Summary
O protocolo descreve um bioreator habilitado para imagem que permite a remoção seletiva do epitélio endógeno da traqueia de rato e distribuição homogênea de células exógenas na superfície do lúmen, seguida pela cultura in vitro de longo prazo da construção do tecido celular.
Abstract
Lesões repetidas no tecido das vias aéreas podem prejudicar a função pulmonar e causar doenças pulmonares crônicas, como doença pulmonar obstrutiva crônica. Os avanços na medicina regenerativa e nas tecnologias bioreaatores oferecem oportunidades para produzir construções de tecidos e órgãos funcionais cultivados em laboratório que podem ser usados para triagem de drogas, doenças modelo e substituição de tecidos de engenheiros. Aqui, um bioreator miniaturizado aliado a uma modalidade de imagem que permite a visualização in situ do lúmen interno da traqueia de rato explantada durante a manipulação e cultura in vitro de tecidos. Utilizando este bioreator, o protocolo demonstra a remoção seletiva guiada por imagens de componentes celulares endógenos, preservando as características bioquímicas intrínsecas e a ultraestrutura da matriz tecidual das vias aéreas. Além disso, a entrega, distribuição uniforme e subsequente cultura prolongada de células exógenas nos lúmen descelularizados das vias aéreas com monitoramento óptico in situ são mostrados. Os resultados destacam que o bioreator guiado por imagem pode potencialmente ser usado para facilitar a geração de tecidos funcionais in vitro das vias aéreas.
Introduction
A superfície luminal do trato respiratório é forrada por uma camada de epitélio que consiste principalmente de células-tronco multi-ciliadas, club, cálice e basal 1,2. A camada epitelial serve como um mecanismo de defesa primária do pulmão, agindo como uma barreira biofísica que protege o tecido subjacente das vias aéreas contra patógenos inalados, partículas ou gases químicos. Protege o tecido das vias aéreas através de múltiplos mecanismos, incluindo formação de junção apertada intercelular, liberação mucociliaria e secreção antimicrobiana e antioxidante 3,4. O epitélio das vias aéreas defeituosas está associado a doenças respiratórias devastadoras, como doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC)5, diskinesia ciliar primária (PCD)6 e fibrose cística (CF)7.
Os avanços na tecnologia lung-on-chip (LOC) representam uma oportunidade para estudar o desenvolvimento pulmonar humano, modelar várias doenças pulmonares e desenvolver novos materiais terapêuticos em ambientes in vitro fortemente regulados. Por exemplo, o epitélio das vias aéreas e o endotélio podem ser cultivados em lados opostos de uma membrana fina e porosa para imitar o gás trocando tecido pulmonar, permitindo modelagem fiel de doenças e testes medicamentosos8. Da mesma forma, modelos de doenças in vitro foram criados para modelar doenças das vias aéreas in vitro, como DPOC9 e fibrose cística10. No entanto, um grande desafio dos dispositivos LOC é recapitular a complexa arquitetura tridimensional (3D) do tecido pulmonar e interações dinâmicas de matriz celular-tecido in vitro11.
Recentemente, foram desenvolvidas metodologias inovadoras de engenharia de tecidos que permitem a manipulação de tecidos pulmonares ex vivo 12. Utilizando essas metodologias, enxertos de tecido alergênico ou xenogênico desnudado podem ser preparados removendo as células endógenas do tecido pulmonar através de tratamentos químicos, físicos e mecânicos13. Além disso, a matriz extracelular de tecido nativo preservada (ECM) nos andaimes pulmonares descelularizados fornecem as pistas estruturais, bioquímicas e biomecânicas para as células implantadas anexarem, proliferarem e diferenciarem14,15.
Aqui, um sistema bioreator guiado por imagem criado pela combinação de tecnologias de engenharia de tecidos e LOC para permitir a manipulação in vitro de tecidos e cultura de tecidos traqueais de ratos explantados é relatado. Utilizando este bioreator de tecido das vias aéreas, o protocolo demonstra a remoção seletiva das células epiteliais endógenas sem interromper os componentes celulares e bioquímicos subjacentes do tecido das vias aéreas. Em seguida, mostramos a distribuição homogênea e a deposição instantânea das células exógenas recém-semeadas, como células-tronco mesenquimais (MSCs), no lúmen das vias aéreas desnudadas, instilando a solução de colágeno i pré-gel carregada por células. Além disso, utilizando o dispositivo de imagem micro-óptica integrado ao bioreator, a visualização do lúmen traqueia durante a remoção do epitélio e a entrega de células endógenas também é feita. Além disso, mostra-se que a traqueia e as células recém-implantadas podem ser cultivadas no bioreator sem morte celular perceptível e degradação tecidual por 4 dias. Prevemos que a plataforma bioreatorial habilitada para imagem, a fina técnica de desetelialização baseada em filmes e o método de entrega de células utilizado neste estudo podem ser úteis para a geração de tecidos das vias aéreas para modelagem de doenças in vitro e triagem de medicamentos.
O bioreator inclui uma câmara retangular conectada a uma bomba de seringa programável, bomba de perfusão e ventilador para cultivar traqueia de rato isolada. O bioreator apresenta entradas e tomadas conectadas à traqueia ou à câmara de cultura tecidual para fornecer separadamente reagentes (por exemplo, mídia cultural) aos espaços internos e externos da traqueia (Figura 1). Um sistema de imagem personalizado pode ser usado para visualizar o interior da traqueia de rato in vitro cultivada no nível celular (Figura 2). O epitélio endógeno da traqueia é removido através da instilação de uma solução de descelularização baseada em detergente, seguida pela lavagem das vias aéreas assistidas por vibração (Figura 3). A solução de hidrogel, como o colágeno tipo I, é usada como veículo de entrega para semear células exógenas uniformemente e instantaneamente através do lúmen traqueia desnudado (Figura 4). Todos os materiais utilizados para a construção do bioreator e a realização dos experimentos são fornecidos na Tabela de Materiais.
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Protocol
O protocolo de tecido animal abaixo foi aprovado pela diretriz de bem-estar animal e regulamentos do Comitê de Uso e Cuidado animal (IACUC) do Instituto de Tecnologia Stevens, e cumpre as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) para o uso de animais experimentais.
1. Projeto e construção de bioreator de traqueia de rato guiado por imagem
- Projeto e fabricação de bioreator de traqueia de rato
- Crie um modelo de projeto (CAD) auxiliado por computador da câmara bioreatorial com design relevante, como entradas, tomadas e câmara de cultura de tecidos, usando software gerador CAD. Para este estudo, utilize a geometria e as dimensões apresentadas na Figura 1A-C. O tutorial do software do gerador CAD pode ser encontrado em16,17.
- Exporte o modelo CAD gerado para um software controlador de controle numérico de computador (CNC) e corte o plástico politetrafluoroetileno (PTFE) usando uma máquina CNC para criar a câmara bioreatorial. O tutorial do software controlador CNC pode ser encontrado em18.
NOTA: Além do PTFE, outros materiais plásticos, como polietileno de peso molecular ultra-alto (UHMWPE) e polieterimida podem ser usados para fabricar a câmara de cultura. - Esterilize todos os componentes bioreatores, como adaptadores e parafusos Luer, para evitar a contaminação dos tecidos e células cultivadas no dispositivo. Monte todos os componentes bioreatores para a câmara principal de cultura tecidual em um ambiente limpo (Figura 1A).
- Construção de dispositivo de imagem baseado em lentes baseada em índice de gradiente (GRIN)
- Para criar o dispositivo de imagem in situ , insira uma lente de tubo em um tubo de lente empilhável e fixe-a usando um anel de retenção. Monte o conjunto do tubo de lente em uma câmera CMOS científica através de um adaptador de montagem C.
- Use software, como o Micro-Manager, para operar a câmera e adquirir fotos e vídeos. Aime um objeto localizado a uma longa distância (por exemplo, 10 m da câmera) e ajuste a distância entre a lente do tubo e o sensor de imagem da câmera até que uma imagem focada do objeto seja formada na tela do computador pelo software de imagem que está sendo usado.
- Monte uma lente de filtro em um espelho dirímico de dupla resolução de super resolução e um laser para o dispositivo usando componentes do sistema de gaiola óptica, incluindo haste de montagem, placa de gaiola roscada e cubo de gaiola.
- Conecte a lente objetiva (20x) ao dispositivo. Monte uma lente GRIN (diâmetro = 500 μm) na extremidade distal do tubo da lente através do tradutor XY. Ajuste a distância entre a lente GRIN e a lente objetiva para formar imagens microscópicas focadas (Figura 2A,B).
2. Isolamento da traqueia de rato
- Higienize a área cirúrgica e esterilize os instrumentos cirúrgicos utilizando uma autoclave a 121 °C por 30 minutos antes da cirurgia.
- Coloque um rato na câmara de indução e entregue 2,5% de isoflurane por 15 minutos usando um pequeno vaporizador para anestesiar o animal. Avalie a profundidade da anestesia pelo reflexo do pedal. Para isso, belisque firmemente o dedo do pé e confirme que o animal não responde ao aperto do dedo do pé.
- Após a anestesia, remova o isoflurane da câmara e administre 1 mL de heparina de 1.000 unidades/mL através da veia traseira lateral para evitar a coagulação sanguínea na vasculatura pulmonar.
- Para eutanásia do animal, exponha o animal a 5% de isoflurano por mais 15-20 min. Retire o animal da câmara de indução e coloque-o na placa cirúrgica em uma posição supina face-up.
- Fixar o rato na placa cirúrgica imobilizando as pernas e a cauda usando fita adesiva. Em seguida, esterilize as regiões do pescoço e do peito do rato usando 70% de álcool isopropílico (IPA). Abra a cavidade abdominal fazendo uma incisão de 3-4 cm usando uma tesoura na pele.
NOTA: Tenha cuidado para não cortar profundamente a pele apontando as pontas da tesoura para cima. - Transecte a veia cava inferior (IVC) usando a tesoura e confirme a eutanásia por exsanguinação.
- Realize a traqueotomia fazendo uma incisão usando uma tesoura na linha média do pescoço e expondo a traqueia. Realize a toracotomia média fazendo uma incisão na parede do peito e cortando entre as costelas para alcançar a extremidade da traqueia conectada ao pulmão. Em seguida, use um bíceps e uma tesoura para cortar as duas extremidades da traqueia e isolar a traqueia.
- Após o isolamento, enxágue a traqueia usando 20 mL de soro fisiológico tamponado de fosfato de 1x (1x PBS). Transfira a traqueia para o bioreator usando bíceps esterilizados. Fixar as duas extremidades da traqueia no conector Luer usando uma rosca de sutura 4-0.
- Entregue 5 mL de cultura média à câmara bioreatorial utilizando a bomba de seringa programável através da tubulação conectada à câmara bioreatorial a uma vazão de 5 mL/min.
NOTA: O meio de cultura é composto pelo meio modificado da Águia (DMEM) modificado de Dulbecco, fgf-básico humano recombinante (0,1 ng/mL), soro bovino fetal (FBS, 10%) e antibiótico-antimícotico (1%). - Feche bem a tampa do bioreator com a tampa de plástico acrílico e parafusos. Feche as conexões de tubos de câmara bioreatorial com os plugues Luer masculino/feminino para evitar o fluxo do meio de cultura na tubulação.
3. Remoção guiada por imagem do epitélio traqueia
- Para visualizar o lúmen traqueia em campo brilhante ou fluorescente, coloque o bioreator no estágio de imagem (Figura 3A).
- Prepare a solução de ér de carboxyfluorescein succinimidyl (CFSE) (concentração: 100 μM) no kit de rotulagem celular CFSE diluindo a solução CFSE com 1x PBS.
NOTA: A concentração da solução CFSE original é de 10 mM (em sulfóxido de dimetil (DMSO). - Infundir 500 μL da solução CFSE através da traqueia através da bomba de seringa através da tubulação conectada à cânula da traqueia a uma vazão de 5 mL/min. Pare a bomba quando a solução CFSE encher a traqueia. Aguarde 10 min, e depois lave o lúmen traqueia por infusão de 10 mL de 1x PBS usando a bomba de seringa para remover o reagente CFSE não incorporado residual.
- Insira a extremidade de imagem distal da lente GRIN na traqueia através do conector Luer preso a uma extremidade da traqueia. Em seguida, mova suavemente a lente GRIN dentro da traqueia até que a superfície da traqueia esteja focada e tire fotos e vídeos em campo brilhante ou fluorescência em ampliação de 20x.
- Para capturar imagens de campo brilhante no software Micro-Manager, siga os passos abaixo.
- Introduza a luz branca através do cubo da gaiola para iluminar o lúmen traqueia. Clique no ícone Live para mostrar a superfície luminal da traqueia em tempo real. Use a configuração de imagem > Exposição (ms) para alterar o tempo de exposição ao valor desejado. Neste estudo, o tempo de exposição utilizado foi na faixa de 10 ms e 50 ms.
- Para ajustar o contraste e o brilho das imagens, use a janela de dimensionamento histograma e intensidade para mover setas pretas e brancas no ponto final do display de histograma interativo. Alternativamente, use a opção Auto Stretch que permite ao software ajustar o brilho e o contraste automaticamente para níveis ideais.
- Clique no ícone 'Encaixar ' para congelar a imagem. Em seguida, use Configuração > Exportar Imagens como Deslocadas para salvar as imagens no formato desejado. Alternativamente, use Configuração > ImageJ para exportar diretamente a imagem para o software ImageJ e salvá-la.
- Para obter fotos e vídeos no modo fluorescente, ilumine o lumen da traqueia com luz laser específica cfse (CFSE: comprimento de onda de excitação: 488 nm, comprimento de onda de emissão: 515 nm) através do cubo da gaiola. Siga os passos 3.5.2-3.5.3 para adquirir as imagens. Depois de tirar fotos e vídeos, remova suavemente a lente GRIN da traqueia.
- Realize a desetelialização conforme descrito abaixo.
- Prepare 2% de sulfato de dodecyl de sódio (SDS) solução de descelularização em água destilada (DI). Incutir 50 μL de SDS através da traqueia a uma vazão de 6,3 mL/min, usando a bomba de seringa através da cânula da traqueia para gerar um filme fino da solução detergente no lúmen traqueia.
- Feche as conexões de tubo do bioreator usando plugues Luer masculino/feminino e transfira o bioreator para uma incubadora. Deixe o SDS habitar dentro da traqueia por 10 min a 37 °C. Incutir mais 50 μL de solução SDS através da traqueia e incubar por 10 min.
- Remova o epitélio e o SDS irrigando o lúmen traquea com 500 μL de 1x PBS via bomba de seringa a uma vazão de 10 mL/min por 3x. Coloque o bioreator em um agitador e vibre mecanicamente o bioreator a 20 Hz de frequência e amplitude de deslocamento de aproximadamente 0,3 mm para promover fisicamente o descolamento das células epiteliais tratadas com SDS do lúmen traqueia.
NOTA: Neste estudo, o shaker foi feito sob medida pela montagem de um alto-falante subwoofer, um amplificador de placa de subwoofer e um acelerômetro. Uma forma de onda sinusoidal foi gerada por um computador e alimentada no agitador através do amplificador, enquanto a resposta do agitador foi monitorada através do acelerômetro (Figura 3B). Além disso, shakers convencionais, como shakers eletromagnéticos e inércias, podem ser usados para promover o descolamento das células. Para isso, defina a frequência e aceleração do agitador para 20 Hz e 0,5 g, respectivamente (equivalente a amplitude de deslocamento de 0,3 mm). - Incutir 500 μL de 1x PBS duas vezes através do lúmen traqueia para remover SDS residuais e detritos celulares enquanto a traqueia é mecanicamente vibrada. Seguindo o procedimento de remoção do epitélio, avalie a liberação da camada epitelial medindo a intensidade do CFSE utilizando o dispositivo de imagem da lente GRIN como na etapa 3.6 (Figura 3C).
4. Preparação do tecido traqueia para novas análises
- Para confirmar a remoção do epitélio, realize novas análises teciduais, como a coloração de hematoxilina e eosina (H&E), tricromo, pentachrome e imunostaining. Para isso, remova a traqueia do bioreator e fixe-a em 30 mL de solução de paraformaldeído tamponado de 4% em 1x PBS (pH = 7,4) a 4 °C durante a noite.
- Desidrate e incorpore o tecido fixo da traqueia seguindo os passos abaixo.
- Após a fixação, lave o tecido traqueia com 10 mL de 1x PBS, transfira a traqueia para 30 mL de 70% de álcool e mantenha-a a 4 °C durante a noite. Corte a traqueia em pequenas seções cilíndricas (~5 mm) usando uma lâmina afiada e insira as seções teciduais no tecido incorporando fitas (comprimento x largura x altura: 4 cm x 2,5 cm x 0,5 cm). Mantenha duas seções de traqueia em cada.
- Desidratar as seções em uma série de soluções de álcool isopropílico (IPA) - 85%, 90%, 95%, 100% - por 1 h em 30 mL de cada solução. Remova a solução anterior antes de adicionar a próxima solução.
- Após a conclusão, submergir as fitas em 30 mL de agente de compensação (por exemplo, xileno) por 2h para deslocar a solução IPA das seções teciduais completamente. Realize esta etapa em um capô de fumaça com ventilação adequada.
- Submerque as fitas em parafina por 2h, e depois incorpore-as em parafina a 4 °C durante a noite. Em seguida, corte os tecidos embutidos na parafina em seções finas (5-8 μm) usando um dispositivo de microtome para h&E, tricromo, pentatro e imunostaining.
- Para preparar os tecidos para a análise de microscopia eletrônica de varredura (SEM), fixe a traqueia em 30 mL de solução de glutaraldeído de 2,5% em 1x PBS (pH = 7,4) a 4 °C durante a noite. Em seguida, desidrate o tecido de traqueia fixa para SEM seguindo as etapas abaixo.
- Após a fixação, enxágue o tecido traqueia com 10 mL de 1x PBS. Corte o tecido traqueia longitudinalmente em pequenas seções de semi-cilindro (comprimento: ~5 mm) usando uma tesoura e insira as seções teciduais nas fitas.
- Desidratar as seções em uma série de soluções de IPA - 35%, 50%, 70%, 85%, 95% e 100% - por 10 min em 30 mL de cada solução. Remova a solução anterior antes de adicionar a próxima solução.
- Realizar o método de secagem baseado em hexaametila (HMDS) submergindo os tecidos nas seguintes soluções: 100% IPA: HMDS (2:1; v/v) por 10 min, seguido por 100% IPA: HMDS (1:2; v/v) por 10 min, e finalmente 100% HMDS para durante a noite.
NOTA: O HMDS é tóxico. Trabalhe sob um capô de fumaça durante todos os passos de secagem. - Remova os tecidos da solução HMDS e deixe-os secar sob a capa de fumaça por 1h. Monte a seção em pinos de alumínio usando uma fita condutora de carbono de dois lados ou pasta condutora de prata para imagens SEM.
5. Distribuição homogênea de células exógenas no lúmen traqueal desnudado
- Prepare uma traqueia de rato desetelializada usando o protocolo na etapa 3. Descongele células-tronco mesenquimais congeladas (MSCs) para 30 s em um banho de água de 37 °C.
NOTA: Neste estudo, usamos células-tronco mesenquimais (MSCs) como célula modelo para mostrar a distribuição de células exógenas na traqueia des epitelializada. Idealmente, células epiteliais das vias aéreas primárias, células basais ou células pluripotentes induzidas (iPSCs) podem ser usadas para fins de regeneração de epitélio. - Conte as células com um hemótmetro e prepare uma solução celular com uma concentração de 5 x 106 células/mL. Rotule as células fluorescente incubando as células com 2 mL de solução CFSE (concentração: 100 μM) à temperatura ambiente por 15 minutos. Enxágüe as células com 5 mL de 1x PBS por 3x e resuspenque as células em meio de cultura fresca em uma concentração final de 3 x 107 células/mL.
- Prepare a solução de pré-gel de hidrogel como um veículo para entrega de células. Para este estudo, use o colágeno I como veículo de entrega para células MSCs e siga as instruções do fabricante para preparar o pré-gel. Por exemplo, para obter 3,6 mg/mL de pré-gel de colágeno, misture uma parte da solução de neutralização resfriada com nove partes do colágeno da cauda de rato em um tubo estéril de 1,5 mL. Em seguida, encobre suavemente a mistura para cima e para baixo para uma mistura adequada.
NOTA: Outros hidrogéis biocompatíveis podem ser usados em vez de colágeno I de acordo com o estudo e as necessidades do usuário. - Uma vez que a solução de hidrogel esteja preparada, adicione as células rapidamente à solução com concentração desejada (por exemplo, 5 x 106 células/mL). Para obter uma mistura uniforme de hidrogel celular, misture as células e a solução de gel, tubos suavemente com uma micropipette.
- Conecte uma extremidade da traqueia dentro do bioreator a uma bomba de seringa programável através de um conector Luer. Entregue 5 mL de cultura fresca a 37 °C na câmara bioreatorial para cobrir a superfície externa da traqueia usando a bomba de seringa a uma taxa de fluxo de 5 mL/min.
- Administre um bolus de 10 μL da mistura de hidrogel celular na traqueia desetelializada dentro do bioreator usando a bomba de seringa a uma vazão de 5 mL/min para gerar uma camada de hidrogel celular no lúmen traqueia (Figura 4).
- Após a injeção celular, coloque o bioreator em uma incubadora de cultura celular estéril a 37 °C e 5% de CO2 para gelação. Para o colágeno I, a gelação ocorre em 30 minutos.
- Para visualizar a distribuição das células implantadas, esterilize a lente GRIN limpando com 70% de IPA ou etanol e coloque o bioreator no estágio de imagem. Tire fotos e vídeos nos modos de campo brilhante e fluorescente, conforme necessário.
- Após 30 minutos de semeadura celular, infunda 1 mL de meio de cultura no lúmen da traqueia usando uma bomba de seringa a uma taxa de fluxo de 1 mL/min.
- Cultura a traqueia semeada por células dentro do bioreator em uma incubadora a 37 °C para o tempo desejado. Para a cultura de longo prazo, refresque o meio cultural no lúmen traqueia e na câmara bioreator a cada 24 horas. Durante a cultura celular, mantenha a mídia dentro do lúmen estático e mude-a a cada 24 horas, enquanto a mídia fora da traqueia é continuamente perfundida através de um fluxo unidirecional a 5 mL/min.
- Após a cultura das células por um determinado período de tempo (por exemplo, 1 e 4 dias neste estudo), remova a traqueia do bioreator. Use a tesoura para cortar a traqueia longitudinalmente em duas seções semi-cilindros (ou seja, seções superiores e inferiores) nos dias 1 e 4 da cultura in vitro para expor as superfícies internas para monitorar o crescimento celular e calcular a densidade celular. Use um microscópio fluorescente convencional para visualizar as células nas superfícies internas.
- Para adquirir as imagens usando o software Micro-Manager, siga as etapas 3.5 e 3.6. Use um filtro de isothiocianato de fluoresceína (FITC) para visualizar as células rotuladas por CFSE no modo fluorescência. Analise as imagens tiradas pelo microscópio fluorescente e calcule as densidades celulares em seções superiores e inferiores usando o software ImageJ. Para calcular o número de células e a densidade celular, siga os passos abaixo.
- Abra uma imagem no software ImageJ e converta a imagem em uma imagem binária (16 bits) usando > de imagem Tipo > 16 bits. Defina a escala de imagem com a barra de escala usando Analisar > Escala definida.
- Ajuste o limiar da imagem para destacar as estruturas das células para contar. Use > de imagem Ajuste > limiar. Use Analisar > Analisar partículas para contar o número das células. Calcule a densidade das células dividindo o número de células pela área superficial da imagem.
- Para avaliar a viabilidade após a semeadura celular, use um kit de viabilidade celular. Para este estudo, incubar o tecido traqueia e as células do bioreator a 37 °C por 6h e manchar as células com 4 mM de calcein-AM e 2 mM de ethidium homodimer-1 em 1 mL de 1x PBS à temperatura ambiente por 15 min.
- Depois de enxaguar com 1x PBS, visualize as células usando um microscópio fluorescente. Conte as células vivas e mortas usando os passos descritos na etapa 5.12. Calcular a viabilidade celular como a porcentagem de células vivas (manchadas com calceíno-AM) por células totais (células vivas e mortas).
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Representative Results
A modalidade de imagem in situ baseada em lentes GRIN pode permitir a visualização do lúmen interno traqueal in situ (Figura 5A). Utilizando este método de imagem, podem ser obtidas imagens de campo brilhante e fluorescentes das traqueias nativas e deselegelializadas (Figura 5B,C). Não foi observado sinal fluorescente da traqueia nativa antes da rotulagem CFSE (Figura 5Bii). No entanto, quando o epitélio traqueal foi rotulado com corante CFSE, um sinal fluorescente uniforme (verde) foi observado em todo o epitélio (Figura 5Ci). Após a desetelialização via SDS e irrigação das vias aéreas assistidas por vibração, a intensidade do sinal fluorescente foi diminuída significativamente (Figura 5Cii), indicando ablação do epitélio.
As imagens de H&E da traqueia desetelializada mostraram a remoção do epitélio pseudoestratificado do lúmen da traqueia e preservação das células e da microestrutura de ECM em camadas de tecido subjacente (Figura 6A). Além disso, pentachrome (Figura 6B) e coloração tricrômica (Figura 6C) confirmaram a manutenção da arquitetura de tecido traqueia e dos componentes ECM, como colágeno e protelycans de colog. Além disso, a imunofluorescência das células epiteliais (molécula de adesão celular epitelial, EpCAM; Figura 6D) e colágeno I (Figura 6E) revelaram a remoção completa do epitélio e preservação do colágeno I dentro do tecido subepitelial. A imagem SEM da traqueia nativa mostrou que a superfície luminal da traqueia de ratos nativos era povoada principalmente com células multi-ciliadas e células de cálice. Por outro lado, imagens SEM de lumen de traqueia des epitelializada mostraram que a membrana do porão foi exposta como indicado por uma rede de malha de fibras ECM e a ausência de células epiteliais (Figura 6F).
Usando traqueias desetelializadas e células fluorescentes rotuladas, investigamos se a incorporação de um hidrogel como veículo de entrega de células poderia alcançar a distribuição celular homogênea no lúmen traqueal des epitelializado (Figura 7A,B). Neste estudo, as células-tronco mesenquimais (MSCs) foram utilizadas como células-modelo para o estudo de entrega de células e cultura. Como descrito no protocolo (etapa 5), instilamos colágeno carregado de MSC I pré-gel em uma traqueia de rato deselítilizada e monitoramos a distribuição das células no lúmen traqueal usando o sistema de imagem de lentes GRIN. Como experimento de controle, suspendemos os MSCs no meio da cultura, infundimos o meio de cultura carregado de células na traqueia e inspecionamos visualmente a distribuição das células. Os resultados de imagens in situ mostraram que as células fluorescentes rotuladas através de hidrogel permaneceram aderidas mais uniformemente em todo o lúmen do que aquelas semeadas via meio de cultura (Figura 7B). Testamos então a viabilidade da célula antes e depois da entrega do celular para avaliar possíveis danos celulares e morte devido ao estresse de shearing durante a infusão celular. O resultado mostrou que a viabilidade celular não foi significativamente afetada pelo procedimento de entrega de células, pois mais de 90% das células permaneceram viáveis (Figura 7C).
Além disso, nós cultivaram as traqueias semeadas por células por 4 dias. As células semeadas através do colágeno e do meio de cultura (controle) proliferaram na superfície de lúmen traqueializada deselíquelizada, como indicado pelo aumento do número de células expressando CFSE ao longo do tempo, tanto na metade superior quanto na inferior do lúmen traqueial (Figura 7D). Notavelmente, no grupo de entrega de hidrogel de colágeno, a diferença na densidade das células entre lúmens superior e inferior foi menor do que a do grupo controle, indicando que a entrega de células via hidrogel promove a distribuição de células homogêneas em todo o lúmen da traqueia.
Figura 1: Desenho do computador tridimensional (3D) do bioreator da traqueia. (A) (i) visão lateral, (ii) visão superior. (B) As dimensões da câmara bioreatorial. (C) Uma folha de plástico acrílico transparente é cortada e presa à parte superior da câmara principal usando parafusos. Unidade = mm; R = raio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagens de microfisa personalizadas para visualização in situ da traqueia de rato. (A) (i) Esquema dos componentes de configuração de imagem do caminho da luz. Abreviaturas: C = câmera, TL = lente do tubo, F = filtro, DM = espelho dicroico, OL = lente objetiva; (ii) a fotografia dos componentes de configuração de imagem que mostram a sonda de imagem (lente GRIN) está inserida no conector Luer do bioreator. (B) Esquema mostrando que a lente GRIN está integrada com o bioreator. (C) Uma fotografia mostrando a sonda de imagem é usada para visualizar a traqueia dentro do bioreator. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: A plataforma de desepilação da traqueia de ratos. (A) Fotografia mostrando a configuração experimental para desepilelialização e em imagens de fibra óptica in situ . (B) Diagrama mostrando o componente e a montagem do agitador eletromagnético personalizado utilizado para facilitar a remoção do epitélio. ω: frequência, a: amplitude (C) Esquemático mostrando o fluxo de trabalho do procedimento de desetelia da traqueia de rato. PBS = soro fisiológico tamponado com fosfato. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Entrega de células exógenas em traqueia de rato des epitelializada usando hidrogel. Schematic mostrando solução de hidrogel usada como veículo de entrega para depositar topicamente as células no lúmen interno da traqueia de rato desetelizada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Em situ imagem de traqueia des epitelializada. (A) Fotografia mostrando imagens fluorescentes do lúmen traqueia enquanto o epitélio rotulado cfse é animado com laser azul de 488 nm através da lente GRIN. (B) (i) Imagens de campo brilhante e (ii) fluorescência do lúmen traqueia antes da rotulagem de epitélio. (C) Imagens de fluorescência da (i) traqueia desetelializada (Traquea De-Epi) enquanto o epitélio é rotulado com corante fluorescente CFSE. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Histologia, imunofluorescência e ANÁLISES SEM de traqueias de ratos nativas e desetelializadas. (A) Mancha H&E. (B) Mancha pentatroma onde roxo é citoplasma celular, azul é núcleos celulares, verde é proteoglycans (por exemplo, mucina), e amarelo é fibras de colágeno. (C) Coloração tricromática onde rosa é citoplasma celular, azul escuro é núcleos celulares, e azul é colágeno. Imagens de fluorescência de traqueias nativas e desetelializadas. (D) EpCAM e (E) colágeno I. Arrowheads mostram a superfície do lúmen traqueia. (F) Micrografos SEM do lúmen traqueia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Deposição tópica dos MSCs exógenos no lúmen traqueia. (A) (i) Campo brilhante e (ii) imagens de fluorescência da traqueia desetelializada. (B) Imagens fluorescentes do lúmen traqueia des epitelializado quando é semeado com (i) PBS e (ii) colágeno I pré-gel. A distribuição homogênea das células no lúmen traqueia é alcançada quando o colágeno pré-gel é usado como um veículo de entrega para células. (C) (i) Imagens fluorescentes e (ii) viabilidade quantificada das células antes e depois de 6h de entrega por colágeno pré-gel. n: número de amostras. Foram seguidas as etapas 5.1 e 5.17 do protocolo para avaliar a viabilidade das células. (D) Densidade de semeadura celular medida após (i) 1 dia e (ii) 4 dias após a semeadura e cultura das células. A densidade celular foi calculada dividindo os números celulares pela área de superfície examinada. Todos os valores representam ± desvio padrão. A análise unidirecional de variância (ANOVA) foi utilizada para determinar diferenças estatisticamente significativas entre os grupos, sendo que p < 0,05 considerado significativo. Abreviaturas: CM = cultura média, C = colágeno. *p < 0,05. **p < 0,01. ns: não significativo. Nenhuma diferença significativa (ns) entre superfícies superiores e inferiores significa distribuição de células uniformes através da circunferência da traqueia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste trabalho, criamos um bioreator guiado por imagem que pode permitir (i) o monitoramento do lúmen traqueia in situ após a remoção celular e a entrega de células exógenas e (ii) cultura in vitro de longo prazo do tecido traqueia semeado por células. Usando este bioreator personalizado, demonstramos (i) remoção seletiva das células epiteliais endógenas do lúmen traqueia usando detergente e lavagem de vias aéreas assistidas por vibração e (ii) distribuição uniforme de células exógenas na superfície luminosa da traqueia desnudada usando colágeno I pré-gel carregado por células. Além disso, a modalidade de imagem baseada em lentes GRIN confirmou a remoção do epitélio in situ. Além disso, com outras análises, incluindo H&E, tricromo, pentachrome, coloração de imunofluorescência e SEM, confirmamos a remoção do epitélio e manutenção da arquitetura e componentes das camadas de tecido subjacentes. Além disso, a imagem baseada em lentes GRIN de MSCs exógenos recém-implantados mostrou a distribuição uniforme das células quando o pré-gel de colágeno I foi usado como veículo de entrega. Por fim, as células implantadas sobreviveram e proliferaram na traqueia desetelializada, destacando a eficácia do bioreator na cultura de longo prazo dos tecidos das vias aéreas semeadas por células.
O passo crítico no protocolo de desepilação é criar uma fina camada de solução de detergente no lúmen da traqueia. Nos protocolos atuais de descelularização, múltiplos ciclos de produtos químicos e enzimas estão sendo utilizados por um longo período, reduzindo o número de fibras de colágeno, glicosaminoglicanos (GAGs), proteoglicanos e condrócitos, comprometendo as propriedades biológicas e biomecânicas do andaime das vias aéreas 19,20,21. Por outro lado, o ECM fornece sinais bioquímicos e mecânicos e ambientes físicos adequados para sobrevivência, proliferação e diferenciação de células exógenas implantadas22,23. O método de deposição de filme fino descrito neste estudo utiliza uma pequena quantidade de detergente (menos de 50 μL) para a ablação do epitélio, permitindo a preservação da camada tecidual subjacente e componentes celulares subepitelios. A vibração mecânica do tecido exposto ao detergente demonstrado neste estudo é um procedimento importante, pois permite o descolamento e o desembaraço das células líssedas. Os detritos celulares e células parcialmente rompidas resultantes da exposição do epitélio ao detergente são desafiadores para serem lavados apenas inundando a traqueia com a solução de lavagem. Portanto, vibrar mecanicamente a traqueia durante a lavagem fornece forças suficientes para limpar os detritos celulares do lúmen traqueal.
Em geral, a abordagem de semeadura celular pré-gel pode ser influenciada pela velocidade de entrega, pela viscosidade do pré-gel (que está diretamente relacionado com a concentração pré-gel), tensão superficial e tempo de gelação. Em particular, durante a preparação pré-gel, é essencial manter a concentração pré-gel baixa o suficiente para transportar o pré-gel suspenso por células na tubulação e alto o suficiente para manter as células na superfície superior da traqueia. Portanto, é fortemente recomendável encontrar a concentração ideal para cada pré-gel, testando várias concentrações. Além disso, pratique a técnica de entrega, como a velocidade de entrega com células menos preciosas para garantir a entrega bem sucedida do pré-gel carregado por células. Além disso, enquanto usamos MSCs como modelo celular para demonstrar (i) a distribuição das células com pré-gel como veículo de entrega e (ii) a capacidade do sistema bioreator para a cultura das células recém-semeadas em lumen desnudado, o uso de células-tronco (por exemplo, células basais) e células epiteliais das vias aéreas primárias em estudos futuros poderia permitir estudar a diferenciação celular e a regeneração celular epitelial funcional24, Dia 25. Além disso, estudos futuros podem incluir a adição de uma interface ar-líquido (ALI) à plataforma atual para gerar estresse de tesoura in vivo em células semeadas para a geração de epitélio funcional. Para adicionar ALI ao dispositivo atual, um pequeno ventilador animal pode ser conectado à entrada da traqueia para ventilar a traqueia. Além disso, para alcançar o ALI, o método de deposição de filme fino pode ser utilizado para incutir um plug líquido médio de cultura na traqueia semeada por células. A espessura da película líquida pode ser modulada alterando a velocidade do plugue líquido26,27. O plugue pode ser iniciado depois que as células recém-semeadas aderem e engrafam firmemente no lúmen da traqueia.
Além disso, a abordagem de imagem baseada em lentes grin in situ usada neste protocolo é fundamental para confirmar a eficácia da desetelialização e avaliar a qualidade da distribuição de células recém-semeadas. Ao contrário dos métodos convencionais de análise de tecidos, como histologia e imunofluorescência, que requerem dissecação das amostras do tecido traqueia para análise, a plataforma de imagem desenvolvida em nosso estudo permite o monitoramento rápido e não destrutivo do lúmen das vias aéreas durante a desequipilação e a entrega celular. Para manter a traqueia esterilizada durante a imagem in situ , certifique-se de esterilizar a lente GRIN limpando-a com 70% de IPA ou etanol antes de introduzi-la no lúmen traqueia. Além disso, para imaginar as células usando a lente GRIN, as células (ou células epiteliais traqueais endógenas ou células recém-implantadas) podem ser rotuladas com vários corantes fluorescentes com diferentes comprimentos de onda de excitação/emissão. Para isso, certifique-se de usar o gerador de luz laser apropriado para excitar as células fluorescentes rotuladas e integrar as lentes do filtro direito ao espelho dicrómico de dupla resolução.
Apesar da novidade e da inovação da dese epitelialização, da entrega celular e dos métodos de imagem in situ , este estudo tem várias limitações. Os métodos de desepilação e de entrega celular descritos neste estudo são aplicáveis a pequenas vias aéreas (diâmetro: menos de 3-4 mm) onde a tensão superficial é dominante. Formar um plugue líquido e criar um filme fino da solução de desetelialização ou suspensão pré-gel carregada por células em vias aéreas maiores, como suínos e traqueia humana, ou brônquios, pode ser desafiador à medida que a tensão superficial se torna insignificante em comparação com outras forças, gravidade em particular. Além disso, usando a abordagem de deposição de filme fino e modulando o tempo e a concentração, fomos capazes de abltoar o epitélio com um detergente forte (SDS) e preservar a camada de tecido subjacente. Em estudos futuros, no entanto, detergentes descelularização mais leves, como 3-[3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propanosulfonato (CHAPS)28, ou solução não detergente, como hidróxido de sódio (NaOH)29, podem ser testados para a preservação de componentes ECM e suporte de células recém-implantadas. Além disso, a intensidade da fluorescência das células rotuladas por CFSE reduz ao longo do tempo devido à divisão das células. Em nosso estudo, as imagens fluorescentes de MSCs cultivadas nas traqueias deseteliadas durante 4 dias mostraram uma diminuição substancial em sua intensidade de fluorescência. Para o monitoramento prolongado e o rastreamento de células exógenas semeadas nos andaimes teciduais, diferentes métodos de rotulagem celular que possam permitir a rotulagem fluorescente de longo prazo ou permanente das células seriam necessários.
Prevemos que a plataforma bioreatorial guiada por imagens e os protocolos de remoção e entrega de células descritos neste relatório podem permitir a criação de andaimes de tecido desetelializado das vias aéreas que podem ser usados para gerar os tecidos das vias aéreas bioengenharia. Tais vias aéreas in vitro podem oferecer alta fidelidade na modelagem in vitro de doenças das vias aéreas humanas e rastreamento de medicamentos. Por exemplo, para estabelecer epitélio funcional das vias aéreas, as células-tronco basais das vias aéreas podem ser implantadas primeiro no tecido das vias aéreas desetelializadas30. Em seguida, a interface ar-líquido (ALI), que é fundamental para a diferenciação das células-tronco basais em várias células epiteliais, pode ser gerada dentro da traqueia. Além disso, o sistema de imagem in situ pode ser modificado e usado para visualizar fluorescentemente o trato respiratório de pacientes com distúrbios das vias aéreas pulmonares. Para ser usada clinicamente para avaliar os tecidos das vias aéreas in situ, a lente RÍGIDA GRIN pode ser substituída por sondas flexíveis de imagem de fibra óptica para navegar pelas vias aéreas. Além disso, a capacidade de distribuir homogeneamente as células dentro do trato respiratório usando semeadura celular à base de hidrogel pode fornecer uma oportunidade sem precedentes para substituir o epitélio danificado ou ferido em pacientes. Em particular, a abordagem de substituição celular desenvolvida e utilizada neste estudo pode acelerar o tratamento baseado em células para o tratamento de doenças respiratórias, como fibrose cística e diskinesia ciliar primária, e reparar pulmões doadores que são recusados para transplante devido a tecidos de vias aéreas gravemente feridos 31,32,33,34.
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Disclosures
Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada em parte pelo American Toacic Society Foundation Research Program, pela New Jersey Health Foundation e pela National Science Foundation (CAREER Award 2143620) para J.K.; e os Institutos Nacionais de Saúde (P41 EB027062) para G.V.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1× PBS | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10-010-031 | |
| 3-port connector | World Precision Instruments | 14048-20 | |
| 4-port connector | World Precision Instruments | 14047-10 | |
| Accelerometer | STMicroelectronics | IIS3DWBTR | |
| Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-150-A-ML | |
| Aluminum pin stub | TED PELLA | 16111 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Assembly rod | Thorlabs | ER1 | |
| Button head screws | McMaster-Carr | 91255A274 | |
| Cage cube | Thorlabs | C4W | |
| Carbon double-sided conductive tape | TED PELLA | 16073 | |
| CFSE labelling kit | Abcam | ab113853 | |
| Citrisolv (clearing agent) | Decon | 1061 | |
| C-mount adapter | Thorlabs | SM1A9 | |
| Collagen I | Advanced BioMatrix | 5153 | |
| Conductive liquid silver paint | TED PELLA | 16034 | |
| Dichroic mirror | Semrock | DI03-R488 | Reflected laser wavelengths: 473.0 +- 2 nm 488.0 +3/-2 nm |
| Dulbecco's modified Eagle’s medium | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11965118 | |
| Female luer bulkhead to hose barb adapter | Cole-Parmer | EW-45501-30 | |
| Female luer to tubing barb | Cole-Parmer | EW-45508-03 | |
| Female to male luer connector | Cole-Parmer | ZY-45508-80 | |
| Fetal bovine serum | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| Filter lens | Chroma Technology Corp | ET535/50m | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Eclipse E1000 - D | |
| Fusion 360 | Autodesk | ||
| Hex nut | McMaster-Carr | 91813A160 | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Fisher Scientifc | AC120585000 | |
| Imaging fiber | SELFOC, NSG group | GRIN lens | |
| Laser | Opto Engine | MDL-D-488-150mW | |
| Lens tubes | Thorlabs | SM1L40 | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | L3224 | |
| MACH 3 CNC Control Software | Newfangled Solutions | ||
| Objective lens | Olympus | UCPLFLN20X | |
| Peristaltic Pump | Cole Parmer | L/S standard digital pump system | |
| Recombinant human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Retaining ring | Thorlabs | SM1RR | |
| Scientific CMOS camera | PCO Panda | PCO Panda 4.2 | |
| Sodium dodecyl sulfate | VWR | 97064-472 | |
| Solidworks (2019) | Dassault Systèmes | ||
| Stackable lens tube | Thorlabs | SM1L10 | |
| Subwoofer plate amplifier | Dayton Audio | SPA250DSP | |
| Subwoofer speaker | Dayton Audio | RSS21OHO-4 | Diaphragm diameter: 21 cm |
| Syringe Pump | World Precision Instruments | AL-4000 | |
| Threaded cage plate | Thorlabs | CP33 | |
| Threaded luer adapter | Cole-Parmer | EW-45513-81 | |
| Tube lens | Thorlabs | AC254-150-A-ML | |
| Tygon Tubing | Cole-Parmer | 13-200-110 | |
| XY Translator | Thorlabs | CXY1 |
References
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