Artigo de método

Bioreator guiado por imagem para geração de tecido das vias aéreas bioengenharia

DOI:

10.3791/63544

⸱

6 de abril de 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Stevens Institute of Technology, 2Department of Biomedical Engineering, Columbia University, 3Department of Cell Biology, State University of New York Downstate Medical Center, 4Department of Cardiothoracic Surgery, Stanford University

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O protocolo descreve um bioreator habilitado para imagem que permite a remoção seletiva do epitélio endógeno da traqueia de rato e distribuição homogênea de células exógenas na superfície do lúmen, seguida pela cultura in vitro de longo prazo da construção do tecido celular.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lesões repetidas no tecido das vias aéreas podem prejudicar a função pulmonar e causar doenças pulmonares crônicas, como doença pulmonar obstrutiva crônica. Os avanços na medicina regenerativa e nas tecnologias bioreaatores oferecem oportunidades para produzir construções de tecidos e órgãos funcionais cultivados em laboratório que podem ser usados para triagem de drogas, doenças modelo e substituição de tecidos de engenheiros. Aqui, um bioreator miniaturizado aliado a uma modalidade de imagem que permite a visualização in situ do lúmen interno da traqueia de rato explantada durante a manipulação e cultura in vitro de tecidos. Utilizando este bioreator, o protocolo demonstra a remoção seletiva guiada por imagens de componentes celulares endógenos, preservando as características bioquímicas intrínsecas e a ultraestrutura da matriz tecidual das vias aéreas. Além disso, a entrega, distribuição uniforme e subsequente cultura prolongada de células exógenas nos lúmen descelularizados das vias aéreas com monitoramento óptico in situ são mostrados. Os resultados destacam que o bioreator guiado por imagem pode potencialmente ser usado para facilitar a geração de tecidos funcionais in vitro das vias aéreas.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A superfície luminal do trato respiratório é forrada por uma camada de epitélio que consiste principalmente de células-tronco multi-ciliadas, club, cálice e basal 1,2. A camada epitelial serve como um mecanismo de defesa primária do pulmão, agindo como uma barreira biofísica que protege o tecido subjacente das vias aéreas contra patógenos inalados, partículas ou gases químicos. Protege o tecido das vias aéreas através de múltiplos mecanismos, incluindo formação de junção apertada intercelular, liberação mucociliaria e secreção antimicrobiana e antioxidante 3,4. O epitélio das vias aéreas defeituosas está associado a doenças respiratórias devastadoras, como doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC)5, diskinesia ciliar primária (PCD)6 e fibrose cística (CF)7.

Os avanços na tecnologia lung-on-chip (LOC) representam uma oportunidade para estudar o desenvolvimento pulmonar humano, modelar várias doenças pulmonares e desenvolver novos materiais terapêuticos em ambientes in vitro fortemente regulados. Por exemplo, o epitélio das vias aéreas e o endotélio podem ser cultivados em lados opostos de uma membrana fina e porosa para imitar o gás trocando tecido pulmonar, permitindo modelagem fiel de doenças e testes medicamentosos8. Da mesma forma, modelos de doenças in vitro foram criados para modelar doenças das vias aéreas in vitro, como DPOC9 e fibrose cística10. No entanto, um grande desafio dos dispositivos LOC é recapitular a complexa arquitetura tridimensional (3D) do tecido pulmonar e interações dinâmicas de matriz celular-tecido in vitro11.

Recentemente, foram desenvolvidas metodologias inovadoras de engenharia de tecidos que permitem a manipulação de tecidos pulmonares ex vivo 12. Utilizando essas metodologias, enxertos de tecido alergênico ou xenogênico desnudado podem ser preparados removendo as células endógenas do tecido pulmonar através de tratamentos químicos, físicos e mecânicos13. Além disso, a matriz extracelular de tecido nativo preservada (ECM) nos andaimes pulmonares descelularizados fornecem as pistas estruturais, bioquímicas e biomecânicas para as células implantadas anexarem, proliferarem e diferenciarem14,15.

Aqui, um sistema bioreator guiado por imagem criado pela combinação de tecnologias de engenharia de tecidos e LOC para permitir a manipulação in vitro de tecidos e cultura de tecidos traqueais de ratos explantados é relatado. Utilizando este bioreator de tecido das vias aéreas, o protocolo demonstra a remoção seletiva das células epiteliais endógenas sem interromper os componentes celulares e bioquímicos subjacentes do tecido das vias aéreas. Em seguida, mostramos a distribuição homogênea e a deposição instantânea das células exógenas recém-semeadas, como células-tronco mesenquimais (MSCs), no lúmen das vias aéreas desnudadas, instilando a solução de colágeno i pré-gel carregada por células. Além disso, utilizando o dispositivo de imagem micro-óptica integrado ao bioreator, a visualização do lúmen traqueia durante a remoção do epitélio e a entrega de células endógenas também é feita. Além disso, mostra-se que a traqueia e as células recém-implantadas podem ser cultivadas no bioreator sem morte celular perceptível e degradação tecidual por 4 dias. Prevemos que a plataforma bioreatorial habilitada para imagem, a fina técnica de desetelialização baseada em filmes e o método de entrega de células utilizado neste estudo podem ser úteis para a geração de tecidos das vias aéreas para modelagem de doenças in vitro e triagem de medicamentos.

O bioreator inclui uma câmara retangular conectada a uma bomba de seringa programável, bomba de perfusão e ventilador para cultivar traqueia de rato isolada. O bioreator apresenta entradas e tomadas conectadas à traqueia ou à câmara de cultura tecidual para fornecer separadamente reagentes (por exemplo, mídia cultural) aos espaços internos e externos da traqueia (Figura 1). Um sistema de imagem personalizado pode ser usado para visualizar o interior da traqueia de rato in vitro cultivada no nível celular (Figura 2). O epitélio endógeno da traqueia é removido através da instilação de uma solução de descelularização baseada em detergente, seguida pela lavagem das vias aéreas assistidas por vibração (Figura 3). A solução de hidrogel, como o colágeno tipo I, é usada como veículo de entrega para semear células exógenas uniformemente e instantaneamente através do lúmen traqueia desnudado (Figura 4). Todos os materiais utilizados para a construção do bioreator e a realização dos experimentos são fornecidos na Tabela de Materiais.

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Protocolo

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O protocolo de tecido animal abaixo foi aprovado pela diretriz de bem-estar animal e regulamentos do Comitê de Uso e Cuidado animal (IACUC) do Instituto de Tecnologia Stevens, e cumpre as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) para o uso de animais experimentais.

1. Projeto e construção de bioreator de traqueia de rato guiado por imagem

  1. Projeto e fabricação de bioreator de traqueia de rato
    1. Crie um modelo de projeto (CAD) auxiliado por computador da câmara bioreatorial com design relevante, como entradas, tomadas e câmara de cultura de tecidos, usando software gerador CAD. Para este estudo, utilize a geometria e as dimensões apresentadas na Figura 1A-C. O tutorial do software do gerador CAD pode ser encontrado em16,17.
    2. Exporte o modelo CAD gerado para um software controlador de controle numérico de computador (CNC) e corte o plástico politetrafluoroetileno (PTFE) usando uma máquina CNC para criar a câmara bioreatorial. O tutorial do software controlador CNC pode ser encontrado em18.
      NOTA: Além do PTFE, outros materiais plásticos, como polietileno de peso molecular ultra-alto (UHMWPE) e polieterimida podem ser usados para fabricar a câmara de cultura.
    3. Esterilize todos os componentes bioreatores, como adaptadores e parafusos Luer, para evitar a contaminação dos tecidos e células cultivadas no dispositivo. Monte todos os componentes bioreatores para a câmara principal de cultura tecidual em um ambiente limpo (Figura 1A).
  2. Construção de dispositivo de imagem baseado em lentes baseada em índice de gradiente (GRIN)
    1. Para criar o dispositivo de imagem in situ , insira uma lente de tubo em um tubo de lente empilhável e fixe-a usando um anel de retenção. Monte o conjunto do tubo de lente em uma câmera CMOS científica através de um adaptador de montagem C.
    2. Use software, como o Micro-Manager, para operar a câmera e adquirir fotos e vídeos. Aime um objeto localizado a uma longa distância (por exemplo, 10 m da câmera) e ajuste a distância entre a lente do tubo e o sensor de imagem da câmera até que uma imagem focada do objeto seja formada na tela do computador pelo software de imagem que está sendo usado.
    3. Monte uma lente de filtro em um espelho dirímico de dupla resolução de super resolução e um laser para o dispositivo usando componentes do sistema de gaiola óptica, incluindo haste de montagem, placa de gaiola roscada e cubo de gaiola.
    4. Conecte a lente objetiva (20x) ao dispositivo. Monte uma lente GRIN (diâmetro = 500 μm) na extremidade distal do tubo da lente através do tradutor XY. Ajuste a distância entre a lente GRIN e a lente objetiva para formar imagens microscópicas focadas (Figura 2A,B).

2. Isolamento da traqueia de rato

  1. Higienize a área cirúrgica e esterilize os instrumentos cirúrgicos utilizando uma autoclave a 121 °C por 30 minutos antes da cirurgia.
  2. Coloque um rato na câmara de indução e entregue 2,5% de isoflurane por 15 minutos usando um pequeno vaporizador para anestesiar o animal. Avalie a profundidade da anestesia pelo reflexo do pedal. Para isso, belisque firmemente o dedo do pé e confirme que o animal não responde ao aperto do dedo do pé.
  3. Após a anestesia, remova o isoflurane da câmara e administre 1 mL de heparina de 1.000 unidades/mL através da veia traseira lateral para evitar a coagulação sanguínea na vasculatura pulmonar.
  4. Para eutanásia do animal, exponha o animal a 5% de isoflurano por mais 15-20 min. Retire o animal da câmara de indução e coloque-o na placa cirúrgica em uma posição supina face-up.
  5. Fixar o rato na placa cirúrgica imobilizando as pernas e a cauda usando fita adesiva. Em seguida, esterilize as regiões do pescoço e do peito do rato usando 70% de álcool isopropílico (IPA). Abra a cavidade abdominal fazendo uma incisão de 3-4 cm usando uma tesoura na pele.
    NOTA: Tenha cuidado para não cortar profundamente a pele apontando as pontas da tesoura para cima.
  6. Transecte a veia cava inferior (IVC) usando a tesoura e confirme a eutanásia por exsanguinação.
  7. Realize a traqueotomia fazendo uma incisão usando uma tesoura na linha média do pescoço e expondo a traqueia. Realize a toracotomia média fazendo uma incisão na parede do peito e cortando entre as costelas para alcançar a extremidade da traqueia conectada ao pulmão. Em seguida, use um bíceps e uma tesoura para cortar as duas extremidades da traqueia e isolar a traqueia.
  8. Após o isolamento, enxágue a traqueia usando 20 mL de soro fisiológico tamponado de fosfato de 1x (1x PBS). Transfira a traqueia para o bioreator usando bíceps esterilizados. Fixar as duas extremidades da traqueia no conector Luer usando uma rosca de sutura 4-0.
  9. Entregue 5 mL de cultura média à câmara bioreatorial utilizando a bomba de seringa programável através da tubulação conectada à câmara bioreatorial a uma vazão de 5 mL/min.
    NOTA: O meio de cultura é composto pelo meio modificado da Águia (DMEM) modificado de Dulbecco, fgf-básico humano recombinante (0,1 ng/mL), soro bovino fetal (FBS, 10%) e antibiótico-antimícotico (1%).
  10. Feche bem a tampa do bioreator com a tampa de plástico acrílico e parafusos. Feche as conexões de tubos de câmara bioreatorial com os plugues Luer masculino/feminino para evitar o fluxo do meio de cultura na tubulação.

3. Remoção guiada por imagem do epitélio traqueia

  1. Para visualizar o lúmen traqueia em campo brilhante ou fluorescente, coloque o bioreator no estágio de imagem (Figura 3A).
  2. Prepare a solução de ér de carboxyfluorescein succinimidyl (CFSE) (concentração: 100 μM) no kit de rotulagem celular CFSE diluindo a solução CFSE com 1x PBS.
    NOTA: A concentração da solução CFSE original é de 10 mM (em sulfóxido de dimetil (DMSO).
  3. Infundir 500 μL da solução CFSE através da traqueia através da bomba de seringa através da tubulação conectada à cânula da traqueia a uma vazão de 5 mL/min. Pare a bomba quando a solução CFSE encher a traqueia. Aguarde 10 min, e depois lave o lúmen traqueia por infusão de 10 mL de 1x PBS usando a bomba de seringa para remover o reagente CFSE não incorporado residual.
  4. Insira a extremidade de imagem distal da lente GRIN na traqueia através do conector Luer preso a uma extremidade da traqueia. Em seguida, mova suavemente a lente GRIN dentro da traqueia até que a superfície da traqueia esteja focada e tire fotos e vídeos em campo brilhante ou fluorescência em ampliação de 20x.
  5. Para capturar imagens de campo brilhante no software Micro-Manager, siga os passos abaixo.
    1. Introduza a luz branca através do cubo da gaiola para iluminar o lúmen traqueia. Clique no ícone Live para mostrar a superfície luminal da traqueia em tempo real. Use a configuração de imagem > Exposição (ms) para alterar o tempo de exposição ao valor desejado. Neste estudo, o tempo de exposição utilizado foi na faixa de 10 ms e 50 ms.
    2. Para ajustar o contraste e o brilho das imagens, use a janela de dimensionamento histograma e intensidade para mover setas pretas e brancas no ponto final do display de histograma interativo. Alternativamente, use a opção Auto Stretch que permite ao software ajustar o brilho e o contraste automaticamente para níveis ideais.
    3. Clique no ícone 'Encaixar ' para congelar a imagem. Em seguida, use Configuração > Exportar Imagens como Deslocadas para salvar as imagens no formato desejado. Alternativamente, use Configuração > ImageJ para exportar diretamente a imagem para o software ImageJ e salvá-la.
  6. Para obter fotos e vídeos no modo fluorescente, ilumine o lumen da traqueia com luz laser específica cfse (CFSE: comprimento de onda de excitação: 488 nm, comprimento de onda de emissão: 515 nm) através do cubo da gaiola. Siga os passos 3.5.2-3.5.3 para adquirir as imagens. Depois de tirar fotos e vídeos, remova suavemente a lente GRIN da traqueia.
  7. Realize a desetelialização conforme descrito abaixo.
    1. Prepare 2% de sulfato de dodecyl de sódio (SDS) solução de descelularização em água destilada (DI). Incutir 50 μL de SDS através da traqueia a uma vazão de 6,3 mL/min, usando a bomba de seringa através da cânula da traqueia para gerar um filme fino da solução detergente no lúmen traqueia.
    2. Feche as conexões de tubo do bioreator usando plugues Luer masculino/feminino e transfira o bioreator para uma incubadora. Deixe o SDS habitar dentro da traqueia por 10 min a 37 °C. Incutir mais 50 μL de solução SDS através da traqueia e incubar por 10 min.
    3. Remova o epitélio e o SDS irrigando o lúmen traquea com 500 μL de 1x PBS via bomba de seringa a uma vazão de 10 mL/min por 3x. Coloque o bioreator em um agitador e vibre mecanicamente o bioreator a 20 Hz de frequência e amplitude de deslocamento de aproximadamente 0,3 mm para promover fisicamente o descolamento das células epiteliais tratadas com SDS do lúmen traqueia.
      NOTA: Neste estudo, o shaker foi feito sob medida pela montagem de um alto-falante subwoofer, um amplificador de placa de subwoofer e um acelerômetro. Uma forma de onda sinusoidal foi gerada por um computador e alimentada no agitador através do amplificador, enquanto a resposta do agitador foi monitorada através do acelerômetro (Figura 3B). Além disso, shakers convencionais, como shakers eletromagnéticos e inércias, podem ser usados para promover o descolamento das células. Para isso, defina a frequência e aceleração do agitador para 20 Hz e 0,5 g, respectivamente (equivalente a amplitude de deslocamento de 0,3 mm).
    4. Incutir 500 μL de 1x PBS duas vezes através do lúmen traqueia para remover SDS residuais e detritos celulares enquanto a traqueia é mecanicamente vibrada. Seguindo o procedimento de remoção do epitélio, avalie a liberação da camada epitelial medindo a intensidade do CFSE utilizando o dispositivo de imagem da lente GRIN como na etapa 3.6 (Figura 3C).

4. Preparação do tecido traqueia para novas análises

  1. Para confirmar a remoção do epitélio, realize novas análises teciduais, como a coloração de hematoxilina e eosina (H&E), tricromo, pentachrome e imunostaining. Para isso, remova a traqueia do bioreator e fixe-a em 30 mL de solução de paraformaldeído tamponado de 4% em 1x PBS (pH = 7,4) a 4 °C durante a noite.
  2. Desidrate e incorpore o tecido fixo da traqueia seguindo os passos abaixo.
    1. Após a fixação, lave o tecido traqueia com 10 mL de 1x PBS, transfira a traqueia para 30 mL de 70% de álcool e mantenha-a a 4 °C durante a noite. Corte a traqueia em pequenas seções cilíndricas (~5 mm) usando uma lâmina afiada e insira as seções teciduais no tecido incorporando fitas (comprimento x largura x altura: 4 cm x 2,5 cm x 0,5 cm). Mantenha duas seções de traqueia em cada.
    2. Desidratar as seções em uma série de soluções de álcool isopropílico (IPA) - 85%, 90%, 95%, 100% - por 1 h em 30 mL de cada solução. Remova a solução anterior antes de adicionar a próxima solução.
    3. Após a conclusão, submergir as fitas em 30 mL de agente de compensação (por exemplo, xileno) por 2h para deslocar a solução IPA das seções teciduais completamente. Realize esta etapa em um capô de fumaça com ventilação adequada.
    4. Submerque as fitas em parafina por 2h, e depois incorpore-as em parafina a 4 °C durante a noite. Em seguida, corte os tecidos embutidos na parafina em seções finas (5-8 μm) usando um dispositivo de microtome para h&E, tricromo, pentatro e imunostaining.
  3. Para preparar os tecidos para a análise de microscopia eletrônica de varredura (SEM), fixe a traqueia em 30 mL de solução de glutaraldeído de 2,5% em 1x PBS (pH = 7,4) a 4 °C durante a noite. Em seguida, desidrate o tecido de traqueia fixa para SEM seguindo as etapas abaixo.
    1. Após a fixação, enxágue o tecido traqueia com 10 mL de 1x PBS. Corte o tecido traqueia longitudinalmente em pequenas seções de semi-cilindro (comprimento: ~5 mm) usando uma tesoura e insira as seções teciduais nas fitas.
    2. Desidratar as seções em uma série de soluções de IPA - 35%, 50%, 70%, 85%, 95% e 100% - por 10 min em 30 mL de cada solução. Remova a solução anterior antes de adicionar a próxima solução.
    3. Realizar o método de secagem baseado em hexaametila (HMDS) submergindo os tecidos nas seguintes soluções: 100% IPA: HMDS (2:1; v/v) por 10 min, seguido por 100% IPA: HMDS (1:2; v/v) por 10 min, e finalmente 100% HMDS para durante a noite.
      NOTA: O HMDS é tóxico. Trabalhe sob um capô de fumaça durante todos os passos de secagem.
    4. Remova os tecidos da solução HMDS e deixe-os secar sob a capa de fumaça por 1h. Monte a seção em pinos de alumínio usando uma fita condutora de carbono de dois lados ou pasta condutora de prata para imagens SEM.

5. Distribuição homogênea de células exógenas no lúmen traqueal desnudado

  1. Prepare uma traqueia de rato desetelializada usando o protocolo na etapa 3. Descongele células-tronco mesenquimais congeladas (MSCs) para 30 s em um banho de água de 37 °C.
    NOTA: Neste estudo, usamos células-tronco mesenquimais (MSCs) como célula modelo para mostrar a distribuição de células exógenas na traqueia des epitelializada. Idealmente, células epiteliais das vias aéreas primárias, células basais ou células pluripotentes induzidas (iPSCs) podem ser usadas para fins de regeneração de epitélio.
  2. Conte as células com um hemótmetro e prepare uma solução celular com uma concentração de 5 x 106 células/mL. Rotule as células fluorescente incubando as células com 2 mL de solução CFSE (concentração: 100 μM) à temperatura ambiente por 15 minutos. Enxágüe as células com 5 mL de 1x PBS por 3x e resuspenque as células em meio de cultura fresca em uma concentração final de 3 x 107 células/mL.
  3. Prepare a solução de pré-gel de hidrogel como um veículo para entrega de células. Para este estudo, use o colágeno I como veículo de entrega para células MSCs e siga as instruções do fabricante para preparar o pré-gel. Por exemplo, para obter 3,6 mg/mL de pré-gel de colágeno, misture uma parte da solução de neutralização resfriada com nove partes do colágeno da cauda de rato em um tubo estéril de 1,5 mL. Em seguida, encobre suavemente a mistura para cima e para baixo para uma mistura adequada.
    NOTA: Outros hidrogéis biocompatíveis podem ser usados em vez de colágeno I de acordo com o estudo e as necessidades do usuário.
  4. Uma vez que a solução de hidrogel esteja preparada, adicione as células rapidamente à solução com concentração desejada (por exemplo, 5 x 106 células/mL). Para obter uma mistura uniforme de hidrogel celular, misture as células e a solução de gel, tubos suavemente com uma micropipette.
  5. Conecte uma extremidade da traqueia dentro do bioreator a uma bomba de seringa programável através de um conector Luer. Entregue 5 mL de cultura fresca a 37 °C na câmara bioreatorial para cobrir a superfície externa da traqueia usando a bomba de seringa a uma taxa de fluxo de 5 mL/min.
  6. Administre um bolus de 10 μL da mistura de hidrogel celular na traqueia desetelializada dentro do bioreator usando a bomba de seringa a uma vazão de 5 mL/min para gerar uma camada de hidrogel celular no lúmen traqueia (Figura 4).
  7. Após a injeção celular, coloque o bioreator em uma incubadora de cultura celular estéril a 37 °C e 5% de CO2 para gelação. Para o colágeno I, a gelação ocorre em 30 minutos.
  8. Para visualizar a distribuição das células implantadas, esterilize a lente GRIN limpando com 70% de IPA ou etanol e coloque o bioreator no estágio de imagem. Tire fotos e vídeos nos modos de campo brilhante e fluorescente, conforme necessário.
  9. Após 30 minutos de semeadura celular, infunda 1 mL de meio de cultura no lúmen da traqueia usando uma bomba de seringa a uma taxa de fluxo de 1 mL/min.
  10. Cultura a traqueia semeada por células dentro do bioreator em uma incubadora a 37 °C para o tempo desejado. Para a cultura de longo prazo, refresque o meio cultural no lúmen traqueia e na câmara bioreator a cada 24 horas. Durante a cultura celular, mantenha a mídia dentro do lúmen estático e mude-a a cada 24 horas, enquanto a mídia fora da traqueia é continuamente perfundida através de um fluxo unidirecional a 5 mL/min.
  11. Após a cultura das células por um determinado período de tempo (por exemplo, 1 e 4 dias neste estudo), remova a traqueia do bioreator. Use a tesoura para cortar a traqueia longitudinalmente em duas seções semi-cilindros (ou seja, seções superiores e inferiores) nos dias 1 e 4 da cultura in vitro para expor as superfícies internas para monitorar o crescimento celular e calcular a densidade celular. Use um microscópio fluorescente convencional para visualizar as células nas superfícies internas.
  12. Para adquirir as imagens usando o software Micro-Manager, siga as etapas 3.5 e 3.6. Use um filtro de isothiocianato de fluoresceína (FITC) para visualizar as células rotuladas por CFSE no modo fluorescência. Analise as imagens tiradas pelo microscópio fluorescente e calcule as densidades celulares em seções superiores e inferiores usando o software ImageJ. Para calcular o número de células e a densidade celular, siga os passos abaixo.
    1. Abra uma imagem no software ImageJ e converta a imagem em uma imagem binária (16 bits) usando > de imagem Tipo > 16 bits. Defina a escala de imagem com a barra de escala usando Analisar > Escala definida.
    2. Ajuste o limiar da imagem para destacar as estruturas das células para contar. Use > de imagem Ajuste > limiar. Use Analisar > Analisar partículas para contar o número das células. Calcule a densidade das células dividindo o número de células pela área superficial da imagem.
  13. Para avaliar a viabilidade após a semeadura celular, use um kit de viabilidade celular. Para este estudo, incubar o tecido traqueia e as células do bioreator a 37 °C por 6h e manchar as células com 4 mM de calcein-AM e 2 mM de ethidium homodimer-1 em 1 mL de 1x PBS à temperatura ambiente por 15 min.
  14. Depois de enxaguar com 1x PBS, visualize as células usando um microscópio fluorescente. Conte as células vivas e mortas usando os passos descritos na etapa 5.12. Calcular a viabilidade celular como a porcentagem de células vivas (manchadas com calceíno-AM) por células totais (células vivas e mortas).

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Resultados

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A modalidade de imagem in situ baseada em lentes GRIN pode permitir a visualização do lúmen interno traqueal in situ (Figura 5A). Utilizando este método de imagem, podem ser obtidas imagens de campo brilhante e fluorescentes das traqueias nativas e deselegelializadas (Figura 5B,C). Não foi observado sinal fluorescente da traqueia nativa antes da rotulagem CFSE (Figura 5Bii). No entanto, quando o ep...

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Discussão

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Neste trabalho, criamos um bioreator guiado por imagem que pode permitir (i) o monitoramento do lúmen traqueia in situ após a remoção celular e a entrega de células exógenas e (ii) cultura in vitro de longo prazo do tecido traqueia semeado por células. Usando este bioreator personalizado, demonstramos (i) remoção seletiva das células epiteliais endógenas do lúmen traqueia usando detergente e lavagem de vias aéreas assistidas por vibração e (ii) distribuição uniforme de células exógenas na superfície lum...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esta pesquisa foi apoiada em parte pelo American Toacic Society Foundation Research Program, pela New Jersey Health Foundation e pela National Science Foundation (CAREER Award 2143620) para J.K.; e os Institutos Nacionais de Saúde (P41 EB027062) para G.V.N.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1 e vezes; PBSGibco, Thermo Fisher Scientific10-010-031
Conector de 3 portasWorld Precision Instruments14048-20
Conector de 4 portasWorld Precision Instruments14047-10
AcelerômetroSTMicroelectronicsIIS3DWBTR
Gibão acromáticoThorlabsAC254-150-A-ML
Alumínio ponta de pinoTED PELLA16111
Antibiótico-antimicóticoThermo Fisher Scientific15240062
Haste de montagemThorlabsER1
Parafusos de cabeça de botãoMcMaster-Carr91255A274
Cubo de gaiolaThorlabsC4W
Fita condutora de dupla face de carbonoTED PELLA16073
Kit de rotulagem CFSEAbcamab113853
Citrisolv (agente de limpeza)Decon1061
Adaptador de montagem CThorlabsSM1A9
Colágeno IAdvanced BioMatrix5153
Tinta condutora de prata líquidaTED PELLA16034
Espelho dicróicoSemrockDI03-R488Comprimentos de onda do laser refletidos:  473.0 +- 2 nm 488.0 +3/-2 nm
Eagle modificado de Dulbecco' s mediumGibco, Thermo Fisher Scientific11965118
Adaptador de anteparo luer fêmea para mangueiraCole-ParmerEW-45501-30
Luer fêmea para barb de tubulaçãoCole-ParmerEW-45508-03
Conector luer fêmea para machoCole-ParmerZY-45508-80
Soro bovino fetalGibco, Thermo Fisher Scientific10082147
Lente de filtroChroma Technology CorpET535/50m
Microscópio fluorescenteNikonEclipse E1000 - D
Fusion 360Autodesk
Porca sextavadaMcMaster-Carr91813A160
Hexametildisilazane (HMDS)Fisher ScientifcAC120585000
Fibra de imagemSELFOC, NSG grupoLente
LaserOpto EngineMDL-D-488-150mW
Tubos de lenteThorlabsSM1L40
Kit de viabilidade/citotoxicidade LIVE/DEAD (Invitrogen)Thermo Fisher ScientificL3224
MACH 3 Software de controle CNCNewfangled Solutions
Lente objetivaOlympusUCPLFLN20X
Bomba peristálticaCole ParmerL/S sistema
Anel de retenção humano recombinante FGF-basicPeproTech100-18B
ThorlabsSM1RR
Câmera CMOSPCO PandaPCO Panda 4.2
Dodecil sulfato de sódioVWR97064-472
Solidworks ( 2019)Dassault Systè mes
Tubo de lente empilhávelThorlabsSM1L10
Amplificador de placa de subwooferDayton AudioSPA250DSP
Alto-falante subwooferDayton AudioRSS21OHO-4 Diâmetro dodiafragma: 21 cm
Bomba de seringaWorld Precision InstrumentsAL-4000
Placa de gaiola roscadaThorlabsCP33
Adaptador luer rosqueadoCole-ParmerEW-45513-81
Lente de tuboThorlabsAC254-150-A-ML
Tubulação TygonCole-Parmer13-200-110
XY TradutorThorlabsCXY1
GRINde bomba digital padrão científica

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rackley, C. R., Stripp, B. R. Building and maintaining the epithelium of the lung. The Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).
  2. Rayner, R. E., Makena, P., Prasad, G. L., Cormet-Boyaka, E. Optimization of Normal Human Bronchial Epithelial (NHBE) cell 3D cultures for in vitro lung model studies. Scientific Reports. 9 (1), 500(2019).
  3. Gohy, S., Hupin, C., Ladjemi, M. Z., Hox, V., Pilette, C. Key role of the epithelium in chronic upper airways diseases. Clinical and Experimental Allergy. 50 (2), 135-146 (2020).
  4. Ganesan, S., Comstock, A. T., Sajjan, U. S. Barrier function of airway tract epithelium. Tissue Barriers. 1 (4), 24997(2013).
  5. De Rose, V., Molloy, K., Gohy, S., Pilette, C., Greene, C. M. Airway epithelium dysfunction in cystic fibrosis and COPD. Mediators of Inflammation. 2018, 1309746(2018).
  6. Horani, A., Ferkol, T. W. Advances in the genetics of primary ciliary dyskinesia: Clinical implications. Chest. 154 (3), 645-652 (2018).
  7. Berical, A., Lee, R. E., Randell, S. H., Hawkins, F. Challenges facing airway epithelial cell-based therapy for cystic fibrosis. Frontiers in Pharmacology. 10, 74(2019).
  8. Shrestha, J., et al. Lung-on-a-chip: the future of respiratory disease models and pharmacological studies. Critical Reviews in Biotechnology. 40 (2), 213-230 (2020).
  9. Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).
  10. Plebani, R., et al. Modeling pulmonary cystic fibrosis in a human lung airway-on-a-chip. Journal of Cystic Fibrosis. , (2021).
  11. Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
  12. Gilpin, S. E., Wagner, D. E. Acellular human lung scaffolds to model lung disease and tissue regeneration. European Respiratory Review. 27 (148), 180021(2018).
  13. Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annual Review of Biomedical Engineering. 13, 27-53 (2011).
  14. Gilpin, S. E., Charest, J. M., Ren, X., Ott, H. C. Bioengineering lungs for transplantation. Thoracic Surgery Clinics. 26 (2), 163-171 (2016).
  15. Calle, E. A., Leiby, K. L., Raredon, M. B., Niklason, L. E. Lung regeneration: steps toward clinical implementation and use. Current Opinion in Anaesthesiology. 30 (1), 23-29 (2017).
  16. Planchard, D. Engineering Design with SOLIDWORKS 2022: A Step-by-Step Project Based Approach Utilizing 3D Solid Modeling. , SDC Publications. (2022).
  17. Coward, C. A Beginner's Guide to 3D Modeling: A Guide to Autodesk Fusion 360. , No Starch Press. (2019).
  18. Meza, G., Carpio, C. D., Vinces, N., Klusmann, M. 2018 IEEE XXV International Conference on Electronics, Electrical Engineering and Computing (INTERCON. , 1-4 (2018).
  19. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  20. Tchoukalova, Y. D., Hintze, J. M., Hayden, R. E., Lott, D. G. Tracheal decellularization using a combination of chemical, physical and bioreactor methods. The International Journal of Artificial Organs. 41 (2), 100-107 (2017).
  21. Partington, L., et al. Biochemical changes caused by decellularization may compromise mechanical integrity of tracheal scaffolds. Acta Biomaterialia. 9 (2), 5251-5261 (2013).
  22. Balestrini, J. L., et al. Production of decellularized porcine lung scaffolds for use in tissue engineering. Integrative Biology. 7 (12), 1598-1610 (2015).
  23. Taylor, D. A., Sampaio, L. C., Ferdous, Z., Gobin, A. S., Taite, L. J. Decellularized matrices in regenerative medicine. Acta Biomaterialia. 74, 74-89 (2018).
  24. Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).
  25. Huang, S. X. L., et al. The in vitro generation of lung and airway progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 10 (3), 413-425 (2015).
  26. Kim, J., O'Neill, J. D., Dorrello, N. V., Bacchetta, M., Vunjak-Novakovic, G. Targeted delivery of liquid microvolumes into the lung. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11530-11535 (2015).
  27. Kim, J., O'Neill, J. D., Vunjak-Novakovic, G. Rapid retraction of microvolume aqueous plugs traveling in a wettable capillary. Applied Physics Letters. 107 (14), 144101(2015).
  28. O'Neill, J. D., et al. Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering. The Annals of Thoracic Surgery. 96 (3), 1046-1056 (2013).
  29. Sengyoku, H., et al. Sodium hydroxide based non-detergent decellularizing solution for rat lung. Organogenesis. 14 (2), 94-106 (2018).
  30. Walters, M. S., et al. Generation of a human airway epithelium derived basal cell line with multipotent differentiation capacity. Respiratory Research. 14 (1), 135(2013).
  31. O'Neill, J. D., et al. Cross-circulation for extracorporeal support and recovery of the lung. Nature Biomedical Engineering. 1 (3), 0037(2017).
  32. Guenthart, B. A., et al. Regeneration of severely damaged lungs using an interventional cross-circulation platform. Nature Communications. 10 (1), 1985(2019).
  33. Chen, J., et al. Non-destructive vacuum-assisted measurement of lung elastic modulus. Acta Biomaterialia. 131, 370-380 (2021).
  34. Dorrello, N. V., et al. Functional vascularized lung grafts for lung bioengineering. Science Advances. 3 (8), 1700521(2017).

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