Amplificação de Escherichia coli em um chip microfluídico de PCR em fluxo contínuo e sua detecção com um sistema de eletroforese capilar

Resumo

Este protocolo descreve como construir um sistema de cadeia polimerase de fluxo contínuo baseado em um chip microfluídico e como construir um sistema de eletroforese capilar em laboratório. Apresenta um método simples para a análise de ácidos nucléicos em laboratório.

Resumo

A reação em cadeia da polimerase (PCR) é um método tradicional empregado para a amplificação de um gene alvo que tem desempenhado um papel importante no diagnóstico biomolecular. No entanto, a PCR tradicional é muito demorada devido à eficiência de variação de baixa temperatura. Este trabalho propõe um sistema de PCR em fluxo contínuo (CF-PCR) baseado em um chip microfluídico. O tempo de amplificação pode ser bastante reduzido executando a solução de PCR em um microcanal colocado em aquecedores ajustados a diferentes temperaturas. Além disso, como a eletroforese capilar (CE) é uma maneira ideal de diferenciar produtos de PCR positivos e falso-positivos, um sistema CE foi construído para obter uma separação eficiente dos fragmentos de DNA. Este trabalho descreve o processo de amplificação de Escherichia coli (E. coli) pelo sistema CF-PCR construído internamente e a detecção dos produtos de PCR por CE. Os resultados demonstram que o gene alvo de E. coli foi amplificado com sucesso dentro de 10 min, indicando que estes dois sistemas podem ser usados para a rápida amplificação e detecção de ácidos nucléicos.

Introdução

A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica de biologia molecular usada para amplificar fragmentos específicos de DNA, amplificando assim traços de DNA centenas de milhões de vezes. Tem sido amplamente utilizado em diagnóstico clínico, pesquisa médica, segurança alimentar, identificação forense, e outros campos. O processo de PCR consiste principalmente de três etapas: desnaturação a 90-95 °C, anelamento a 50-60 °C e extensão a 72-77 °C. A ciclagem térmica é uma parte importante do processo de PCR; no entanto, o termociclador PCR tradicional não é apenas volumoso, mas também ineficiente, exigindo aproximadamente 40 min para completar 25 ciclos. Para superar ....

Protocolo

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, reagentes e equipamentos usados neste protocolo.

1. Fabricação de chip microfluídico CF-PCR

1. Aqueça o wafer de silicone a 200 °C durante 25 minutos para remover a humidade.
2. Dispense 1 mL de fotorresistência SU-8-2075 por polegada de wafer. Gire no wafer de silício usando um revestidor de giro a 500 rpm para 5-10 s com uma aceleração de 100 rpm/s, e depois a 2.000 rpm para 30 s com uma aceleração de 500 rpm/s.
3. Leve ao forno de silicone a 65 °C por 3 min e, em seguida, a 95 °C por 15 min.

Resultados

A Figura 5 representa o eletroferograma dos produtos da PCR e os marcadores de DNA. O traço (Figura 5A) é o resultado CE do produto amplificado por CF-PCR, o traço (Figura 5B) é o resultado CE do produto amplificado pela ciclagem térmica e o traço (Figura 5C) é o resultado CE da escada de DNA de 100 pb. Primeiro, amplificamos o gene alvo de E. coli no sistema CF-PCR; a solução de PCR levou ~10 .......

Discussão

Tanto a PCR quanto a CE são duas biotecnologias populares na análise de ácidos nucléicos. Este trabalho descreve a amplificação de E. coli e a detecção dos produtos de PCR usando os sistemas CF-PCR e CE, ambos construídos internamente. O gene alvo de E. coli foi amplificado com sucesso dentro de 10 min devido às altas taxas de transferência de calor. Os fragmentos de DNA menores que 1.500 pb foram separados em 8 min (Figura 5). A grande vantagem dessas duas técnicas é que e.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Escada de DNA de 100 pb	Takara Bio Inc.	3422A
10x Buffer Rápido I	Takara Bio Inc.	RR070A
10x TBE	Pequim Solarbio Ciência & Fornecedor:Technology Co., Ltd.	Solução de revelação T1051
	Alfa Aesar, EUA	L15459
mistura dNTP (2,5 μ M)	Takara Bio Inc.	RR070A
EC-F	Sangon Biotech, Xangai, China
EC-R	Sangon Biotech, Xangai, China
HEC, 1300K	Sigma-Aldrich, EUA	9004-62-0
isopropanol	Aladdin, Xangai, China	67-63-0
microscópio	Olympus, Japão	BX51
fotolitografia & nbsp;	SUSS MicroTec, Alemanha	MJB4
	Hamamatsu Photonics, Japão	R928
fotorresistente	MicroChem, EUA	SU-8 2075
Controladores de temperatura PID	Xangai, China	XH-W2023
limpador de plasma	Harrick Plasma	PDC-32G-2
polivinil pirrolidona (PVP)	Aladdin, Xangai, China	P110608
bomba	Harvard Apparatus	PHD2000
tubo de silicone	BIO-RAD,USA
relés de estado sólido	KZLTD, China	KS1-25LA
SpeedSTAR HS DNA Polimerase	Takara Bio Inc.	RR070A
	zhongxinqiheng, Suzhou, China
VERDE SYBR	Solarbio, Pequim, China	Sensores de temperatura SY1020
	EasyShining Technology, Chengdu, China	TCM-M207
(E. coli)	Takara Bio Inc.	AK601
Tween 20	Aladdin, Xangai, China	Fonte de alimentação de T104863
voltagem	Medina, NY, EUA	TREK MODELO 610E