo a mudança conformacional da rhodopsina para metarhodopsina (M, Figura 1A). Ao contrário da rodopsina vertebrado, a fração predominante do cromoforoto invertebrado não se dissocia da opsina, resultando no estado de pigmento fisiologicamente ativo e estável M. Por sua vez, a....

Protocolo

1. Medindo a relação de resposta à intensidade, despolarização prolongada após o potencial (PDA) e o potencial do receptor precoce (ERP) usando o eletroretinograma

1. Condições adequadas de criação para a preparação de D. melanogaster
   1. Raise D. melanogaster voa em garrafas contendo milho amarelo padrão contendo alimentos em uma incubadora mantida a uma temperatura de 24 °C e em um ciclo escuro/claro de 12 horas
   2. Mantenha as garrafas de mosca no escuro pelo menos 24 horas antes do experimento.
2. Configuração geral
   1. Prepare as pipetas de gravação puxando 1 mm x 0,58 mm (O.D x I.D) capi....

Resultados

A Figura 2 exemplifica a robustez e a facilidade de utilização da técnica ERG. É robusto porque é gravado na mosca praticamente intacta por uma técnica simples de gravações de tensão extracelular que requerem uma simples configuração eletrofisiológica. A robustez se manifesta pela obtenção de gravações de respostas de luz com amplitudes relativamente grandes (na faixa de milívolos) mesmo quando mutações reduzem fortemente ou distorcem a resposta à luz. Portanto, mesmo um experimentador inexp.......

Discussão

A maior vantagem do uso da preparação do fotorreceptor Drosophila é sua acessibilidade, a facilidade e precisão da estimulação da luz e, o mais importante, a capacidade de aplicar o poder da genética molecular⁷. Estudos genéticos extensivos estabeleceram o Drosophila como um sistema modelo extremamente útil para a dissecção genética de processos biológicos complexos⁷. A estrutura relativamente simples do genoma de Drosophila (composto por apenas q.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Seringa de 1 mL com ponta			Figura 6M
1 pinça áspera		Dumont #5, Padrão	0,1 mm x 0,06 mm, comprimento 110 mm, Inox (Figura 6H)
2 lentes
Conversor A/D	Dispositivo Molecular	Digidata 1200	Possível substituição: qualquer digidata de dispositivos moleculares (por exemplo, 1440A) -Figura 7C
Amplificador	Eletrônica		Possível substituição: Instrumentos Warner- IE251A ou IE-210 (vem com headstage)- Figura 7D
Mesa Anti-vibração	Newport	VW-3036-OPT-01	Figura 7H
Capilares	Harvard Apparatus	Capilares de vidro borossilicato	1 mm x 0,58 mm (Figura 6O)
Software de	dispositivo
CO2 tanque
Fonte de luz fria	Schott	KL1500 LCD	Figura 6C
Limpadores delicados	Kimtech Kimwipes		(Figura 6K)
Suporte			Adequado para diâmetro externo capilar de 1 mm (Figura 6N, Figura 7N e Figura 7P)
Gaiola de Faraday	Blindagem		e cortina frontal preta (Figura 7K)
Filtro (Cor)	Schott	OG590, Filtro de borda	Figura
7S Filtro (Cor)	Schott	BP450/40 nm	Figura
7S Filtro (Cor)	Blazers	550 nm	Figura
7S Filtro (Cor) para fonte de luz fria	Schott	RG630	Figura 6C
Filtro (Calor)	Schott	KG3	Figura 7S
Filtros (Neutro filtro de densidade)	Chroma	6,5,4,3,2,1,0.5,0.3	Figura 7S
Flash Sistema de lâmpada	Honeywell		Figure 7U
Sistema de dorminhoco com injetor	Injetar + matic		Figura 6A-B
Fonte de alimentação da lâmpada	PTI	LPS-220	Figura 7W
Detector de luz	Fototransistor caseiro		(Figura 7O)
Guia de luz			3 mm de diâmetro, 1,3 m de comprimento (Figura 7L,M)
Fonte			Lâmpada de xenônio de 75 W sem ozônio de alta pressão (operando em 50 W), possível substituição: Cairn research- OptoLED (Figura 7R)
Cera de fusão de baixa temperatura	Feita em		Composta por mistura de cera de abelha (Tm≈ 62 ° C) e parafina a ~ 3: 1 para atingir uma temperatura de fusão de ~ 55 - ndash; 56 ° C (Figura 6J)
Suporte magnético para moscas	Figura 6I e Figura 7Q		em casa
pré-amplificador de microeletrodo com estágio de cabeça	Eletrônica		Testador de impedância (Figura 7G)
Micromanipulador (mecânico grosso)	Tritech Research, Narishige	M-2
Micromanipulador (fino mecânico)	Leitz Microsystems	Leitz Micromanipulador Mecânico	Figura 7F
pCLAMP	Dispositivo		Software
Placa			60 mm
Gerador de pulsos	AMPI	Master 8	Figura 7A
Creme Redux para eletrocardiografia	Parker Laboratories	Redux Electrólito Crè me
Driver de obturador	Uniblitz, Vincent Associates	VCM-D1 Single Channel Uni-stable	Figure 7V
Shutter system	Uniblitz, Vincent Associates	LS2 2 mm Uni-stable Shutters	Figure 7V
Silver Wire	Warner Instruments		0.25– 1 mm de diâmetro, precisa ser cloridizado
Ferro de solda composto por um filamento			0,25 mm de diâmetro (Figura 6F)
Microscópio de zoom estereoscópico	Nikon	SMZ-2B	Figura 6D
Microscópio de zoom estereoscópico	Wild	Wild M5	Com 6, 12, 25 e 50 configurações de ampliação (Figura 7E)
Filtros de seringa	Millex		22 µ m Filtro PVDF
Extrator de pipeta vertical	Sutter/ Narishige	Modelo P-97/PP-830	Use extrator vertical ou horizontal, conforme preferir (Figura 6L)
Aquecedor de filamento de cera	Feito em		Veja a figura S1 (Figura 6E-G)
Sistema de lâmpada de flash de xenônio	Dr. Rapp OptoElectronic	JML-C2	Figura 7X

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